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Problemi e prospettive nella messa a punto di nuovi biomarker

Ilaria Altieri, Marina PatriarcaDipartimento di Sanità Alimentare ed Animale

Istituto Superiore di Sanità

WORKSHOP

I NUOVI APPROCCI BIOMOLECOLARI E L’ANALISI DEL RISCHIO IN SICUREZZA ALIMENTARE: QUALI PROBLEMI E QUALI PROSPETTIVE

23 novembre 2005

Sicurezza alimentare“Responsabilità condivisa dal campo alla tavola”

Libro bianco dell’UE sulla sicurezza alimentare 2000

Controllo di tutti i passaggi della catena alimentare: non esiste “RISCHIO ZERO”

1. Materie prime: approccio sistematico per evitare contaminazioni e individuare i potenziali rischi

2. Lavorazione e trasformazione nell’industria alimentare: controllo sistematico basato su GMP, HACCP, documenti normativi di settore

3. Imballaggio: con caratteristiche specifiche per garantire integrità, sicurezza e qualità dei cibi fino al consumatore

4. Etichettatura: informazioni al consumatore, tracciabilità dei prodotti per controllo scorte, identificazione di potenziali rischi.

5. Consumatore: responsabile del corretto acquisto, trasporto, conservazione e preparazione del cibo

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Rischi per la sicurezza alimentareClassificazione dei rischi Contaminazione microbiologica

Può avvenire in qualsiasi momento della catena alimentare Agenti: batteri, virus, parassiti

Contaminazione chimicaSostanze già presenti o immesse nell’ambiente in seguito ad attività industriali, produttive, di trasporto, agricole-zootecniche.Ad es: diossine, metalli pesanti, micotossine, pesticidi, residui di farmaci per uso veterinario (ormoni della crescita e antibiotici).

Agenti fisiciAd es. residui solidi introdotti involontariamente o incidentalmente nella catena alimentare durante coltivazione, lavorazione, trasporto o imballaggio.

Aldrina, Dieldrina, DDT, TDE, DDE, Endosulfan, Endrina, Esacloro-cicloesano, Esacloro-benzene, Epta-cloro, Eptacloro epossido, Clordano, PCB (cong. N. 28 52 77 101 105 114 118 123 126 138 153 156 167 169 180 e 189), Diossine (PCDD e PCDF)

Latte intero, latte in polvere, burro, uova, grassi animali e oli, pesci, cereali *, grassi vegetali e oli, latte umano, dieta totale, acqua potabile

Elenco sostanze contaminanti e alimenti di interesse prioritario in accordo al programma GEMS/Food.

Sostanza Alimento

Piombo

* o gli altri alimenti di prima necessità

Latte, carne fresca/in scatola, rene, pesce molluschi, crostacei, cereali*, legumi, frutta fresca/in scatola, succo di frutta, spezie, alimenti per l'infanzia, dieta totale, acqua potabile

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Rene, molluschi, crostacei, cereali *, farine, vegetali, dieta totale

Elenco sostanze contaminanti e alimenti di interesse prioritario in accordo al programma GEMS/Food.

Sostanza Alimento

Aflatossine

Ocratossina ADeossinivalenolo

Mercurio

Cadmio

Pesci, prodotti ittici, funghi, dieta totale

Latte, latticini, granturco, cereali *, arachidi, noci, spezie, fichi secchi, dieta totaleGrano, cereali, vinoGrano, cereali

Patulina Succo di melaFumonisine Granturco, grano

* o gli altri alimenti di prima necessità

* o gli altri alimenti di prima necessità

Elenco sostanze contaminanti e alimenti di interesse prioritario in accordo al programma GEMS/Food.

Sostanza AlimentoDiazinone, Fenitrotione, Mala-tione, Parathon, Parathon metile, Pirimifos metile, Clorpirifos

Cereali *, vegetali, frutta, dieta totale

Aldicarb, Captan, Dimetoato Folpet,Fosalone

Cereali *, vegetali, frutta, dieta totale

Ditiocarbammati Cereali *, vegetali, frutti, dieta totale, acqua potabile

Radionuclidi (Cs-137, Sr-90, I-131, Pu-239)

Cereali *, vegetali, frutti, dieta totale, acqua potabile

Nitrati/nitriti Acqua potabile

Arsenico inorganico Acqua potabile

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Analisi del rischio

Consta di tre fasi fondamentali:

1. Valutazione del rischio2. Gestione del rischio3. Comunicazione del rischio

Prevede 4 momenti distinti

3. Valutazione dell’esposizione stima della probabile esposizione connessa all’uso della sostanzautilizza il monitoraggio biologico/ambientale

Valutazione dei pericolivalutazione delle proprietà intrinseche alla sostanza in questione

4. Caratterizzazione del rischio

VALUTAZIONE RISCHIO CHIMICO

1. Identificazione dei pericoli

2. Caratterizzazione dei pericoli effetti avversi, relazione dose-risposta, fattori confondimento

NON PUO’ PRESCINDERE dalla disponibilità di dati e informazioni affidabili

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Misurazione, continua o ripetuta, di sostanze potenzial-mente tossiche (o dei loro meta-boliti o degli effetti biochimi-co/fisici) nei tessuti, nelle escre-zioni o nell’aria espirata, al fine di valutare l’esposizione occu-pazionale o ambientale e i rischi per la salute attraverso un confronto con appropriati valori di riferimento sulla base della conoscenza della probabile relazione causale tra esposizio-ne ambientale e risultanti effetti dannosi sulla salute (IUPAC)

“indicatori biologici” o “biomarcatori”. Parametri oggetto di misura. Consentono di rilevare eventi (biochi-mici, molecolari, gene-tici, immunologici o fisiologici) in un sistema biologico che possono influenzare o predire l’insorgenza e l’evoluzione di una malattia

MONITORAGGIO BIOLOGICOBIOMARKER

concentrazione di uno xenobiotico, di un suo metabolita o del prodotto della loro interazione con un componente endogeno

CLASSIFICAZIONE DEI BIOMARKER

alterazioni biochimiche morfologiche o funzionali rilevabili nell’organismo umano

biomarker diesposizione

biomarker dieffetto

biomarker disuscettibilità

indice di predisposizione (ereditaria odacquisita) di un individuo a subire gli effetti di uno xenobiotico

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Piombo ed Indicatori di Dose, Effetto e Suscettibilità

Malattia

PolimorfismoALA D

•Pb nel sangue•Pb urinario (Pb-U)•Pb-U (EDTA)•Pb-Osso (XRF)•Pb dentina

•Pb nel plasma•Pb-U (EDTA)

•Inibizione enzima Acido-δ-aminolevulinico deidratasi (ALAD)•Inibizione dell'attività della pirimidina-5’-nucleotidasi eritrocitaria•Inibizione dell'attività dell'ATPasi eritrocitaria•aumento ALA Urinario; aumento ZPP eritrocitaria; aumento CP Urinaria

•Test di effetto renale (S-cistatina C, U-ββββ2microglobulina)•Spermiogramma•Catecolamine, PRL •Test neurocomportamentali•Ridotta velocità conduzione nervosa•Disfunzioni S N Autonomo

Alteratastruttura

o funzione

Effettobiologicoprecoce

Dose efficace

DoseinternaEsposizione

•Diminuzione vita media eritrociti•Aumento eritropoietina sierica•Diminuizione emoglobina •Anemia

INTERAZIONE AGENTE CHIMICO E INDIVIDUO

alimentiariaacquasuolo...

Proprietàchimichefisiche

Via aereaoraledermica Caratteristiche

EtàRazzaStili di vitaSessoSuscettibilitàStato di salute

Immediata Ritardata

Esposizione (dose)

concentrazioneduratafrequenzaesposizioni multiple

FONTEesposizione

AGENTE INDIVIDUOVIA DI ESPOSIZIONE

RISPOSTA

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Validazione dei biomarkerRichiede studi preliminari detti studi transizionali che includono:Studi di sviluppo: a. caratteristiche di affidabilità del metodob. procedure di raccolta, trattamento, analisi e conservazione

del campionec. tossicocinetica, rilevanza biologica e temporaleStudi di caratterizzazione: a. variabilità biologica (inter e intraindividuale) b. valori di riferimento c. fattori di confondimento esogeni ed endogeni

Studi applicati di validazione sul campo (field validation)Valutazione tra livelli di esposizionea. dose biologica efficaceb. effetto biologico precoce c. alterazioni strutturali o funzionalid. occorrenza di esiti e patologie conclamate

Parametri per la validazione di metodi di provaSCOPO DELLA PROVA IDENTITA

’PRESENZA/ASSENZA

QUANTIFICAZIONE

Parametroanalisi di

tracceIdentità + + + +Selettività/Specificità + + + +Limite di rivelabilità - + - +Limite di quantificazione - - - +Linearità/intervallo - - + +Sensibilità - - + +Precisione: Ripetibilità Precisione intermedia

--

--

++

++

Esattezza - - + +Robustezza - - + +Incertezza di misura - - + +

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DNA

mRNA

Proteine

Attività o FunzioniAnalisi di metabolitiInterazioni funzionali

NUOVE TECNICHE E DISCIPLINE MOLECOLARI

EsposizioneAnalisi di metaboliti

Test in vitro

Genomica, disciplina che studia il genoma umano. G.funzionale comprende lo studio dei geni, le proteine risultanti ed il ruolo che esse svolgono nei processi biochimici dell’organismo

Proteomica , disciplina che non solo studia un determinato gruppo di proteine (quantificazione ed identificazione), ma determina la loro localizzazione, funzione attività e modificazioni

Metabonomica: studia la variazione dell’insieme dei processi metabolici di un sistema biologico indotta da parte di agenti chimici, endogeni, xenobiotici, o agenti fisici

Trascrittomica: studia l’insieme delle molecole di RNA presenti in ogni cellula. Di queste solo metà produce proteine, l’altra metà contribuisce a controllare funzioni essenziali nella vita delle cellule con meccanismi ancora quasi sconosciuti.

Esposizione esterna

DoseInterna

Dosebiologicaefficace

Effettobiologicoprecoce

Alterazionistrutturali/funzionali

Malattia

•Sostanze chimiche•Metaboliti•Test in vitro

•Addotti del DNA•Addotti delle proteine•Profilo dell’espressione genica

•Alterazioni cromosomiche•Attivazione oncogeni•Inattivazione geni oncosoppressori

•Indicatori di danno d’organo•Indicatori di alterata funzione

•Polimorfismo geni metabolici

•Polimorfismo geni stabilitàdel DNA

•Polimorfismo geni immunocompetenza

Biomarker: nuovi approcci molecolari

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Studia l’alterata espressione genica dovuta all’esposizione a sostanze tossiche.

Obiettivo: identificare biomarker in grado di predire gli effetti avversi dovuti ad agenti biologici, chimici, fisici introdotti con la dieta, da usare come strumenti predittivi o di screening

Tecnologie maggiormente utilizzate• DNA microarray • PCR real time

Tossicogenomica e sicurezza alimentare

NutrigenomicaStudia le interazioni tra:1. costituenti della dieta e geni (e loro prodotti), che conducono

all’alterazione del fenotipo,2. geni (e loro prodotti) e costituenti della dieta, che conducono

alla trasformazione in nutrienti, antinutrienti e composti bioattivi

Obiettivo: identificare biomarker in grado di predire gli effetti benefici (salutari) o avversi dei nutrienti/componenti della dieta, da usare come strumenti predittivi o di screening

Tecnologie maggiormente utilizzate• DNA microarray • PCR real time

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Studio dell’espressione genica: tecnologieStudio dei profiliDNA Microarray

QuantificazionePCR Real timeTecniche di trasferimento genico (microiniezione, transfezione mediante lipidi, elettroporazione)

TradizionaliNorthern blottingIbridazione in situDifferential display

Studio dell’espressione genicaTecnologie maggiormente utlizzate

DNA microarray Permette l'analisi d'espressione anche di migliaia geni in maniera simultanea. Utile soprattutto per l'analisi di geni la cui espressione può essere diversa in risposta ad uno stimolo (ad es. tessuto sano e tessuto malato). Usato anche per l’identificazione e lo studio di polimorfismi.

PCR Real time

Permette di quantificare la variazione dell’espressione genica e rivelare mutazioni. Può essere usata per confermare le informazioni ottenute con la tecnologia del DNA microarray

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Applicazione dei DNA microarrayCaratterizzazione dell’espressione genica

• Studio meccanismi coinvolti nella cancerogenesi• Classificazione basata su un determinato “quadro”di

espressione genica, dei vari stadi di una neoplasia.• Individuazione di nuovi farmaci.• Caratterizzazione di determinanti di virulenza di

microorganismi.

Analisi di sequenza di geni d’interesse• Mutazioni in geni umani correlati alla insorgenza di

neoplasie/malattie• Ricerca di mutazioni correlate a resistenza microbica, farmaci,

altro.• Identificazione molecolare di microrganismi patogeni.

Tecnologia del DNA microarrayArray: supporto solido sul quale sono spottati anche migliaia di geni (sonde), dove viene fatto ibridare DNA/RNA del campione in esame, per evidenziare variazioni di espressione genica.

Fasi della tecnologia1. Produzione o acquisto di un array2. Purificazione dell’RNA 3. Produzione del campione (DNA/RNA) marcato4. Ibridazione sonda e DNA target5. Acquisizione delle immagini (rivelazione del segnale)6. Analisi dei dati

Caratteristiche del microarray idealeUn microarray ideale dovrebbe essere costituito da frammenti di DNA sequenziati, unici, che mostrino un minimo grado di ibridazione crociata e che forniscano, globalmente, una rappresentazione completa della frazione espressa del genomain esame.

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Tecnologia del DNA microarrayTest Reference

cDNA• geni d’interesse : cloni di cDNA ottenuti per clonaggio o PCR• lunghezza del frammento di cDNA : 400-5000 bp• elevata sensibilità grazie a sonde lunghe, bassa specificità per

possibilità di alta % di cross ibridazione • deposizione su sopporto mediante DNA "arrayer/spotter“

Oligonucleotidi• geni d’interesse : oligonucleotidi • lunghezza dell’oligonucleotide: 25 a 80 bp (60 bp più usati)• necessità conoscenza della sequenza genica• un gene identificato da più oligo (vantaggio)• sintesi in situ (fotolitografia) o deposizione oligo presintetizzati

DNA microarray: tipo di sonde

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DNA microarray: supporti Vetro• Dimensioni di un vetrino da microscopio (25 x 75 mm) • Densità di spot (da 2500 a 10000 spot/cm2)• Marcatura fluorescente a doppio colore dei campioni• supporto non porosoMembrana di nylon• Minore densità (40-60 spot/cm2), • Riutilizzo fino a 8 volte• Ibridazione radioattiva o chemiluminescente (sequenziale o

in parallelo)Film in plastica• Riutilizzo• Presenza di bassi i livelli di background, migliore definizione

degli spot

DNA microarray commerciali DNA array commerciali

• sono specie o applicazione - specifici• frammenti di DNA (oligo o cDNA) • ogni sequenza corrisponde a geni ben caratterizzati con un

ruolo importante in specifici processi biologici. • frammenti 300-5000 bp su membrane, plastica, vetro • minima omologia ad altri geni registrati nei database• controllo negativo (DNA genomico, plasmidico e fagico).• controllo positivo (HKG) per la normalizzazione dei dati.

Utilizzo1. analisi dell'espressione genica in uomo, topo o ratto2. ricerca avanzata su cancro, citochine e apoptosi, cellule

ematopoietiche staminali3. studio della distruzione endocrina nell'uomo4. studi di tossicologia su ratto

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RNA• quantità estratta (tessuto, popolazioni cellulari o altro):

corretta rappresentazione dell’espressione genica del campione in esame (50-200 µg di RNA, 2-5 µg di mRNA).

• purezza del campione: assenza di contaminazioni proteiche, lipidiche, o carboidrati.

Preparazione e marcatura del campione• produzione del cDNA, RNA copia (cRNA) • radioattiva: 32P o 33P; array nylon o plastica• chemiluminescente: complesso biotina-streptavidina

coniugato a HRP; array nylon o plastica• fluorescente: fluorocromi disponibili sono fluoresceina,

rodamina, Alexa, FITC, Texas Red, Cy3 e Cy5; marcatura diretta o indiretta (elimina differenze nell’ incorporazione dei vari traccianti fluorescenti, tipiche del metodo diretto); vetro

DNA microarray Purificazione dell’RNA

DNA microarray Acquisizione delle immagini

Acquisizione delle immagini, analisi bioinformatica e interpretazione biologica dei risultati ("Data Mining")

L’intensità di ogni spot è proporzionale al numero di sonde ibridate con le sequenze target

• Correzione del background• Normalizzazione: garantisce che le differenze d’intensità siano dovute ad effettive differenze d’espressione, non ad artefatti di spottaggio, ibridazione, scanning. I dati sono normalizzati sulla base di quelli ottenuti sui genihousekeeping. Summarizzazione : statistica riassuntiva delle misure fatte su ciascun probe set (set di oligonucleotidi relativi ad un solo gene).• Valutazione risultati e conclusioni

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Fonti di variabilità• Disegno sperimentale• Operatori e laboratori diversi • Campionamento e estrazione dell’RNA • Piattaforme diverse • Protocolli di marcatura e ibridazione • Impostazioni strumentali e per l’analisi dell’immagine • Elaborazione e normalizzazione dei dati • Interpretazione del dato e valutazione della sua qualità

Barriere all’utilizzo• Incertezza di una relazione diretta tra trascritti e end-point

biologici: mancanza di banche dati pubbliche • Mancanza di tecnologie validate: mancanza di

standardizzazione, di dati comparativi tra piattaformeapprocci e disegni sperimentali diversi

• inadeguata robustezza degli strumenti per l’analisi dei dati

DNA microarray

• Banche dati pubbliche per la validazione dei trascritti sulla base di end-point biologici

• Disponibilità di materiali di riferimento e controllo per: la valutazione delle prestazioni (riproducibilità, sensibilità erobustezza) tra piattaforme, laboratori e tecnologie diversi

• Linee guida per la produzione di dati analitici in modo tale permetterne una valutazione indipendente dalla piattaforma utilizzata

• Criteri obiettivi di prestazione per la validazione e standardizzazione di misure con microarray

Proposte per i requisiti di validazione dei dati microarray

Raccomandazione della FDA

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Effetti di nutrienti su stabilità genoma e regolazione espressione genica.

Macro e micronutrienti possono modulare la stabilità genomicae prevenire la genotossicità di tossici endogeni/esogeni, ad es.:Vit C: la sua carenza causa ossidazione del DNA e danno ai cromosomi e inibisce la modificazione ossidativa dellaguanosinaVit E: inibisce la rottura del DNAss causata dai ROS e rad. UVNiacina: interviene nella riparazione del DNA e nel prevenire morte cellulareFolato: interviene nel regolare la metilazione nelle regioni ric-che del dinucleotide CpG con inibizione dell’espressione genica.

DNA microarray: valutazione dell’intero profilo dell’espressione genica in risposta ad un intervento dietetico.

Variazioni genetiche individualiIndividui portatori di SNP (single nucleotide polymorfism) in specifici geni, potrebbero presentare una maggiore predisposizione genetica che li rende più o meno sensibili ad alcuni nutrienti della dieta e quindi più inclini o resistenti asviluppare specifiche malattie.Oligo-array per:• identificare di migliaia di SNPs simultaneamente;• determinare la predisposizione genetica degli individui e la

relazione tra SNP (biomarker) e rischio di malattia.

La tecnologia array, attualmente, può essere usata solo per monitorare le alterazioni nell’espressione genica in prodotti alimentari geneticamente modificati rispetto a quelli tradizionali e non per rivelare e quantificare esatta percentuale di materiale transgenico.

Organismi geneticamente modificati (OGM)

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Polymerase Chain Reaction

PCR è una reazione di polimerizzazione a catena in vitro in grado di amplificare fino 108 una sequenza di DNA. Essa sfrutta l’azione dell’attività enzimatica di una DNA POLIMERASI (TAQ) per duplicare uno specifico frammento di DNA delimitato alle sue estremità da due PRIMERS (oligonucleotidi). Durante analisi il campione di reazione è sottoposto a cicli termici (fase denaturazione, annealing e estensione) successivi per ottenere l’amplificazione, grazie alla resistenza alla temperatura (95°C) della TAQ polimerasi.

PCR- Real time

FORMULA DELLA PCRLa quantità di DNA amplificato e’correlata alla quantità di

DNA iniziale dalla formula

Y = X (1 + ηηηη ) n

Y = Quantità di DNA amplificato in PCRX = Quantità di DNA inizialeη = Efficienza dell’ Amplificazione (da 0 a 1)n = numero di cicli

FORMULA TEORICA

PCR Real time

Cycle #

Theoretical

Real Life

Log

Targ

et

DN

A

- aumento esponenziale è limitato- aumento lineare segue quello

esponenziale- il plateau non è correlato con la

quantità iniziale di DNA- enzima, primers perdono efficacia

cui consegue una variazione dell’EFFICIENZA(η).

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PCR Real-timeDurante fase esponenziale ottenute informazioni quantitative :• nessun fattore è limitante (primer, TAQ)• prodotti di amplificazione si accumulano in modo costante • la reazione è monitorata mediante il grafico di fluorescenza

con l’uso di molecole fluorescenti come il Syber green o sonde marcate (TaqMan, Molecolar beacon…)

Syber green• emette > fluorescenza quando legato al DNA a doppia elica • mentre DNA viene amplificato SB si intercala con aumento

della fluorescenza con l’aumentare di DNA amplificato.

Sonde TaqMan• frammento di DNA complementare al DNA target• estremità con reporter (fluoroforo) silenziato da un quencher• aumenta la fluorescenza quando sonda è tagliato dalla Taq ed

il quencher allontanandosi non silenzia più il reporter

PCR- Real time e sicurezza alimentare

5’5’

3’3’

d.NTPs

Thermal Stable DNA Polymerase

Primers5’

3’5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’5’

3’

Miscela campione e reagenti

Denaturazione

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’5’

3’

Annealing

Tubo di reazione

Coloranti fluorescenti intercalanti

Intercalation Dyes

Taq IDλ

PCR- Real time

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Estensione

5’ 3’

5’3’5’ 3’

5’3’

Estensione con applicazione

continua della lunghezza d’onda

d’eccitazione

5’ 3’

5’3’5’

5’

Taq

Taq

3’

5’3’

Taq

Taq5’

5’

Ripetizione

ID ID

ID IDID

ID ID ID

ID ID

λ λ λ

λλ

Coloranti fluorescenti intercalantiPCR- Real time

5’ 3’5’3’

TaqManTM

5’3’

RQ

Step di sintesi del filamento

5’ 3’

1. Spostamento della Taq lungo il filamento

Taq3’

Q

R

5’

5’ 3’3’

Q Taq

R

5’ 2. Attività esonucleasica

3. Completa polimerazione5’ 3’

QTaqR

3’ 5’

4. Rivelazione della fluorescenza ad ogni ciclo5’ 3’

3’

QTaqR

5’

λ

R

20

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

0 10 20 21 30 40

ThresholdBaselineSample

CT

• Linea di base su fluorescenza nei primi 15 cicli di tutti i pozzetti di reazione

• Calcolo della Soglia (Threshold) sulla fluorescenza nei primi 15 cicli + 10 deviazioni standard.

• CT: calcolato per ogni campione (Threshold cycle), è ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnale di fluorescenza delcampione supera il Threshold ed esso dipende dalla concentrazione del gene ricercato.

PCR Real time

Analisi quantitativa dell’espressione genica: approccio relativogene d’interesse (GOI) quantificato mediante paragone del gene d’interesse in un campione di controllo (reference sample) e campione in esame. Si assume essere 1 l’espressione del GOI nel campione di controllo, e nei campioni in esame la quantità del GOI è espressa come n-volte la differenza relativa rispetto al campione di controllo

Sample GOI Ct HKG Ct ∆∆∆∆Ct S∆∆∆∆Ct-C∆∆∆∆Ct Relative expression1 (Control) 28 25 3 0 1

2 25 23 2 -1 23 24 26 -2 -5 324 27 24 3 0 1

∆Ct= GOI Ct - HKG CtS ∆Ct-C ∆Ct = Sample ∆Ct-Control ∆CtRelative Expression= 2-(S ∆Ct-C ∆Ct)

PCR Real time

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Approccio assolutoDNA quantizzato usando una curva standard. Necessità di DNA standard ed uso curva standard in ogni PCR. Costruzione uno standard mediante clonaggio del frammento in esame (GOI) e HKG in vettore plasmidico. Quantificazione ac.nucleico clonato spettrofotometricamente/fluorimetricamente e la conversione della misura dell’assorbanza in quantità di ac.nucleico.

PCR Real time

Approccio assoluto In ogni campione è misurato il contenuto in cDNA per il GOI e HKG, quindi viene calcolato il rapporto R, i diversi campioni sono confrontati tra loro mediante paragone dei rapporti R.

Caratteristiche della metodicaLinearità: curva standard (diluizioni seriali del cDNA) valuta come il sistema risponde in modo costante a tutte le concentrazioni di campione esaminato, permette di valutare l’efficienza η della reazione di PCR. ηηηη = [10(-1/s)] – 1

Specificità SB TaqManamplicone 70-250 bp 70-150 bpprimer 15-20 bp 15-20 bpTm primer ~ 55- 60 °C 58-60 °C [Primer] 50-500 mM 50-200 mMTm sonda / 68-70°Csonda 30 bp

PCR- Real time

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Prodotto specifico

Prodotto non specifico

Tm

Specificità : curva di melting e Syber green

Precisione viene valutata tra i duplicati e triplicati nello stesso saggio (ripetibilità) e tra saggi (precisione intermedia)

Validazione Controllo negativo (Ct =0 ), valuta assenza didella seduta contaminazione

Controllo positivo (Ct >0) verifica la che reazione di amplificazione sia priva di sostanze interferenti. Aumenta la confidenza nell’affidabilità del risultato del controllo negativo.

PCR- Real time

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Expression analysis of androgen-responsive genes in the prostate of veal calves treated with anabolichormones Domest. Anim. Endocrinol. (2005)

Scopo: individuare biomarcatori indiretti, per identificare trattamenti illeciti con promotori della crescita, in vitelli.L’uso di ormoni naturali/sintetici è vietata in EU.

E’ stata valutata la variazione di espressione genica dei 12 geni selezionati dalla letteratura, su tessuto prostatico di vitelli.

Identificazione di tre geni, MAF, ESR1, AR con significativa up-regolazione e quattro geni HMCGS1, HPGD, DBI e LIM con significativa down-regolazione nei vitelli trattati rispetto ai controlli.

PCR- Real time e sicurezza alimentare

•Operatori e laboratori diversi •Campionamento e estrazione dell’RNA •Uso di piattaforme tecnologiche differenti•Materiali di riferimento non certificati spesso prodotti in house.•Differenza nell’espressione dei risultati

FATTORI CRITICI CHE INFLUENZANO LA QUALITA’ DELLE MISURE PCR-RT

Esattezza e precisione(Accuratezza) dei dati prodotti

Platform differences

• Roche Light Cycler– Glass capillaries– Rapid temperature changes (20 oC / sec)

• ABI Prism, iCycler, Mx 4000– Plastic tubes heated in a metal block– Slower temperature changes (1-4 oC / sec)

AffidabilitàConfrontabilità

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Considerata • l’importanza crescente delle biotecnologie per la salute umana, la

produzione alimentare, la medicina legale e la protezione dell’ambiente;

• la necessità di eseguire misure accurate riferibili al SI in queste aree;

• l’assenza di una adeguata infrastruttura metrologica per assicurare tale riferibilità;

raccomanda ai laboratori metrologici nazionali • di considerare lo sviluppo di programmi relativi alla misura di

grandezze importanti nelle biotecnologie• di collaborare con le organizzazioni internazionali e le società

scientifiche internazionali … per assicurare la riferibilità al SI delle misure nelle biotecnologie

21esima Conferenza Generale dei Pesi e delle MisureRisoluzione 11 - Metrologia in biotecnologia

Iniziative internazionali per lo sviluppo della metrologia nelle biotecnologie

Iniziative internazionali per lo sviluppo della metrologia nelle biotecnologie

•Costituzione del Gruppo di lavoro “Bioanalisi” del Comitato Consultivo sulla Quantità di Sostanza con lo scopo di formulare e attuare una strategia globale per la standardizzazione delle misure nelle biotecnologie, in particolare la quantificazione del DNA e delle proteine.

•Attività specifiche del Joint Committee for Traceability in Laboratory Clinical Medicine: Rassegna dei metodi e dei materiali di riferimento per acidi nucleici, proteine ed altri analiti per produrre un elenco approvato di riferimenti che soddisfano ai requisiti della Direttiva UE sui diagnostici In Vitro .