XXI Ciclo di dottorato

Medicina materno infantile, pediatria dello sviluppo e dell’educazione, perinatologia

Ruolo del glutine nella risposta autoanticorpale mucosale:

celiachia e cardiomiopatia dilatativa

Dottoranda: Quaglia Sara

La cardiomiopatia dilatativa

L’indicazione principale per il trapianto di cuore

Eziologia

40%

20%

10%

30%

Idiopatica

Fattori genetici o famigliari

Sostanze cardiotossiche

Autoimmune

Celiachia e autoimmunità

5,1

10,5

16,7

27

34

0

10

20

30

40

<2 2-4 4-12 12-20 >20

Prevalence (%) of autoimmune disorders in coeliacs by age at diagnosis

Celiachia e cardiomiopatia

Cardiomyopathy Associated With Celiac DiseaseNisheeth K, Robert D. Patrik S.Mayo Clin Proc. 2005;80(5):674-676

Idiopathic dilated cardiomyopathy associated

with coeliac disease: the effect of a gluten-free diet

on cardiac performanceM. Curione, M. Barbato, F. Viola, P. Francial, L. De Biase, S. Cucchiara

DlGEST LIVER DIS 2002;34:866-69

Prevalence of coeliac disease in idiopathic dilated cardiomyopathy

M Curione, M Barbato et.al

Lancet 1999; 354:222-3

Costruzione librerie anticorpali totali da mucosa intestinale

Due soggetti con cardiomiopatia dilatativa e celiachia

Biopsia RNA cDNA

Amplificazioni VH, Vk, Vλ

Paz 1 Paz 2

~400bp

VKVH Vλ VKVH Vλ

BsshII

XhoINheI

linker

VH VL

Assemblaggio

scFv

Clonaggio

Trasformazione

Vettore fagmidicopDAN5

GeneIIIVLVH

bla

DH5αF’

Titolo librerie 106

~800bp

~800bp

Controllo colonie trasformate

Cloni stabili e NON deleti

VH+VK Paz 1 VH+Vλ Paz 1 VH+VK Paz 2 VH+Vλ Paz 2

Finger

Buona diversità

Libreria anticorpale

DH5αF’

Fago helper

Infezione

Selezioni su antigeni

Table 1. Autoantigens of cardiac autoantibodies in patientswith DCM

Sarcolemmal proteinsMyosinActinTropomyosinTroponin IMitochondrial proteinsAdenine nucleotide carrierNicotinamide-adenine dinucleotide dehydrogenaseUbiquinol–cytochrome-c reductaseLipoamide dehydrogenasePyruvate dehydrogenaseFlavinylated proteinHeat-shock proteinsHsp70Hsp60Hsc70Membrane receptorsb1-AdrenoceptorMuscarinic receptorTroponin I

Okazaki et al. TRENDS in Molecular Medicine

Auto-antigeni candidati:

•Cuore specifici(proteine del sarcolemma,miosina…)

•Proteine mitocondriali

•Heat shock proteins

•Recettori di membrana(recettore β1-adrenergico,recettore muscarinico…)

Autoimmunità nella cardiomiopatia dilatativa

Libreria anticorpale

DH5αF’

Fago helper

Infezione

Selezioni su antigeni

Miosina

Recettore adrenergico β1

Purificazione DNA plasmidico

Eco RI Hind III

Digestione e purificazione da gel

di agarosio

mRNA

Retro-trascrizione

cDNA

ECII loop del β1-AR

Purificazione

Amplificazione

Ligazione

Trasformazione batterica

2h 3h 4h O/NNI

≈52 Kd

1 2 3 4

≈ 52 Kd

Purificazione proteicaMBP- dominio IIEC

Passaggio lisato cellulare

Impaccamento della resina

Eluizione del II dominio

Dialisi

Concentrazione

Quantificazione proteica

Abbiamo deciso di comprarlo come peptide di sintesi

Ci siamo rivolti a due ditte:

• La prima dopo mesi di tentativi ha rinunciato

• La seconda ha riscontrato problemi ma continua a provare

PROBLEMI CON LA PRODUZIONE DEL RECETTORE

Poco prodotto

Non ben purificato

Noi aspettiamo fiduciosi

Selezione su miosina

Libreria Paz.1 Cloni positivi trovati 34/90

Libreria Paz.2 Cloni positivi trovati 30/90

Libreria Ctrl.- Cloni positivi trovati 7/90

Selezionate: Da selezionare

Libreria di soggetto celiaco senza cardiomiopatia

Miosina muscolare di coniglio e miosina cardiaca porcina

Prova di selezione di una libreria di paziente su miosina cardiaca porcina

Risultato:

87 cloni positivi su 90

Problema laboratoristico? Iperamplificati o favoriti alcuni cloni?

L’antigene non è pulito e crea problemi di legami aspecifici?

Riflessioni

Omologia con la miosina umana:

Miosina muscolare di coniglio vs miosina muscolare umana : omologia 95%

MIosina muscolare di coniglio vs miosina cardiaca umana : omologia 81%

Miosina cardiaca porcina

vs

miosina cardiaca umana

omologia 95%

Selezione su antigeni di controllo

Abbiamo deciso di provare a selezionare la libreria dei nostri pazienti su antigeni di

controllo positivi e negativi .

Antigene controllo positivo tTg

Antigene controllo negativo BSA

Selezione su tTg

Libreria paz 1 39/90

Libreria paz 2 37/90

Selezione su BSA

Libreria paz 2 0/90

Ruolo del glutine nella risposta mucosale

Uno dei due pazienti si è sottoposto ad una II biopsia dopo un anno di dieta senza glutine

Costruzione della libreria totale IgA

Selezione di questa sugli antigeni già utilizzati