Pesticidi organofosforici ed effetti neuroendocrini e comportamentali in modelli animali: rilevanza per la

valutazione dei rischi per la salute neuropsicologica in età evolutiva.

G. Calamandrei, A. Olivieri, A, Venerosi, L. RicceriDipartimento di Biologia cellulare e Neuroscienze,

Istituto Superiore di Sanità,Roma

ISS, 15 ottobre 2008

. Pesticidisostanze o i prodotti chimici capaci di controllare, limitare, respingere o

distruggere gli organismi viventi (microrganismi, animali o vegetali) considerati come nocivi, o di opporsi al loro sviluppo

Evidenze di interferenza con il sistema endocrino permolti insetticidi ( o,p´-DDT, endosulfan, dieldrin, methoxychlor, kepone,

dicofol and toxaphene);alcuni erbicidi (alachlor, atrazine and nitrofen);fungicidi (benomyl, mancozeb and tributyl tin);nematocidi (aldicarb e dibromochloropropane).

Neurotossicità potenzialedella maggioranza degli insetticidi:Effetti sul SN mediati da meccanismi neuroendocrini?

NOAEL (not osservable adverse effect level) livello di concentrazione di un principio attivo assumibile da un animale di laboratorio nel lungo

periodo senza mostrare effetti avversi.

ADI (acceptable daily intake)dose giornaliera di fitofarmaco accettabile per l’uomo

NOAEL/100

Questo modello non tiene in considerazione fattori molto importanti quali la compresenza di più principi attivi contemporaneamente(multiresiduo), spesso con analogo meccanismo d’azione,e, per quanto riguarda il valore del singolo residuo,gli effetti calcolati su organismi diversi da quello “tipico”(maschio adulto di circa 70 kg)

LIMITI DEI PARAMETRI STIMATI PER LA VALUTAZIONE DEI RISCHI

PER LA SALUTE UMANA

RICONSIDERAZIONE DEI PROCESSI DI VALUTAZIONE DEL RISCHIO

VIE DI ESPOSIZIONE A UN PESTICIDA:PECULIARITA’ DELL’ORGANISMO IN

SVILUPPO

• Periodo fetale: attraverso la placenta in seguito ad esposizione materna occupazionale/residenziale/attraverso la dieta

• Periodo neonatale: attraverso l’allattamento, il contatto cutaneo, l’espirazione

• Periodo infantile: direttamente dall’alimentazione, o esposizione a polveri in ambiente domestico, terreno contaminato, etc.

Il bambino non è un adulto in miniaturama ha specifiche caratteristiche

eto-ecologiche, che lo espongono a maggiori rischi

• Statura: più vicino al terreno, più esposto alle polveri

• Comportamento: portare gli oggetti e le mani alla bocca aumenta il rischio di esposizione ai tossici

• Dieta meno variata e più ricca di frutta• Sistemi enzimatici di detossificazione ancora

immaturi

Scenario reale: esposizione protratta e a basse dosi durante tutto il corso dello sviluppo pre e postnatale

RISCHIO PIU’ ELEVATO CHE PER L’ORGANISMOADULTO di perturbazione di molteplici processi

maturativi nel sistema nervoso, endocrino, immunitario

Fonte Eurostat 2007

INSETTICIDI ORGANOFOSFORICI

• Inibitori dell’enzima acetilcolinesterasi, azione neurotossicadeterminata dall’accumulo del neurotrasmettitore acetilcolina nello spazio sinaptico con conseguente sovrastimolazione della trasmissione colinergica

• Effetti acuti da esposizione occupazionale: convulsioni, paralisi, neuropatie legati ad inibizione AChE superiori al 60% dei valori di controllo

• Relativamente privi di effetti avversi sull’uomo (adulto) per esposizioni a basse dosi

Dalla seconda metà degli anni ‘90, dati sperimentalianimali indicano la possibilità di una maggiore suscettibilità dell’organismo in sviluppo agli effetti degli OP, e in particolare del CPF (EPA, 1996)

Gurunathan al, Environ Health Perspect, 1998: calcolando la molteplicità delle fonti di esposizione e le caratteristiche etologiche di bambini sotto i tre anni di età, si arriva a un’esposizione reale al clorpirifosalmeno 10 volte superiore all’ADI (0.03 mg/kg/day) stabilito per l’organismo adulto.

Ostrea et al., Neurotoxicology, 2002: nel meconio riscontrate concentrazioni di CPF di circa 5 mg/kg

Nel 2001, sulla base della revisione dei dati, l’impiego residenziale

del CPF viene vietato negli Stati Uniti, così come l’uso dello stesso insetticida nei parchi e nei luoghi pubblici

frequentati dai bambini

Dati clinici ed epidemiologici (2000-2006): gli organofosfati interferiscono negativamente

con il neurosviluppo nell’uomo• High maternal levels of CPF in association with low

maternal levels of PON associated with significantreduction in head circumference at birth (Berkowitzet al., EHP, 2004)

• Impaired short-term memory and attention in children exposed to methyl-parathion (Ruckartz et al., EHP, 2004)

• Abnormal reflexes as assessed in the Brazeltonscale in neonates exposed in utero toorganophosphorous pesticides: higher levels of OP metabolites in the mother’s urine are associatedwith hyporeflexia after 3 days from birth (Young et al., Neurotoxicology, 2005).

• High chlorpyrifos levels in umbilical cord plasma are predictive of lower neuropsychological scoresat 3 years of age: deficit in attention, hyperactivity, low psychomotor and mentaldevelopment indexes (Rauh et al., Pediatrics, 2006)

Studi su modelli animali:effetti avversi del CPF sul neurosviluppo

Anche in assenza di significativa inibizione AcHE, esposizione perinatale al CPF• altera trascrizione genica e sinaptogenesi• colpisce sistemi di neurotrasmettitori diversi dal

colinergico(noradrenergico, serotonergico)• neuroni bersaglio preferenziale nella fase prenatale,

cellule gliali in quella postnatale

Protocollo sperimentale di esposizione neonatale al CPFa dosi prive di tossicità sistemica e comparabili

all’esposizione umana

Infancy

1 4 5 8 10 11

CPFULTRA

SOUNDS

25 45 60Postnatal day

Treatment

Behavioral testingLOCOMOTOR

ACTIVITY

Weaning Adolescence AdulthoodDevelopmental stage

11 14

CPF 25 45 60

SOCIAL INTERACTIONS

PASSIVE AVOIDANCE

Postnatal day

HOMING

Trattamento giorni 1-4: % inibizione AChE= 20%Trattamento giorni 11-14: nessuna inibizione

20

40

60

80

Vehicle CPF 1 mg CPF 3 mg

Locomotor activity(pnd 25)CPF 1-4

Dis

tanc

etra

velle

d(m

)

CPF 11-14*

Weaning

Ricceri et al., 2003. Toxicol Appl Pharmacol

Allo svezzamento (giorno 23)gli animali esposti al CPF nel

periodo neonatale avanzato (11-14) mostravano una più elevata attività motoria ed esplorativa,

un effetto dose dipendente.

Ricceri et al., 2003. Toxicol Appl Pharmacol

All’adolescenza (giorno 45), gli animali esposti al CPF, sia ai gg 1-4 che ai gg 11-14, erano più attivi nell’esplorazione di un nuovo ambiente (test di novelty seeking)

emostravano una prevalenza di interazioni

aggressive con un conspecifico non familiare, ad un’età alla quale di solito

prevalgono i comportamenti di tipo affiliativo

Adolescence

CPF 1-4

0

5

10

15 Vehicle-mCPF 1 mg-mCPF 3 mg-m

0

5

10

15

1

CPF 11-14

5-min-blocks

Total aggressive responses(pnd 45)

2 3 4

1 2 3 4

Num

bero

f res

pons

espe

r min

* *

* *

* *

AGONISTIC BEHAVIOUR

PND11 PND14

CPF

4 - 5 months

LOCOMOTOR ACTIVITY

SOCIAL RECOGNITION

MATERNAL BEHAVIOUR

2 monthsGD15 GD18

CPF

Birth

Esposizione prenatale + neonatale al CPFDisegno sperimentale

PLUS MAZE

Prenatal Postnatal

Le dosi di clorpirifos utilizzate sono dosi al di sotto della soglia di tossicità (inibizione dell’acetilcolina esterasi < del 50% nel siero, assenza di inibizione significativa nel cervello)e paragonabili alla massima esposizione umana attraverso dosi subtossiche

3 6

0

20

40

60

80

100

**

Prenatal treatment CPF (mg/kg)3 6

0

50

100

150

200Serum Brain

Attività cerebrale e sierica della Ache

PND 15

PND 0

% o

f cha

nge

from

Con

trol

% o

f cha

nge

from

Con

trol

% o

f cha

nge

from

cont

rol

0

20

40

60

80

100

120

Postnatal CPF (mg/kg)

*

*

*

31veh

% o

f cha

nge

from

cont

rol

0

20

40

60

80

100

120

140

31veh

#* * *

6 mg/kg3 mg/kgveh

Prenatal CPFmg/kg

Brain Serum

Freq

uenc

yof

Cro

ssin

g

veh 1 3

Postnatal CPF (mg/kg)

0

150

200

250

300

350

40063veh

Prenatal CPFmg/kg

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

*

**

*

*

**

##

Open field, valutazione dell’attività spontanea in un ambiente nuovo

L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase prenatale e/o postnatale

determina un aumento dell’attività locomotoria nei maschi adulti

Dur

atio

n (s

)

Prenatal CPF (mg/kg)

0

1

2

3

4

veh 3 6

Submissive uprightposture

Attack response

Postnatal CPF (mg/kg)

0

2

4

6

8

Dur

atio

n (s

)

veh 1 3

Freq

uenc

y

0

1

2

3

4

5

veh 1 3

* *

L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase prenatale induce un comportamento pro-aggressivo durante un incontro sociale

tra maschi adulti

Comportamento Agonistico

Freq

uenc

y

01234567

veh 1 3

Postnatal CPF (mg/kg)

Defensive uprightposture

Offensive uprightposture

Prenatal CPF (mg/kg)

01234567

Freq

uenc

y

*

veh 3 6

L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase postnatale induce un comportamento pro-aggressivo durante un incontro

sociale tra maschi adulti

Comportamento Agonistico

Postnatal CPF (mg/kg)

Licking

Freq

uenc

y

Dur

atio

n (s

)

02468101214

veh 1 3

*

020406080100120

veh 1 3

* *

Sniffing

Freq

uenc

y

Postnatal CPF (mg/kg)

9

01357

veh 1 3

* *

Freq

uenc

y

Crouching response

Dur

atio

n (s

)

veh 1 3 0

1

2

3 * *

veh 1 301020304050 * *

Postnatal CPF (mg/kg)

L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase postnatale aumenta i

comportamenti “materni” durante un test di induzione materna in femmine

vergini

Induzione del comportamento materno

R

ResidentR P1

R P1

ResidentR P2

45 min

45 min

Riconoscimento sociale

T= Training (3 min)

= Retest Same (3 min)

= Retest Different (3 min)

4

8

12

16

SOCIAL INVESTIGATION

******

Num

bero

f epi

sode

s/m

in

CPF3Veh

Prenatal Treatment

CPF6

Veh CPF1 CPF3Postnatal Treatment

Num

bero

f cal

l/min

40

80*

**

*

** **

a

a

a

ULTRASOUND VOCALIZATIONS

T RS T RS T RS

T RS RD T RS RDT RS RD

Veh CPF1 CPF3Postnatal Treatment

Social Isolation (4 days)

USVs+

Social investig

(Anogenital, nose and

body sniffing)

USVs

R = resident P = partner

Plus Maze

Postnatal treatment (mg/kg)

0

10

20

30

40

50

60

70

% Time spent in the open arms

MaleFemaleveh 1 3 veh 1 3

**

L’esposizione alle dosi alte di CPF in fase postnatale induce

un comportamento meno ‘ansioso’ nelle femmine

DARK-LIGHT TEST

Veh CPF0

100

200

*

Late

ncy

(s)

Head dipping

frequ

ency

MaleFemaleveh 3 6 veh 3 6

0

5

10

15

20

25

30

35

Prenatal treatment (mg/kg)

*

Plus Maze

L’esposizione alla dose intermedia di CPF in fase

prenatale induce un comportamento meno esplorativo nei maschi

Aggressivita’ Materna: difesa del nido in presenza di un maschio adulto intruso, femmine adulte esposte al CPF pnd 11-14

Investigative behaviour(Mutual Circling, Social Sniffing and Follow )

Dur

atio

n(s

)

0

100

200*

Digging

Dur

atio

n(s

)

*

0

5

10

15

20

Defensive PosturesD

urat

ion

(s)

0

10

20

30

40

50

*

Attacks

0

10

20

30

Freq

uenc

y

CPF 3 mg/kg

Veh

Esiste un’ampia finestra di vulnerabilità del sistema nervoso centrale all’esposizione al CPF

Le alterazioni del profilo comportamentale osservato non appaiono riconducibili alla inibizione dell’acetilcolina esterasi. Ciò suggerisce che tale parametro è insufficiente nella valutazione del rischio da esposizione a clorpirifos

In particolare il quadro di alterazione comportamentale ottenutoin questo studio suggerisce una selettiva suscettibilità dei comportamenti di tipo sociale/parentale ed emozionale

Quali i target neurali dell’azione del CPF? E’ possibile ipotizzare un’interferenza con la maturazione di meccanismi neuroendocriniche sono tra i regolatori più importanti delle funzioni sociali e riproduttive?

L’esposizione perinatale al CPF aumenta la densità dei recettori 5HT1 e 5HT2 e del trasportatore presinaptico per la serotonina nel cervello di ratto (Aldridge et al. 2005; Slotkin2007). La serotonina è significativamente implicata negli stati affettivi/emozionali e nella regolazione dei comportamenti agonistici nei mammiferi.

I neuropeptidi ipotalamici ossitocina e vasopressina, oltre controllare importanti funzioni fisiologiche legate alla riproduzione, hanno anche un ruolo centrale nella

modulazione dei comportamenti sociali e degli stati emozionali. Dati recenti indicano che la sintesi di

ossitocina nell’ipotalamo è sotto controllo serotoninergico (Ho et al. 2007; De Magalhaes Nunes et

al. 2007). oxyavp

Aree limbiche (5HT)

Ipotesi: il CPF interferisce con questo meccanismo neuroendocrino

di regolazione del comportamento?

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kgPostnatal CPF

OT

leve

l[A4

50 n

m]

0 mg/kg3 mg/kg6 mg/kg

Prenatal CPFmain prenatal effect p=0.01

Males

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kg

OT

leve

l[A4

50 n

m]

Postnatal CPF

Females

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kgPostnatal CPF

Livelli ipotalamici di ossitocina in topi adulti CD1 esposti a CPF in fase prenatale e neonatale

Incremento dose-dipendente e più marcato nei maschi

a)

b)

main prenatal effect p<0.01

0 mg/kg3 mg/kg6 mg/kg

Prenatal CPF

0

10

20

30

40

50

60

AVP

leve

l[O

D*m

m2]

0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kgPostnatal CPF

Females

AVP

leve

l[O

D*m

m2]

* *

0

10

20

30

40

50

60Males

**

0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kg

Postnatal CPF

0 mg/kg 1 mg/kg 3 mg/kg

Postnatal CPF

0

10

20

30

40

50

60

Livelli ipotalamici di vasopressina in topi adulti CD1 esposti a CPF in fase prenatale e neonatale

Decremento dose-dipendente e più marcato nei maschi

Iperattività e aumentata risposta agli stimoli ambientali e sociali negli animali esposti al CPF:

effetti sul funzionamento della tiroide?

Conception 12wks Birth 2yrs

Fetal/neonatal TH

Maternal TH

Cerebral neurogenesis, migration

Cerebral neurogenesis

Neuronal differentiation, synaptogenesis

gliogenesis

myelinogenesis

FIG. 1: Distribution of serum T4 levels detected in pregnant dams at GD 18 (Panel A) and follicular cell height (expressed as follicular external area/ follicular internal area: FEA/FIA) measured in dams at PND 23 (Panel B). Lines indicate mean values.

Panel A Panel B

0

5

10

15

20

25

30

35

0 1 2 3 4

T4

(ng/

ml)

M0 M6M3 M0 M6M3

P=0.04

P=0.02 P=0.02

FIG. 2: Mean ± SD of serum T3 levels in F1 males (panel A) and females (panel B) at PND150

ANOVA: sex × post-natal treatment, P=0.05

0.91±0.150.84±0.180.81±0.18

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

MxP0 (n=28) MxP1 (n=25) MxP3 (n=26)

T3 (n

g/m

l)

Male post-natal exposure

Panel A

1.02±0.22

1.18±0.271.23±0.38

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

MxP0 (n=28) MxP1 (n=28) MxP3 (n=29)

T3 (n

g/m

l)

Female post-natal exposure

Panel B

P<0.05

P<0.05P<0.05

ANOVA: post-natal treatment, P=0.03 ANOVA: post-natal treatment, P=0.02

Panel A; ANOVA: post-natal treatment, P=0.01

100.78±22.36 97.1±16.3886.34±16.62

0

20

40

60

80

100

120

140

MxP0 (n=27) MxP1 (n=29) MxP3 (n=29)

T4 (n

g/m

l)

P<0.05

Male post-natal exposure

P<0.05

84.86±15.4583.15±14.48 84.07±10.65

0

20

40

60

80

100

120

140

MxP0 (n=29) MxP1 (n=28) MxP3 (n=29)

T4 (n

g/m

l)

Female post-natal exposure

Panel B; ANOVA: post-natal treatment, P=NS

FIG. 3: serum T4 mean levels in F1 males (panel A) and females (panel B) at PND150

ANOVA: sex x pre-natal treatment x post-natal treatment, P=0.04

pre-natal treatment x post-natal treatment, P=0.03

0

20

40

60

80

100

P0 P1 P3

post natal exposure

T4 (n

g/m

l)

M0P3 M3P3 M6P3M0P0 M3P0 M6P0 M0P1 M3P1 M6P1

FIG. 4: F1 male’s thyroid mice at PND 150. A: Control group (M0P0)

B: Necrotic cells exfoliated into the colloid in MxP3 group. (32×, HE, 5μm section).

A B

Effetti significativi sulla morfologia della tiroide e sui livelli di T3 e T4 della esposizione neonatale a CPF

in topi maschi adulti

Prospettive di ricerca ed implicazioniper la valutazione del rischio :

•Il clorpirifos si comporta da interferente endocrino con meccanismiinediti: è possibile che altri pesticidi producano effetti simili?

•I parametri tradizionali di tossicitàpossono non essere appropriati a valutare il rischio associato a esposizioniprolungate e a basse dosi

•Necessari nuovi biomarcatori di esposizione e di effetto: indicazioni dalla ricerca di base per gli studi clinici ed epidemiologici

PESTICIDI E RISCHIO DI DISORDINI AUTISTICI Environmental Health Perspectives, feb. 2006

HENVINET:Health and

ENVironmentNERwork

Focus su allergietumori,

effetti endocrinidisordini neurocomportamentali

E ELABORAZIONE DI NUOVI STRUMENTI DI VALUTAZIONE

DEL RISCHIO

Sources

Indoor and residential

use

Agriculture and

gardening

Environmental matrix

Emission/Releasehazardous agents

Source strength and physical form, Season,

Location

Exposure route

Dispersion &transformationTransport, Climate,

Area of use

Physicalprocessesdietary uptake,

pharmaco-kinetics,absorption, distribution

Populationbehaviour

Occupation, activitydiet, consumer use,

environment

(age),

Soil

Activities /Processes

Natural and anthropogenic

(production, storage,dumping, leakage,

etc.

WaterAir (house

dust)

Dermal (2)Oral (diet)

food (1)Oral (non-dietary)

Respiratory Placental

Breast milk?

Exposuresduration, frequency,Intensity of contact,

biological matrix (sampling)

Solid foodSurfaces

ConcentrationComposition, load,

magnitude, application frequency

OPs :(chlorpyrifos)

Human body

AgeGenetic/aquired

predisposition

DoseBody burden,

dose at target organ,effective dose,

metabolites, enzymes

Health effectsImpaired motor

development, neuro development, attention

deficit, ADHD, impulsivity, hyporeflexia, reduced head circumference

Social, cultural, political,economical &

judicial settings

ImpactsPolicy deficits,

Disease burden, Societal costs,

Economic costsPerceptions, etc.

Optimal scenario

Pathophysiol.Processes

Pharmacodynamics,. Toxico-kinetics

Valuation &weighing

Severity, value of life, productivity,

Timing of interventional

measures.

Appraisal,Ethical decision

framingMulti-criteria, risk-benefit,cost-effectiveness, etc.

Physicalprocesses

metabolism, enzyme function, barrier function

(placenta)

OP scheme, part 2

Aldina Venerosi PescioliniLaura RicceriFlavia ChiarottiMaria Luisa ScattoniAngela Rungi, Valentina Sanghez

Antonella OlivieriSimona DeAngelis

Sabrina TaitFrancesca MaranghiAlberto Mantovani

Dipartimento di Sanità PubblicaVeterinaria e Sicurezza Alimentare, ISS

RINGRAZIAMENTI

Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, ISS

Reparto Neurotossicologiae Neuroendocrinologia

Reparto di Metabolismo ed Endocrinologiamolecolare e cellulare

Dipartimento del Farmaco, ISS

Annarita MeneguzFrancesca Cometa