P53CaspasiBcl2 familyIAP familyDeath Receptors

Le molecole chiave dell’apoptosi

nei mammiferi: almeno 20 membri

3 sottofamiglie:- sottofamiglia Bcl-2: azione anti-apoptotica- sottofamiglia Bax: azione pro-apoptotica - sottofamiglia BH3-only:azione pro-apoptotica

-”attivatori” (attivano bax)-”sensibilizzanti” (antagonizzano Bcl-2)

proteine altamente conservate durante l’evoluzione (omologhi di Bcl-2 in c.elegans, drosophila, adenovirus , virus di Epstein-Barr)

Bcl2-related proteins

Bcl2

omologo di Ced-9 di c.elegans, è stato il primo membro della famiglia identificato

traslocato nel linfoma follicolare (cellule B), viene a trovarsi sotto il controllo del promotore della catena pesante delle Ig -> overespressione che conferisce resistenza all’apoptosi

è il primo oncogene che promuove la sopravvivenza cellulare invece che stimolare la proliferazione

•BH1, BH2, BH3, BH4: regioni di alta omologia con Bcl-2•TM: regione transmembrana -> inserzione in membrana di nucleo, ER, mitocondri (ma possono essere anche citoplasmatiche)•conferiscono protezione da: deprivazione di citochine, UV, radiazioni, farmaci chemioterapici• BH1/2/3: recettore per il BH3 domain dei membri pro-apoptotici

• BH1, BH2, BH3: regioni di omologia con Bcl-2•TM: regione transmembrana -> inserzione in membrana di mitocondri e ER (ma possono essere anche citoplasmatiche)• molto simili a Bcl-2 per sequenza e struttura

Le proteine appartenenti alle sottofamiglie con azione pro-apoptotica sono state identificate principalmente in virtùdella loro capacità di interagire con Bcl-2

TM

• sequenza in larga parte senza omologia con Bcl-2• scarsa omologia fra di loro -> unica regione conservata: BH3 (necessaria per la funzione pro-apoptotica)

Sensibilizzatori

membri pro-apoptotici si legano al PTP —> apertura —> rilascio del citocromo cmembri anti-apoptotici si legano al PTP —| apertura

BH3-only inducono la oligomerizzazione di Bax o Bak sul mitocondrio —> canale —> rilascio del citocromo cmembri anti-apoptotici —| oligomerizzazione e formazione del canale

Regolazione mitocondriale da parte della Bcl2 family

La regolazione della permeabilità mitocondriale da parte della Bcl2 family e la sensibilità a farmaci antitumorali

(A) Il trattamento in vitro delle varie linee cellulari leucemiche con un peptide pro-apoptotico causa un cambio della permeabilità mitocondriale (“priming dell’apoptosi”): la sensibilità all’etoposide è linearmente correlata con il priming

La manipolazione per shRNA dei livelli di Bcl2 proteins cambia la permeabilità (B) ed aumenta la sensibilità ai farmaci (D-E)

Correlazione fra priming e risposta clinica alla chemioterapia

I campioni proveniente da pazienti leucemici che mostrano in vitro una migliore risposta di priming sono quelli che appartengono a pazienti che vanno in completa remissione (CR) e non recidivano (Cured).

Le molecole chiave dell’apoptosi

P53CaspasiBcl2 familyIAP familyDeath Receptors

caspasi

Cisteina aspartato-specifiche proteasi superfamiglia di 12 membri (nell’uomo) alto grado di omologia delle varie caspasi

conservazione e aumento della complessità durante l’evoluzione: 3 caspasi in c.elegans (Ced-3 prima caspasi identificata), 4 in drosophila, 12 in roditori e uomo

sito attivo ben conservato QACys285XG

assoluta richiesta di aspartico (D) in P1 del substrato

suddivisione in base alla sequenze peptidica preferenziale di clivaggio:- gruppo I: caspasi-1, -4, -5, motivo WEHD- gruppo II: caspasi-2, -3, -7, motivo DXXD- gruppo III: caspasi-6, -8, -9, -10, motivo I/L/V/EXD

Caratteristiche biochimiche delle caspasi

•caspasi iniziatrici: si sono evolute per collegare distinte pathway di segnalazione a monte con pathway esecutrici a valle -> hanno un lungo prodomain contenente moduli caratteristici per l’interazione proteina-proteina. Sono in grado di autoattivarsi

•caspasi esecutrici: processate ed attivate dalle caspasi iniziatrici. Caratterizzate da un prodomain breve.

Esistono diversi tipi di caspasi con diversa funzione

auto-attivazionetrans-attivazioneattivazione da altre proteasi (tra cui caspasi stesse)

prodomain LARGE subunit linkerSMALL subunit

Asp Asp Asp

1. taglio tra subunità maggiore e minore (2-step)2. separazione del prodomain dalla subunità

maggiore3. caspasi attiva: omodimero composto da due

monomeri, ciascuno composto da una subunità maggiore e una minore

1. taglio tra subunità maggiore e minore (2-step)2. separazione del prodomain dalla subunità

maggiore3. caspasi attiva: omodimero composto da due

monomeri, ciascuno composto da una subunità maggiore e una minore

Caspasi: ruolo nella esecuzione del programma apoptotico

• La proteolisi è responsabile delle alterazioni morfologiche che caratterizzano la morte cellulare apoptosica. • Blocco delle attività delle caspasi (mutationi o inhibitori) ritarda o previene la morte cellulare apoptosica.

P53CaspasiBcl2 familyIAP familyDeath Receptors

Le molecole chiave dell’apoptosi

IAP = Inhibitor of Apoptosis Protein

proteine endogene che funzionano come regolatori intrinseci della cascata delle caspasi

legandosi alle caspasi (anche già attivate) ne inibiscono l’attività enzimatica e ne promuovono ubiquitinazione e degradazione

le prime IAP furono identificate nel baculovirus -> conservate in drosophila e nei vertebrati

IAP family

• BIR domain: baculoviral IAP repeat (70-80 aa), responsabili per l’interazione con le varie caspasi. Interazioni con specifiche caspasi sono attribuite ai singoli BIR domains (BIR3-Casp9, BIR2-Casp3/7)• RING Finger: Zn-finger domain capace di chelare due atomi di Zn. Si trova di solito in proteine che funzionano come E3-Ub ligasi (adattatori che reclutano un substrato per un enzima E2 specifico -> targeting per la degradazione proteasoma-mediata)

Regolatori negativi delle IAP

proteine in grado di legare le IAP sopprimendone l’attività antiapoptotica

XAF-1, XIAP-Associated Factor-1: legando XIAP blocca la sua azione inibitrice su Casp-3 e reverte la sua azione protettiva verso l’apoptosi indotta da chemioterapici. Espresso a buoni livelli in tutti i tessuti, è invece estremamente basso nella maggioranza delle linee cellulari di origine tumorale usate nella ricerca di laboratorio. La perdita dell’espressione di questa proteina nelle cellule trasformate potrebbe contribuire alla maggior resistenza all’apoptosi che caratterizza le cellule tumorali.

Smac, second mitochondria-derived activator of caspases. Proteina normalmente residente all’interno del mitocondrio e rilasciata nel citoplasma durante il processo apoptotico. E’ un dimero in grado di legarsi a XIAP, IAP-1/-2 e Survivin Si lega agli stessi BIR domain legati dalle caspasi -> inibisce l’azione antiapoptotica delle IAP per competizione o spiazzamento.

Le molecole chiave dell’apoptosi

P53CaspasiBcl2 familyIAP familyDeath Receptors

Death Receptors (e loro ligandi)

proteine transmembrana di tipo I organizzate in:- regione extracellulare N-term, responsabile del

legame con il ligando specifico

- regione transmembrana- regione intracellulare C-term, responsabile della trasduzione del segnale

recettori di superficie che appartengono alla superfamiglia dei recettori di TNF/NGF

trasducono un segnale apoptotico all’interno della cellula in seguito all’interazione con una serie di specifici ligandi, strutturalmente correlati fra di loro

omologia significativa nel domain extracellulare -> 1-5 Cys-rich repeats (Ig-like) e nel domain citoplasmatico -> 60-80aa checostituiscono il cosiddetto Death Domain (DD), modulo di interazione proteina-proteina che permette l’interazione con proteine adattatrici e la trasduzione del segnale apoptotico

Attivazione dei DR

interazione della porzione extracellulare con uno specifico ligando

trimerizzazione del recettore -> recettore funzionale

formazione del DISC (Death Inducing Signaling Complex): reclutamento alla porzione intracellulare di una proteina adattatrice -> FADD (Fas, DR4, DR5)

-> TRADD (TNF-R1, DR3) che recluta poi FADD FADD a sua volta interagisce con molecole effettrici (caspasi)

L’interazione di FADD e TRADD con recettori, altri adattatori ed effettori è mediata da un modulo di tipo DD

I ligandi dei DR

citochine che appartengono alla famiglia del TNF

proteine transmembrana di tipo II organizzate in:- regione extracellulare C-term, responsabile del

legame al recettore specifico

- regione transmembrana- regione intracellulare N-term

possono essere rilasciati in forma solubile in seguito al taglio della porzione extracellulare ad opera di metalloproteasi

TNFR1 ed i suoi vari pathways modulatori

TRAIL-R e TRAILTRAIL: TNF-Related Apoptosis Indicing Ligand, è il ligando della famiglia con la più alta omologia con FasL, ed è espresso costitutivamente in molti tessuti.

Induce apoptosi più efficientemente in cellule tumorali rispetto a cellule normali (differente regolazione del signaling intracellulare post-recettore).

TRAIL-R: identificati 5 recettori ma solo due inducono apoptosi quando legano TRAIL (TRAIL-R1/DR4 e

TRAIL- R2/DR5). Entrambi sono espressi nella maggiorparte dei

tessuti umani normali e tumorali (TRAIL-R2 più espresso nei tessuti linfoidi). Due sono cosiddetti decoy receptors (TRAIL-R3/DcR1 e TRAIL-R4/DcR2) mancanti di DD ed espressi solo nelle cellule normali (competizione per il ligando). L’ultimo recettore è OPG (che lega anche un altro membro della famigliaTNF) ma non induce apoptosi

Il pathway di TRAIL

TRAIL ricombinante é tossico solo per cellule tumorali

TRAIL non induce apoptosi nelle cellule normali (topo) in vivo

Controllo TRAIL FAS-L

TRAIL causa regressione tumorale in vivo

TRAIL induce apoptosi delle cellule tumorali in vivo

TRAIL potrebbe essere un farmaco efficace?

• Iniziali studi clinici:• TRAIL induce apoptosi delle cellule tumorali, ha

scarsi effetti collaterali• Molti casi sono resistenti o sviluppano resistenza

durante il trattamento

Cross-talk tra via estrinseca ed intrinseca

• Bid viene proteolizzato dalla Casp8 attivata (via estrinseca)

• T-Bid può associarsi con membri della Bcl2 family, ed attivare la via intrinseca

• La combinazione delle due vie è necessaria per attivarel’apoptosi in alcune cellule

P53CaspasiBcl2 familyIAP familyDeath Receptors

Le molecole chiave dell’apoptosi

P53

tumor suppressor

mutata nel 50% di tumori umani: è la lesione genetica più frequente

le mutazioni osservate nei tumori clusterizzano principalmente nella regione responsabile del legame al DNA

conservata nei vertebrati, possiede omologhi anche in drosophila e c.elegans

organizzata in 4 domain funzionali, la sua funzione è finemente regolata a più livelli:

- fosforilazione, acetilazione-> degradazione

è un fattore di trascrizione ed agisce in forma di omotetramero

regola la trascrizione di gruppi di geni coinvolti in - arresto del ciclo cellulare- apoptosi- senescenza

proteina molto instabile, i cui livelli sono mantenuti costantentemente bassi all’interno della cellula tramite degradazione mediata dalla proteina Mdm2

i suoi livelli cellulari aumentano per mancata degradazione (inattivazione di Mdm2)

aumento in seguito a danno del DNA (UV, raggiX, chemioterapici) -> due principali conseguenze:

- arresto del ciclo cellulare (danno moderato)- apoptosi (danno forte)

PUMA

NOXA

Un ruolo inaspettato per p53 nell’induzione di necrosi

Dopo stress, p53 si trova localizzata insieme con la ciclofilina-D ai mitocondri

P53 è richiesta per l’apertura del PTP durante la necrosi da stress ossidativo

Viene misurata l’apertura del PTP

Lo stress ossidativo induce necrosi e non apoptosi che dipende da p53

Considerazioni

• P53 è un regolatore fondamentale dell’apoptosi, ma sembra giocare un ruolo altrettanto rilevante nella morte cellulare da necrosi dopo stress ossidativo– P53 è “good” e “bad”: in questo caso potrebbe essere

coinvolto nella patogenesi di molte malattie• Il coinvolgimento di p53 è un’altra dimostrazione

che anche la necrosi è sottoposta (almeno in alcuni casi) a un livello di regolazione impensabile fino a poco tempo fa

Pathways anti-apoptotici