MICROBIOLOGIA CLINICAECOSISTEMA MICROBICO DEL CORPO UMANOLa flora microbica normale si trova nelle alte vie respiratorie, sulla cute, nel distretto urogenitale.Il sangue è un distretto sterile; in realtà, andando ad analizzare meglio, vediamo la presenza di alcuni virus non patogeni ma che periodicamente possono dare febbre. Un distretto che è assolutamente sterile è il SNC: analizzando il liquor non devo mai trovare presenza microbica.

Complicanza: rischio di contaminazione di siti sterili.Altra complicanza: il referto negativo non significa che non c’è alcun microbo, ma che non è stato trovato negatività del referto microbiologico può sia significare che non c’è, sia che non è stato trovato.

Se faccio un campionamento sbagliato o nel modo sbagliato, parto già con un risultato sbagliato; questo mi porta a perdere tempo, ma in una condizione acuta bisogna agire velocemente. Inoltre porta a uno spreco di soldi, oltre che rimanere nell’incertezza diagnostica.

TRE TIPI DI PRELIEVO IN CAMPIONAMENTO MICROBIOLOGICOTutti i campioni biologici possono essere usati per campionamento microbiologico.

Liquor: per arrivare al sito contaminato devo bucare soltanto la cute e quindi c’è rischio di contaminazione. Apparato respiratorio: per poter arrivare a prelevare un sito sterile devo passare necessariamente da un sito

contaminato. Un campione delle basse vie aeree deve necessariamente passare dalle alte vie aeree, in cui è presente la flora microbica; la probabilità che venga contaminato è molto alta, quindi esistono dei metodi che eliminano la flora microbica normale dal campione.

Feci: in alcune sedi non sterili bisogna cercare di isolare la flora microbica normale a cui sono mescolati agenti patogeni.

Se non ho trovato quello che cercavo, può essere che il campionamento è difficoltoso. Il terzo tipo è il caso di campione più contaminato (nel secondo non sarà mai tanto contaminato come il terzo).

1

MODALITÀ PER LA CORRETTA RACCOLTA DEI CAMPIONI- Prelievo del campione adeguato e al momento giusto. Es: durante un picco febbrile perché rappresenta la

liberazione nel sangue del patogeno quindi in questo momento ho la massima concentrazione.- Raccolta di un volume e numero adeguato di campioni- Evitare contaminazioni da parte di flora microbica normale (es: campionamento urina va fatto prelevando il

mitto intermedio) e da parte di strumenti non sterili.- Usare contenitori di raccolta e mezzi colturali adeguati- Etichettare correttamente i contenitori- Compilare il foglio di richiesta con tutte le informazioni cliniche e la presunta eziologia- Contattare il Microbiologo e informare il laboratorio sulla necessità di test particolari- Trasportare in tempi rapidi i campioni al laboratorio competente

SIGNIFICATIVITÀ DI UN CAMPIONEUn campione biologico lo definiamo SIGNIFICATIVO quando avremo rispettato tutte le regole e quando ho scelto il corretto metodo di campionamento.

QUANTITÀ ADEGUATA Un tampone fecale può non essere sufficiente in un’indagine microbiologica, è sempre meglio avere tutta la massa in modo da fare prelievi in più punti è una massa che diluisce i microrganismi quindi ne servono grandi quantità.Un tampone faringeo invece può essere sufficiente per rilevare la presenza di streptococcus pyogenes se fatto esattamente sopra la placca visibile.

GRADO DI CONTAMINAZIONE DEL CAMPIONE DA PARTE DI FLORA MICROBICA PRESENTEEscreato: ciò che viene espulso con la tossa. Può contenere saliva, muco o qualcosa proveniente dalle basse vie respiratorie. Come si distinguono escreato e saliva? Facendo una colorazione al microscopio: infatti la saliva è ricca di cellule di sfaldamento e flora microbica normale questo campione non è adeguato perché non ci interessa. Invece se l’escreato deriva dalle basse vie respiratorie sarà poco ricco di cellule di sfaldamento ma sarà ricco di granulociti e microbi se si tratta di infezione.Stessa cosa per un campione di urine (mitto intermedio).

MODALITÀ DI TRASPORTO ADEGUATE ASSENZA DI TRATTAMENTO ANTIBIOTICO IN CORSO AL MOMENTO DEL PRELIEVO NOTIZIE CLINICHE SIGNIFICATIVE

2

ITER CLASSICO DI INDAGINE MICROBIOLOGICA

Sul campione biologico posso fare osservazione al microscopio:- Direttamente- Con colorazioni- Con colorazioni differenziali

Dipende da dove ho preso il campione: ad esempio nella massa fecale non posso osservare batteri, ma al massimo i protozoi. In un liquido sterile come liquor posso anche cercare direttamente batteri. Se cerco micobatteri, con la colorazione di Ziehl Neelsen già posso fare diagnosi a microscopio.Test di identificazione rapida: ad esempio valutare la capacità emoagglutinante, basta mezz’ora per individuare l’agente patogeno.

TECNICHE DI SEMINA SU PIASTRA1. Risospendere la brodocoltura2. Sterilizzare l’ansa sul bunsen3. Prelevare i batteri4. Strisciare i batteri sulla piastra contenente il terreno di crescita solido

In alcuni campioni potrei aver una quantità di microbi elevata e quindi non riesco a contare, ad esempio nelle urine. Faccio allora il metodo di diluizione per riuscire a raggiungere un numero contabile di colonie (unità formanti colonie), dove una colonia visibile è formata da circa 105 batteri.

3

TERRENI DI COLTURACOMPONENTI DEI TERRENI COLTURALI PER BATTERI

TERRENI DI USO COMUNE

TIPI DI TERRENI• NON SELETTIVI : crescita di molte specie; ricchi di fattori nutritivi.

4

o PLATE COUNT AGAR: permette la crescita di un ampio spettro di batteri senza particolari esigenze metaboliche.

• Di arricchimento : favoriscono la crescita di una specie, ma non inibiscono lo sviluppo di altre• Differenziali : contengono sostanze che permettono di differenziare tra specie microbiche (es. indicatori di pH).

o C.L.E.D. AGAR: per la conta e la differenziazione dei germi urinari. L’indicatore di pH (Blu di bromotimolo) permette di differenziare i batteri lattosio fermentanti dai non fermentanti.

o COLUMBIA AGAR SANGUE: (differenziale-non selettivo) per l’isolamento e l’identificazione di batteri più esigenti ed emolitici (Streptococchi, Pneumococchi e Stafilococchi emolitici).

• Selettivi : contengono sostanze (es. antibiotici) che inibiscono la crescita di alcune specie, ma che sono tollerate da altre.

o ENTEROCOCCOSEL AGAR: per l’identificazione degli Streptococchi di gruppo D (enterococchi). Contiene terreno base agar, esculina e cloruro di ferro. L’idrolisi dell’esculina indotta dagli enterococchi determina la precipitazione del ferro e l’annerimento del terreno.

• Selettivi-differenziali o MANNITOL SALT AGAR: usato per isolare gli Stafilococchi. Inibisce la

crescita dei Gram- per la presenza di NaCl 7,5%. Mette in evidenza Stafilococchi mannitolo-fermentanti (es. S. aureus) per viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo vira al giallo in presenza di radicali acidi) presente nel terreno.

o MACCONKEY AGAR: per l’identificazione degli enterobatteri. Contiene lattosio e un indicatore di pH (rosso neutro) per l’identificazione di batteri lattosio-fermentanti (es. E.coli, Klebsiella). Il terreno contiene anche cristalvioletto (selettivo verso i gram +) e sali biliari (selettivi verso i gram- diversi dagli enterobatteri).

o EBM LEVINE AGAR: per l’isolamento e l’identificazione di enterobatteri. Contiene eosina che inibisce la crescita dei GRAM+ e un indicatore di pH (Blu di Metilene) che permette di differenziare gli enterobatteri lattosio fermentanti (E. Coli) da quelli non fermentanti (Salmonella e Shigella).

5

SABOURAUD AGAR: TERRENO POVERO (manca di fattori di accrescimento); a volte è supplementato di glucosio e di antibiotici per ridurre l’inquinamento batterico). Ha un pH pari a 5,6. Permette lo sviluppo di lieviti e muffe.AGAR CIOCCOLATO: TERRENO BASE a cui è stato aggiunto sangue sterile, riscaldato a 80°C in agitazione fino a quando il sangue assume colorazione marrone (sangue cotto). Permette l’isolamento di microrganismi esigenti ( Neisseria, Brucella, Haemophilus)Es: Terreno Thayer Martin Agar; dopo sterilizzazione si aggiunge un complesso di fattori di accrescimento labili al calore e una miscela di antibiotici quali vancomicina, colistina, nistatina inibenti rispettivamenete gram+, gram- e miceti.

ANALISI DI ESCREATO E BRONCOASPIRATO

Subito posso fare un esame microscopico a fresco oppure una colorazione (gram o Ziehl).A questo punto posso andare a seminare su terreni selettivi e differenziali:

- Agar- Mannitolo salt agar- Agar cioccolato - Sabouraud agar: è un terreno di coltura per la candida albicans, viene sempre fatto.- MacConkey agar

6

ANALISI DI FECI

Coprocoltura: possono subito ricercare a fresco i protozoi tramite esame microscopico a fresco (non faccio colorazioni perché è inutile). Metto su terreni selettivi e differenziali; posso farlo direttamente o prima metterli in un terreno selettivo-differenziale (brodo selenite per le salmonelle).Si mettono poi solitamente su quattro terreni:

- Hektoen- macConckey agar- Sabouraud agar- Yersinia soltanto in casi particolari

COLORAZIONI

7

ESAME MICROSCOPICO A FRESCOÈ utile per determinare il n° e la % dei neutrofili polimorfonucleati come indice di entità e tipo di risposta immunitaria all’infezione infiammatoria.Evidenzia la presenza di batteri (aer./anaer.), forme a lievito, parassiti ed inclusioni virali.Preserva la mobilità dei microrganismi ed è utile per osservare le Spirochete e le endospore.

1. Preparazione del campione in soluzione fisiologica oppure in soluzione contenente lugol o in soluzione contenente idrossido di potassio (scinde la cheratina, serve per scovare i funghi) o in inchiostro di china, in base a quello che voglio cercare.

2. Metodo della goccia pendente: serve per verificare la mobilità dei microrganismi. Capovolgere il vetrino portaoggetto sul coprioggetto in modo che goccia e centro del vetrino corrispondano. Capovolgere i due vetrini ed osservare al microscopio.

3. Osservazione in campo oscuro: serve per vedere microrganismi molto esili, invisibili in campo chiaro e di difficile colorazione. un esempio è treponema pallidum responsabile della sifilide: faccio il campione dai granulomi in caso di sifilide, e solo in campo oscuro si possono vedere questi batteri perchè sono molto stretti di diametro (sono lunghi, stretti, spiraliformi).

8

4. Reazione di rigonfiamento cellulare di Neufeld: metto il campione (es liquor) a contatto con Ig anti-capsula ad esempio (es emofilus influenza quando infetta fa sempre la capsula); se le Ig si legano, vedo un rigonfiamento della capsula.

La ricerca di protozoi a fresco è totalmente dipendente dal soggetto che guarda al microscopio; quelle più comuni come le cisti di Giardia sono facilmente individuabili da tutti gli operatori, mentre per quelle più particolari bisogna inviare i campioni a laboratori specializzati.

TECNICHE NON COLTURALIEsistono tecniche non-specifiche per la rilevazione di prodotti microbici: Gli acidi grassi, prodotto finale del metabolismo degli anaerobi, possono essere rilevati nei campioni fluidi (es. pus, sangue) mediante cromatografia liquida a gas (GLC).Rilevazione antigenica: rilevazione di antigeni solubili di natura zuccherina per agglutinazione di particelle di lattice rivestite di anticorpo o di globuli rossi.Es:

- Capsula di S. pneumoniae - Capsula di Haemophilus influenzae di tipo b - Capsula di Neisseria meningitidis- Capsula di Cryptococcus neoformans- L’antigene di gruppo di S. pyogenes nei tamponi della gola

Rilevazione di antigeni particolari mediante legame ad anticorpi marcati con: radioisotopi, enzimi o molecole fluorescenti (es ELISA per l’epatite B e i rotavirus).

9

Rilevazione di tossine (eso e endo).

10

ANTIBIOTICO-RESISTENZAINDIRIZZI DI INDAGINE

1) Corretto approccio diagnostico: un uso appropriato degli antibiotici inizia dalla diagnostica.2) Indirizzo profilattico-terapeutico: terapia antibiotica mirata, eseguendo test di sensibilità ma anche per

individuarne la resistenza. Deve essere fatto sia sul singolo paziente.3) Deve essere riportato in un approccio sistemico, che è quello della sorveglianza epidemiologica. Tutti gli ospedali

devono tenere questi protocolli di sorveglianza epidemiologica, i quali sono mantenuto anche a livello nazionale e mondiale programmi europei e dell’OMS perché la resistenza agli antibiotici è una emergenza sanitaria e bisogna evitarne la sua espansione.

INDIRIZZO PROFILATTICO-TERAPEUTICOI test di sensibilità vengono fatti in vitro, ma l’efficienza dell’antibiotico è in vivo, ossia deve agire nel sito di infezione enorme differenza perché in vivo è molto diversa la situazione.Posso fare sia test qualitativi che quantitativi: sono parametri di valutazione diversi, che vanno da una valutazione qualitativa meno precisa a una valutazione quantitativa più precisa che dà vita a un valore numerico che viene considerato a livello mondiale come VALORE DI BREAK POINT.

La terapia antibiotica si può somministrare a caso o in modo razione, ossia mirata e ragionata. Per fare una terapia antibiotica mirata devo fare:

- Isolamento in coltura- Antibiogramma (sensibilità)- Valutazione delle condizioni generali dell’ospite- Distretto corporeo interessato: l’antibiotico deve raggiungere questa precisa sede anatomica in una quantità pari

al break point, perché se minore avrò una riduzione dell’invasione batterica solo parziale.

Tra la sensibilità e la resistenza a un antibiotico c’è anche una condizione intermedia: sono antibiotici che hanno un valore di sensibilità leggermente sopra al break point ma non troppo da essere resistenti.

QUALI TEST DI SENSIBILITÀ?Il metodo classico è l’ANTIBIOGRAMMA: è un test per determinare la sensibilità batterica ai farmaci antibatterici. Esistono due metodi principali:

- Test dell’agar-diffusione (KIRBY-BAUER): è una metodica qualitativa. Su una piastra con idoneo terreno solido si posiziona uno strato omogeneo di un’unica colonia isolata. Si posizionano dischetti imbevuti di antibiotico; il dischetto libera per diffusione l’antibiotico e man mano che il raggio aumenta la concentrazione antibiotica diventa sempre più bassa. Dopo un periodo di incubazione, gli antibiotici sensibili avranno generato un alone di inibizione, il cui diametro è un parametro numerico: si sceglie l’antibiotico con alone di inibizione maggiore, perché ne bastano quantità ridotte.

- TEST MEDIANTE DILUIZIONE: è una metodica quantitativa; Il metodo più corretto per determinare l’efficacia di

un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico, la concentrazione minima inibente (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC). Gli antibiotici che hanno una MIC alta per una determinata specie batterica non devono essere usati: ossia mi serve una concentrazione alta per inibire la crescita batterica ed è difficile che nel sito preciso di infezione io riesca ad ottenere una concentrazione così alta.

11

In questi test, la sensibilità del microrganismo viene valutata in base alla crescita o meno in un terreno di coltura - solido o liquido - contenente diverse concentrazioni dell'antibiotico (concentrazioni scalari).

Breakpoint: è un consenso della comunità scientifica per sostenere l’uso ponderato e intelligente degli antibiotici. Esistono due valori di breakpoints se si considerano tre categorie di interpretazione (ossia sensibile, intermedio e resistente) o un solo breakpoint se si considerano solo due categorie di interpretazione.

Vengono definiti selvaggi (WILD TYPE) quei ceppi batterici che non possiedono meccanismi di resistenza acquisiti nei confronti di una determinata classe di antibiotici. La distribuzione delle MIC di un antibiotico nei confronti dei ceppi selvaggi per le diverse specie corrisponde ad una curva gaussiana.

12

DIAGNOSTICA VIROLOGICADa riprendere dal corso scorso.

Quando cerco un virus posso cercare:- Virus: isolamento con tecniche colturali, dipende da cosa sto cercando. Coltivare virus tuttavia è molto difficile

indagine colturale.- Parti di virus: sono le indagini molecolari. Quella che funziona meglio è la ricerca del genoma tramite PCR o

realtime-PCR.- Ricerca di antigene virale, una proteina virale codificata dal genoma virale.- Sierologia: ricerca degli anticorpi: questo metodo può essere usato prevalentemente con i virus ricerca della

reazione dell’ospite. Gli anticorpi sono di due tipi: IgG e IgM.

Caratteristiche di questi test: i primi hanno una specificità maggiore ma un’opportunità minore (cioè meno fattibili), mentre gli ultimi hanno un’opportunità maggiore e una specificità minore.

13

INFEZIONI DELLE VIE RESPIRATORIEIn caso di infezione virale polmonare, la somministrazione degli antibiotici non ha molto senso, se non per evitare complicanze batteriche. Bisogna invece somministrare antivirali, ma questo è possibile individuarlo solo se si fanno le corrette indagini diagnostiche.

La flora microbica normale delle alte vie respiratorie arriva fino all’orofaringe, poi progressivamente diminuisce fino al parenchima polmonare che è assolutamente sterile.Le patologie infiammatorie infettive di tutto il distretto respiratorio prendo il nome della sede specifica interessata.

Posso didatticamente catalogare i microrganismi che causano infezioni nei vari distretti: Rinite Faringite molto spesso è virale, ma solitamente si danno antibiotici: bisogna darlo solo quando è da

streptococcus pyogenes, che si vede per presenza di placche (e viene solitamente ai bambini e adolescenti). Orecchie: sono sempre batteriche Sinusiti Epiglottide Laringite Polmonite: l’infezione a livello polmonare può essere estremamente localizzata e si parla di ascesso: infezione

purulenta tipicamente da batteri che ha una morfologia molto limitata e localizzata. Si può formare ovunque.

14

Quando si prescrive una certa infezione che non è individuabile con le classiche tecniche batteriche (ad esempio da micoplasmi o chlamydia) bisogna specificare l’indagine diagnostica dell’escreato per sospetta infezione da micoplasmi. Invece il monitoraggio di funghi non richiedere una specifica richiesta da parte del clinico perché la piastra Sabouraud viene sempre fatta di routine.

CAMPIONI DISPONIBILI PER ANALISI MICROBIOLOGICHENelle alte vie respiratorie si è può fare un TAMPONE NASO-FARINGEO o un TAMPONE FARINGEO.Nelle basse vie respiratorie si può chiedere al paziente di tossire l’escreato, che si chiama ESPETTORATO; se il paziente non è in grado di tossire, si fa il BAL (lavaggio bronco-alveolare): è un metodo più efficace che serve per raccogliere un campione.

FARINGITEProcesso infiammatorio di faringe, ipofaringe, ugola e tonsille. Colpisce soprattutto soggetti in età pediatrica.Eziologia: virale o batterica (Streptococcus Pyogenes, Corynebacterium Diphteriae, Neisseria Gonorrhoeae).

EZIOLOGIA BATTERICA- Tampone faringeo con coltura su terreni selettivi e differenziali.- Test di identificazione biochimica: Ricerca di anticorpi anti-streptolisina O : se si sospetta febbre reumatica da

S.Pyogenes. faccio anche test di tipizzazione sierologica.

15

EZIOLOGIA VIRALEFARINGITE ERPETICA: malattia infettiva acuta febbrile, con comparsa di eruzioni vescicolari su diverse parti della mucosa orofaringea. Si accompagna a febbre elevata e disfagia; contagiosa e si manifesta in età giovanile.ANGINA INFLUENZALE: angina catarrale acuta diffusa, senza segni obiettivi differenziabili.ANGINA MORBILLOSA: arrossamento della mucosa faringea, dovuto alla disseminazione di innumerevoli, piccolissime chiazze di iperemia; tale esantema precede l’eruzione esantematica del morbillo e permette di porre una diagnosi precoce.VARICELLA: faringe interessata con la presenza di piccole pustole violacee a livello del velo palatino, cui seguono erosioni superficiali che guariscono rapidamente.

POLMONITEÈ l’infiammazione del distretto polmonare, che può avere molte cause, tra cui quella infettiva. Può essere di natura batterica o virale.La polmonite è tra le prime 6 cause di morte al mondo. Solamente il 20-50% di polmoniti contratte in comunità viene diagnosticato; di solito si procede con antibiotici.

Distribuzione in base all’età: - Nei bambini è quasi sempre di origine virale.- I neonati invece possono acquisirla in seguito a passaggio nel canale del parto: da clamydia tracomatis o da

streptococcus agalactiae.- Negli adulti molto spessa è batterica, o virale (influenzali o parainfluenzali) e poi diventa batterica.

Si distingue anche tra polmonite: Contratta in comunità: valutare diversi fattori come:

o esposizione agli animali (che trasmettono chlamydia psittaci)o viaggi all’esteroo alcolismo

Può essere:- Tipica: se compaiono i classici sintomi- Atipica: se compare lentamente e non è facilmente riconoscibile. Solitamente è data da micobatteri e

micoplasmi e chlamydie.

16

Contratta in ospedale (nosocomiale):o Contaminazione ambientale (condizioni concomitanti che richiedono ventilazione forzata)o Personale sanitarioo Manovre e strumentazione chirurgica

Immunocompromessi e sieropositivi: sono sempre una categoria a parte; si tratta soprattutto di virus herpetici (CMV), aspergilli e micobatteri (questi ultimi sono molto frequenti).

INFEZIONI BATTERICHE: DIAGNOSI- Coltura dell’esreato- BAL: più accurato del primo.

Si possono fare due tipi di test: coltura o ricerca di antigeni microbici. Non si escludono a vicenda, ma si possono fare entrambi: solitamente si parte da quello più semplice e veloce, ossia la ricerca di antigeni; possono però avere dei problemi di sensibilità. Quindi quando possibile faccio anche la coltura: in questo modo posso sia classificarli sia verificare la loro sensibilità agli antibiotici.

Dopo aver raccolto il campione, posso fare esami diretti: colorazione di Gram (poco utile) e colorazione di ZN, molto utile se sospetto infezione da micobatteri: una polmonite cronica da micobatteri è clinicamente molto diversa da un’altra polmonite, quindi facile da sospettare.Poi faccio esame colturale, con i soliti terreni selettivi e differenziali:

- Agar sangue per streptococchi e stafilococchi- Mannitol salt agar per stafilococchi- Agar cioccolato per Haemophylus- Sabouraud agar per fungi e miceti- MacConkey per enterobatteriacee.

Se siamo di fronte a una polmonite cronica, mi indirizzo più verso altre specie, ad esempio ricerco M. TUBERCULOSIS posso fare la Mantoux e il quantiferon e rx polmonare. Posso poi procedere con tesi di laboratorio come colorazione ZN e poi coltivazione.MICOPLASMI: La polmonite da micoplasmi ha un quadro clinico molto diverso (cronico e subdolo) e anche un quadro radiologico diverso, se si sospettano micoplasmi si fa una coltura specifica, con utilizzo di terreni specifici (sono terreni solo per i micoplasmi).

17

INFEZIONI VIRALI

I virus influenzali sono di facile identificazione, ma esistono molti altri agenti eziologici, per questo motivo sono difficili da diagnosticare anche se era già presente la PCR. Sono quindi stati identificati altri metodi diagnostici in grado di riconoscere tutti i virus presenti in quel distretto (per non fare 200 indagini diverse, sia per problemi di tempo che di soldi).Il vantaggio della PCR è che permette sia di indentificare la presenza o meno, ma anche di poterlo sequenziare: in questo modo si possono individuare eventuali mutazioni, che possono modificarne la patogenicità e la resistenza ai farmaci.

VIRUS RESPIRATORII più frequenti virus respiratori sono i VIRUS INFLUENZALI (orthomyxovirius) e VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE (paramyxoviridus). Troviamo però anche molti enterovirus, rhinovirus e gli adenovirus.

18

Tutti questi virus vengono classificati sotto la categoria “influenza”, ma in realtà si tratta di sindrome parainfluenzale, che comprende molti virus respiratori diversi dai veri virus influenzali. Considerato il numero di virus parainfluenzali (ILI, Influenzal-Like-Illness), l’efficacia del vaccino anti-influenzale è ridotta rispetto a quanto si pensa.

È importante tipizzare soprattutto i virus influenzali.Un uomo in comunità può contrarre una polmonite virale; bisogna tenere presente che potrebbe sviluppare anche una polmonite batterica da parte di batteri che solitamente non intaccherebbero un soggetto immunocompetente.Infezioni da chlamydia e mycoplasma sono le polmoniti atipiche che intaccano l’uomo in comunità.

Chlamydie: parassiti intracellulari obbligati, che danno una polmonite tipica con insorgenza subdola. La diagnostica deve essere particolare (non le individuo come i batteri normali), quindi bisogna fare una richiesta specifica; si ricerca la loro presenza tramite anticorpi o PCR (no coltura).

H5N1: Quando si sviluppa questo virus in un allevamento aviario bisogna attuare una serie di provvedimenti per limitare e bloccare l’epidemia, infatti, se c’è una eccessiva esposizione dell’uomo a questo virus potrebbe esserci un passaggio di specie. Ha una mortalità del 60% nell’uomo ed è difficile che si possa trasmettere da uomo a uomo.L’epidemia riguarda soprattutto le zone dell’asia (dove c’è una massiccia esposizione dell’uomo ai polli e scarse misure preventive).Viene continuamente monitorato perché il pericolo è che questo H5N1 ricombini e sia in grado di infettare l’uomo, portandosi dietro le stesse caratteristiche patogeniche.

H7N9: Il virus influenzale in circolo in Europa è scarsamente patogeno (causa influenza comune) ma può essere pericoloso perché può far partire altre complicazioni (come polmonite batterica) o peggiorare la condizione di un soggetto già compromesso. in un soggetto sano non ha nessun pericolo.

RSV: causa infezioni lievi nella popolazione normale, ma colpisce in modo più grave bambini (bronchiolite) e anziani/immunocompromessi (polmonite). Molto contagioso per via aerea.

HERPESVIRUS: i virus erpetici possono causare polmoniti gravi nell’ospite immunocompromesso: Citomegalovirus (CMV), Herpes Simplex 1 (HSV-1), Varicella-Zoster (VZV), Epstein-Barr Virus (EBV), Herpes 6 (HHV-6).

RICERCA DEL VIRUSQuattro possibili indagini diagnostiche:

1) ISOLAMENTO COLTURALE: solo per CMV e poi ricerca di antigeni. Per gli altri virus non viene quasi mai fatto.

2) IDENTIFICAZIONE RAPIDA DI ANTIGENI RAPID EIA (Enzymatic ImmunoAssay): sono a disposizione anticorpi che permettono di riconoscere

determinati antigeni virali (ossia proteine virali prodotte dalla cellula infettata).Consiste nel posizionamento di anticorpi su un supporto (es. carta cromatografica); il campione viene posizionato sopra e si ha l’interazione antigene-anticorpo. A questo punto utilizzo un secondo anticorpo coniugato con un enzima il quale, in presenza del suo substrato da una reazione colorimetrica reazione immunoenzimatica. Gli attuali test rapidi (es. test immunocromatografici) non sono sufficientemente sensibili per una diagnosi accurata di infezione da virus respiratori.

19

RICERCA ANTIGENICA CON ANTICORPI FLUORESCENTI: si ricercano gli antigeni direttamente sulle cellule di sfaldamento, utilizzano anticorpi o direttamente marcati o da marcare con un anticorpo secondario. Il BAL si fa in questo modo. È più specifico ma comunque non quanto la PCR.

3) TEST MOLECOLARI PER LA RICERCA DEL GENOMA VIRALE, tramite PCR: con dei primer specifici cerco sequenze geniche precise. Si tratta sempre di multiplex PCR:

o PCR endpoint: prendo un primer, amplifico per n cicli e vedo di identificarlo se è stato replicato.o Realtime PCR: permette di indentificare durante la replicazione (in tempo reale) la presenza

dell’amplificato e lo quantifica.o RT-PCR: prima si fa la retrotrascrittasi fatta dai retrovirus.

Vantaggi: Possibilità di rivelare decine di virus diversi simultaneamente Sono end-point PCR (richiedono passaggi addizionali dopo l’amplificazione) Rischio di contaminazione a causa delle procedure di rilevazione post-PCR Difficoltà nel rendere i test quantitativi Talvolta importanti problemi di sensibilità a causa della competizione durante l’amplificazione o per

l’utilizzo di protocolli comuni di amplificazione

Quando bisogna individuare un’infezione virale, bisogna tenere in considerazione la stagionalità; inizio quindi ad indagare quei virus che sono più probabili ne mese corrente.

20

21

INFEZIONI GASTROINTESTINALI

Tratto gastrointestinale (eccetto stomaco) è massicciamente colonizzato da flora microbica normale. Le feci come campione biologico sono massicciamente contaminate dalla flora microbica normale quindi devo attuare un meccanismo che elimini la massa “buona” presente nelle feci.N.B.: solo i protozoi li posso cercare con una semplice colorazione a fresco perché non ci devono essere ma non i batteri perché questi fanno parte della flora microbica normale. Mentre per la ricerca di virus sono fondamentali tecniche alternative, non di coltivazione, quali PCR o la ricerca dell’Ag. Le feci sono un campionamento molto sporco e inoltre la massa fecale è una massa molto importante. I campioni biologici che partono da una massa importante, devono essere fatti più volte perché potrebbe essere che il primo non sia rappresentativo (questo per feci e sangue perché sono V importanti che possono diluire il patogeno)

PRINCIPALI PATOGENI INTESTINALI

Il 1° può dare infezioni endogene che sono quasi sempre ascessi addominali (perdita continuità mucosa intestinale). Altri batteri danno infezione endogena ma di tipo gastroenterico (no perdita di continuità ma vera e propria diarrea) come clostridium difficile che appartiene al microbioma; quando l’equilibrio viene “violentato” da terapie farmacologiche come antibiotici o per alterazioni del sistema immunitario si sviluppa questa diarrea endogena.Poi ci sono una serie di patogeni che arrivano dell’esterno (che non fanno parte del microbioma) come tutti gli e.coli, salmonelle (le minori derivano soprattutto de uova/carne crude mentre maggiori sono a trasmissione interumana oro-fecale), scighelle, stafilococco, vibrio colerae e yersinia enterocolitica.

22

Nella maggior parte dei casi le infezioni gastrointestinali sono di origine virali; agente di Norwalk, enterovirus, rotavirus, virus epatite A ed E hanno trasmissione oro-fecale ma danno epatite.

CONDIZIONI PREDISPONENTI ALL’INFEZIONEGenerali:

- Diabete- Corticosteroidi- Leucopenia- Ipogammaglobulinemia- Immunosoppressione- Farmaci citotossici- Splenectomia- Malattie del collagene

Situazioni cliniche specifiche:

- Cancro (colon, utero, polmoni, leucemia)- Chirurgia gastrointestinale e pelvica- Terapia aminoglicosidica

AZIONE ENTEROPATOGENA DEI BATTERIDevo utilizzare età, sintomi e condizioni del paziente per formulare un’ipotesi diagnostica perché non si può cercare tutto, devo capire cosa è più intelligente andare a cercare.

1,2,3 sono i meccanismi patogenetici; in base a questi cambia il tipo di alterazione nella produzione delle feci.Es: DIARREA è volume eccessivo di feci quasi sempre liquide, poco muco, no sangue, pochi leucociti è patogenesi di tipo tossico (esempio vibrio colerae o e.coli enterotossici): non danno distruzione mucosa intestinale e perdita di sangue ma semplicemente alterazioni equilibrio elettrolitico a livello intestinale.DISSENTERIA: causata da e.coli enteroinvasivi, salmonelle, scighella se invadono la mucosa, la distruggono quindi ci sarà massiccia presenza di muco, sangue e può essere che le feci non abbiano un V enorme ma il problema è che sono colmi di leucociti.

23

INFEZIONI BATTERICHE

GASTRITE CRONICA ATTIVA e ULCERA PEPTICAGASTRITE: uno stato infiammatorio della mucosa gastrica associato a infezione cronica da H. pylori. Rimane asintomatica nella maggior parte dei soggetti, mentre in alcuni diviene manifesta quando compaiono complicanze quali l’ulcera peptica.ULCERA PEPTICA: lesione macroscopica della mucosa gastrica o duodenale con profondità e dimensioni definite.

Trasmissione: oro-fecaleEpidemiologia: nei paesi in via di sviluppo, l’infezione è acquisita nell’infanzia; a 20 anni l’80% della popolazione è infetta. Nei paesi ad alto tenore di vita, la prevalenza è del 40-50%.Bisogna identificare la presenza di HELICOBACTER PILORI. Questo da infezione di tipo cronico può essere non patogenetica, è una classica infezione che si può accumulare nel tempo (H.pilori nel giovane ha significato diverso rispetto che nell’80enne), ha sottotipi più/meno patogenetici, non sempre possiamo distinguerli. È chiaro che l’identificazione di H.pilori in una persona “anziana” senza sintomi non prevede una terapia. H.pilori è nascosta nel contesto del muco gastrico quindi può essere molto difficile da eliminare tramite antibiotico.

DIAGNOSI DI LABORATORIO:METODI NON INVASIVI:

TEST DEL RESPIRO: mette in evidenza l’aumentata attività ureasica a livello dello stomaco del paziente. Consiste nel far bere dell’urea marcata, questa viene metabolizzata a livello dello stomaco ed eliminata come CO2 come carbonio marcato che viene quantificato da una macchina. Viene utilizzato a scopo quantitativo perché il test ci serve soprattutto per monitorare successo della terapia. Permette di capire quanta attività ureasica era presente e quanta ne è rimasta.

SIEROLOGIA: cioè valutare la reazione dell’ospite, tramite ELISA e western blot cerco Ag contro H.pilori e contro le tossine dell’helicobacter (come antigene si usa la proteina cagA nativa). Se ci sono gli Ag probabilmente c’è infezione patogenetica a livello gastrico (negli ultimi tempi Ag si sono abbassati di sensibilità diagnostica, perché man mano che aumenta età del paziente, più Ag ci saranno quindi sarebbe eccessivo trattare tutte le persone che avevano Ag contro Helicobacter; quindi non si utilizza più molto.)

RICERCA AG FECALE NELLE FECI (HpSA): se si trova l’Ag vuol dire che l’infezione è importante a livello intestinale tanto da rilasciare helicobacter che ritrovo nelle feci. Deduco che la massa batterica sia importante quindi sarà patogenetica.

METODI INVASIVI: (biopsia) COLTURA, difficile è coltivarlo (le colonio sono piccole e mucoidi), se la coltura viene negativa ma altri test

positivi, il referto finale è positivo quindi c’è H.pilori.Incubazione della biopsia per 6-12 giorni in terreno di Dent in microaerofilia→ isolamento dei ceppi→ valutazione della sensibilità ad antibiotici e potenziale patogeno (presenza di geni cagA e vacA, produzione di citotossine).

24

Test meno sensibile rispetto a ureasi COLORAZIONE DI SEZIONI ISTOLOGICHE: indicazione importante, mi dà idea della quantità (tanti batteri

facilmente saranno patogenetici). Si usa ad esempio Gram, Giemsa. Si valuta lo stato infiammatorio della mucosa.

TEST UREASI: h.pilori produce ureasi, utilizzata sia su biopsia sia con test del respiro.Si pone la biopsia in un gel o soluzione contenente urea e un indicatore di pH. Se è presente H.pylori → ureasi catalizza l’idrolisi dell’urea → cambiamento di colore.Sensibile, specifico, poco costoso, rapido (24h)

PCR

DIARREACaratterizzata dalla presenza di frequenti evacuazioni più o meno liquide. Possono anche essere presenti nausea, vomito, febbre, dolore addominale. Caratteristica principale: perdita di liquidi con le feci.

DIAGNOSI DI LABORATORIO:Le tecniche diagnostiche sono 5:

ESAME MICROSCOPICO DELLE FECI: si fa solo per cercare protozoi come Giardia o Entamoeba (con sensibilità diagnostica minore serve anche per dire se ci sono tanti polimorfonucleati o no).

25

Problema: la Giardia Lamblia non viene eliminata in modo continuo, quindi per individuarla nelle feci sono necessari esami ripetuti. Può essere individuata anche nel sacco duodenale.

COPROCOLTURA: esame colturale delle feci.Posso chiedere una coprocoltura classica o posso fare anche una richiesta per la ricerca delle salmonelle; in questo caso le feci non vengono messe direttamente sui terreni ma prima vengono arricchite con un brodo di selenite: mezzo liquido che serve per favorire la proliferazione delle salmonelle (e delle shigelle) e favorendone l’individuazione.Quando richiedo una coprocoltura è perché cerco principalmente enterobacteriacee quindi uso terreni selettivi (perché le fanno crescere selettivamente e eliminando altri battei del microbioma che potrebbero competere per la crescita in vitro) e differenziali (valutano la capacità di questi battei di fermentare o no il lattosio, quelli che fermentano sono meno patogeni). Uso terreni come Hektoen, MacConkkey agar; viene sempre poi messo un terreno per i funghi (Sabouraud); per la Yersinia bisogna usare terreni particolari quindi deve essere fatta una ricerca specifica.

TEST RAPIDI DI RICERCA DI ANTIGENI: Non ci interessa molto ad esempio nel caso di Salmonella e E.coli e altri ceppi enteropatogeni perchè quello che ci serve è valutare la sensibilità agli antibiotici e con questo metodo non è possibile, anche se è un test veloce.

ESAME COLTURALE DEL SANGUE: per la ricerca di salmonelle, specialmente nelle prime fasi dell’infezione (fase batteriemica).

INDAGINI SIEROLOGICHE: sono indicate in due casi:o Salmonella thypi: ricerca dell’Ag somatico O e Ag flagellare H. È usato come test aggiuntivo perché crea

interferenza con la vaccinazione e dà falsi positivi e negativi.o Entamoeba Histolitica: nella dissenteria amebica, l’infezione acuta diventa subacuta, con produzione di

anticorpi. Viene usato il test di emoagglutinazione passiva: si ricercano antigeni amebici legati alla superficie dei globuli rossi, anticorpi anti-amebici, agglutinazione delle emazie.

DISSENTERIARapido instaurarsi di frequenti evacuazioni intestinali di volume ridotto rispetto a quelle osservate nella diarrea liquida e con presenza di pus e sangue. Si associano febbre, dolore addominale, tenesmo, crampi. È interessato il colon.Danni dovuti a produzione di tossine, invasione dell’epitelio e della sottomucosa.Batteri che causano dissenteria:

o Shigella dysenteriaeo E. coli enteroinvasivio E. coli enteroemorragicio Salmonella spp.o Yersinia spp.

26

o Campylobacter jejunio C. difficile: Colite pseudomembranosa; di solito complica una diarrea associatao all’uso di antibiotici

FEBBRE TIFOIDE: Malattia acuta sistemica causata dall’ingestione di cibo o acqua contaminati da materiale fecale umano infetto da Salmonella Thypi. Si instaura gradualmente:

- I settimana: batteriemia, febbre, brividi, cefalea- II settimana: coinvolgimento del sistema reticolo-endoteliale, esantema cutaneo, dolore addominale, diarrea- III settimana: malattia autolimitante; possibili complicazioni quali polmonite, endocardite, - osteomielite, emorragia intestinale per erosione dei vasi sanguigni delle placche di Peyer.

INTOSSICAZIONI ALIMENTARI O TOSSINFEZIONI ENTEROTOSSINA DI STAPHYLOCOCCUS: sono tossine termolabili, si trovano in latticini contaminati. Agiscono sul

SNC con comparsa di vomito in 3-6 ore. TOSSINE DI C. BOTULINUM: sono tossine relativamente termolabili: sono distrutte a 80°C per 30 minuti. BACILLUS CEREUS: le spore contaminano cibi diversi, agiscono in due modi diversi:

C. PERFRIGENS:

27

INFEZIONI VIRALISono circa i ¾ di tutte le diarree infettive.

Virus associati a gastroenteriti: PRINCIPALI:

o Rotaviruseso Noroviruses

ALTRI:o Adenoviruses (danno le cosiddette “influenze intestinali”).o Sapoviruseso Astroviruseso Toroviruso Enteroviruses

IN PAZIENTI IMMUNOCOMPROMESSI: o HIVo CMV, HSV, VZV

L’incubazione della gastroenterite virale ha un tempo di insorgenza molto rapido, di 12-48 ore.

ROTAVIRUSÈ la causa principale di infezione intestinale virale nei bambini, soprattutto nei bambini ospedalizzati ma non solo. È un‘infezione virale acutissima nel bambino, anche sano, causa una diarrea molto importante e molto spesso richiede ospedalizzazione perché occorre la reidratazione.Appartiene alla famiglia dei Reoviridae, non ha envelope.Diversi gruppi di rotavirus che si distinguono per la presenza della proteina VP6 (non serve sapere i gruppi).

Meccanismo patogenetico: produzione di una proteina virale, NSP4, che ha attività enterotossica causando una massiccia e acuta perdita di liquidi. Questa proteina è una enterotossina; ha anche attività citotossica perché causa massiccia distruzione della mucosa intestinale una diarrea che diventa anche dissenteria, molto grave.Esiste un vaccino, non obbligatorio, che può essere somministrato per via orale: è un vaccino vivo attenuato che è in grado di fare un ciclo infettivo naturale stimolando anche l’immunità locale (con produzione di IgA specifiche) che impediscono l’infezione da rotavirus.

NOROVIRUSÈ più ampio come spazio di età: non colpisce solo i primi anni di età come il rotavirus, ma colpisce ogni fascia d’età. È la causa principale di gastroenterici epidemiche.Fa parte dei caliciviridae, è un virus a ssRNA+ senza envelope.Si trasmette per via oro-fecale o attraverso acqua e cibo contaminati. Causa diarrea e vomito, solitamente accompagnati da febbre, dolore muscolare, crampi addominali, ritardato svuotamento gastrico. Il virus è eliminato 5-7 giorni dall’insorgenza dei sintomi.

Meccanismo patogenetico: non è conosciuto precisamente, ma è simile a quello del rotavirus. Dopo infezione, non si ha una immunità totale: dura per sei mesi ma scompare dopo due anni.

28

DIAGNOSTICAMICROSCOPIA ELETTRONICA E COLTURA CELLULARE

RICERCA DI ANTIGENISi usano anticorpi legati a particelle di lattice (Latex agglutination) e si vede se si forma precipitato. Posso usare anche test EIA: è sempre una reazione antigene anticorpo ma viene letta in modo diverso; l’anticorpo è legato a un enzima e si valuta l’attività enzimatica.La latex agglutination è più meno sensibile e specifica di EIA ma in alcuni casi viene usata.

RICERCA DI GENOMAMultiplex platforms: sono strumentazioni che inserendo il campione vanno a ricercare il DNA e fanno anche PCR.

Perché è importante fare diagnosi virale veloce?- Sorverglianza epidemiologica- Perché devo evitare di dare terapia antibiotica.- Isolamento del paziente per evitare contagi- Specifiche terapie antiemetiche e antidiarroiche o uso di immunoglobuline per il Rotavirus.-

29

MONITORAGGIO DELLE RIATTIVAZIONI DI

CMV E EBV NEI TRAPIANTIHERPESVIRUSSi dividono in tre sottofamiglie:

- Alphaherpesvirus: HSV-1, HSV-2, VZV- Betaherpesvirus: CMV, HHV-6, HHV-7- Gammaherpesvirus: EBV, HHV-8

Instaurano una infezione latente o persistente dopo l’infezione primaria. Le riattivazioni sono più frequenti nei momenti di immunosoppressione. Sia l’infezione primaria che la riattivazione possono essere molto gravi negli individui immunocompromessi.Possono causare patologie:

Acute Congenite (neonatali) Proliferative: in caso di trasformazione che porta a tumore. Riattivazione: importante negli iimmunocompromessi (AIDS e trapiantati).

CMV• Fa parte della famiglia beta-herpesvirus.

Ha un ciclo replicativo lento• Spettro d’ospite ristretto• Capacità di indurre latenza in differenti tipi cellulari• Vie di trasmissione:

o Transplacentare e neonataleo Contatto con le secrezioni (saliva e sessuale)o Trasfusioni e trapianti.

• Circa il 70% degli adulti sono sieropositivi per CMV.

PATOLOGIE NELL’ADULTOInfezione primaria: asintomatica o sindrome simil-mononucleosicaRiattivazione:nell’individuo immunocompetente è asintomatica. Nell’immunocompromesso:

- Polmonite interstiziale (Tx midollo, polmone, cuore)- Epatite (Tx fegato)- Retiniti e cecità (AIDS)- Lesioni gastro-intestinali (es. enteriti emorragiche)- Altri organi (stomatiti, pancreatiti, meningoencefaliti, pericarditi, anemie e piastrinopenie, glomerulonefriti)

RISCHIO DI INFEZIONE POST-TRAPIANTONel primo anno dopo trapianto, circa il 50-70% dei pazienti va incontro a:

Infezione primaria Riattivazione virale (se stesso ceppo con cui già si era infettato) Reinfezione (se ceppo diverso)

30

TRATTAMENTO DEL TRAPIANTATO: antivirali come ganciclovir.Diverse strategie possibili: la TERAPIA DELLA MALAATTIA può essere somministrata solo al momento di insorgenza dei sintomi, oppure può essere fatta una TERAPIA PROFILATTICA in tutti i pazienti considerati a rischio, anche senza evidenza di infezione. La terapia può essere somministrata al primo riscontro di infezione tramite test diagnostici (non di malattia) TERAPIA PRE-EMPTIVE: vantaggi:- efficace nel prevenire la malattia da CMV- non aumenta l’incidenza di malattia e mortalità- migliora la qualità di vita del paziente- riduce l’incidenza di resistenza al ganciclovir- costi ridotti

CATEGORIE DI RISCHIOIl rischio è definito in base allo stato sierologico pre-trapianto del ricevente e donatore e al grado di immunosoppressione:

BASSO RISCHIO : D- e R- MEDIO RISCHIO : D- e R+, D+ e R+. ALTO RISCHIO : D+ e R-.

Nelle categorie ad alto e medio rischio si fa la terapia profilassi, mentre nelle categorie con rischio più bassi si fa la pre-emptive se necessaria necessità di test diagnostici affidabili.

TEST DIAGNOSTICITEST SIEROLOGICI: la ricerca dell’anticorpo viene usata per definire lo stato del paziente prima del trapianto e stratificare il rischio di infezione post-trapianto.ANTIGENEMIA: si separano i polimorfonucleati dal sangue, si fissano su vetrino e si permeabilizzano, poi tramite immunofluorescenza valuto la presenza di proteine virali all’interno dei leucociti (come l’antigene pp65-CMV).CARICA VIRALE: quantificare la carica virale consente di prevedere la probabile progressione verso la malattia basandosi sul valore assoluto e sulla velocità di crescita della carica virale stessa. Si guarda la DNAemia quantitativa (o viral load) tramite:

- PCR qualitativa- PCR quantiativa end-point- mRNA- real-time PCR

31

L’aumento della DNAemia nel sangue precede generalmente la comparsa della malattia da CMV; la replicazione di CMV può essere valutata quantificando la DNAemia. Se si arriva al valore soglia di 2000 copie/ml bisogna trattare il paziente.La terapia pre-emptive si basa sulla quantificazione della DNAemia nel sangue; l’inizio della terapia è guidato da un valore soglia.

EBV• Fa parte della famiglia gamma-herpesvirus.• Tropismo: linfociti B e cellule epiteliali• Latenza nei linfociti B memoria• Capacità di immortalizzare i linfociti B• Circa il 60-90% degli adulti sono sieropositivi per EBV.

PATOLOGIE1. Mononucleosi infettiva2. Linfoma di Burkitt3. Carcinoma nasofaringeo4. Leucoplachia orale (in AIDS)5. Polmoniti interstiziali croniche (in AIDS)6. Mononucleosi infettiva cronica7. Sindrome linfoproliferativa X-linked8. Malattie linfoproliferative e linfomi negli immunocompromessi (linfomi in AIDS; PTLD nei trapiantati)

RISCHIO DI INFEZIONE POST-TRAPIANTO

Frequenza generale: circa 1-10% dei pazienti trappiantati.Maggior frequenza in trapianti di intestino, trapianti di cuore/polmoni e trapianto di midollo alllogenico.Molto elevata in pazienti sieronegativi per EBV prima del trapianto; in questi casi si manifesta entro il primo anno, mentre nei pazienti già precedentemente sieropositivi si manifesta anche dopo diversi anni.

TERAPIA PER TRAPIANTATI: possibile il TRATTAMENTO DELLA MALATTIA (al manifestarsi dei sintomi) e TRATTAMENTO PRE-EMPTIVE al primo riscontro di infezione tramite test diagnostici.

VALUTAZIONE DEL RISCHIO: monitoraggio della viral load di EBV.

32

HIVDIAGNOSIINDAGINI SIEROLOGICHE:Per HIV le indagini sierologiche vengono usate come prima diagnosi, mentre per il monitoraggio dello stato di viremia di un soggetto si usa la misura dell’RNA.

- Ricerca di anticorpi totali- Riicerca di singole frazioni anticorpalli

BIOLOGIA MOLECOLARE:- MISURA DELL’RNA VIRALE: viene usato per la prognosi e il monitoraggio dello stato di viremia, viene fatto

periodicamente, ogni 3 mesi (insieme alla conta dei CD4). Una diminuzione di 3 volte (0,5 log) della viremia indica attività antivirale soddisfacente; un aumento della viremia di 3 volte (0,5 log) indica invece fallimento della terapia. Il ritorno della viremia a livelli pre-terapia in un soggetto trattato indica l’insorgenza di resistenze ai farmaci utilizzati e la necessità di una modifica dello schema terapeutico.

- ANALISI DELLE MUTAZIONI VIRALI

ANALISI DELLE MUTAZIONI VIRALIL’insorgenza di mutazioni è alla base della resistenza ai farmaci: un clone sviluppa una mutazione che è in grado di resistere ai farmaci e questo porta a un aumento della viremia plasmatica anche con l’assunzione di farmaci.Il virus non può essere eliminato, quindi la terapia è a vita: la diagnostica non serve solo per verificare che il virus non ci sia più e quindi smettere l’assunzione di farmaci, ma serve per identificare eventuali resistenze.

Resistenza= mutazione dell’enzima bersagliato dal farmaco, in particolare delle polimerasi e proteasi virali.Nel paziente resistente, con la PCR amplifico il genoma del virus presente (che sarà principalmente il ceppo resistente). Con tecniche di biologica molecolare identifico la o le mutazioni, attraverso valutazione del genotipo:

- Sequenziamento: ottengo la sequenza completa poi la confronto con il wild type.- Tecniche di ibridizzazione come LiPA HIV-1: utilizzo degli assay di ibridazione. Utilizzo dei probes

(complementare alla catena di DNA che viene amplificata con PCR) che hanno una serie di mutazioni, quindi vado a vedere che mutazione è presente in base al probe che si complementa al DNA.

Posso andare a fare indagini più specifiche andando a valutare il fenotipo: è una procedura molto costosa perché prevede la coltivazione di HIV, quindi è difficile. Si usa più per scopi di ricerca rispetto a scopi diagnostici e terapeutici.Viene quindi sempre analizzato il genotipo rispetto al fenotipo.

33

INFEZIONI DEL SANGUENel sangue possono essere presenti anche una serie di infezioni batteriche oltre che virali. Parliamo di diagnostica di infezioni batteriche nel sangue.

Differenza tra batteriemia e setticemia:- BATTERIEMIA: presenza di batteri nel sangue, che possono essere asintomatici o paucisintomatici (come

febbre). La batteriemia è indispensabile per la disseminazione del batterio nell’organismo.Es: N. meningitidis da orofaringe e alte vie respiratorie possono fare la capsula che li protegge dal sistema immunitario; danno una batteriemia asintomatica (o poco), che permette ai batteri di superare la BEE e dare meningite. Solo a questo punto diventa sintomatico.

- SETTICEMIA: è presenza di batteri nel sangue tale per cui causa sintomi importanti; è quindi sintomatica. È una condizione molto grave che può portare a morte l’individuo.

La ricerca di batteri nel sangue dovrebbe essere fatta presto, quando è ancora batteriemia.Se siamo in fase di batteriemia, la concentrazione microbica non è così alta, allora le indagini devono essere mirate a individuare questi batteri anche quando sono in quantità bassa.

TIPI DI INFEZIONI DEL SANGUEI batteri che stanno nel sangue hanno origine:

- INTRAVASCOLARE: l’infezione è partita dal circolo sanguigno e vi sono entrati tramite cateteri, per via artificiale.- EXTRAVASCOLARE: l’infezione è in altra sede e si è riversata nel circolo.

Quali sono gli organismi che isoliamo nel sangue?1) Stafilococchi: Auerus sono flora microbica normale della cute.2) E. coli3) Candida albicans4) Pseudomonas aeruginosa

Quelli responsabili di infezioni intravascolari?Il principale è lo Staphilococcus Epidermidis. Siccome si trova sempre sulla cute, non è mai facile stabilire se ha realmente causato una batteriemia o si tratta solo di contaminazione del campione.Anche le Salmonelle sono in grado di causare infezione intravascolare.

DIAGNOSI DI BATTERIEMIACome prima cosa faccio EMOCOLTURA (o indagine colturale): è un’indagine molto lunga, che prevede la crescita di batteri su un terreno di coltura (almeno 24 ore). Se la carica batterica è bassa (ed è anche diluita in n litri di sangue) ci voglio anche più giorni.Sono le più efficienti, perché se anche i batteri sono pochi, con il giusto tempo crescono e li posso analizzare. Inoltre, coltivare i batteri è importante perché posso fare i TEST DI SENSIBILITÀ AGLI ANTIBIOTICI.In soggetti che hanno una batteriemia alta, può rapidamente diventare setticemia, quindi le analisi sono urgenti. In questi soggetti si fanno parallelamente all’emocoltura (che deve sempre essere fatta) anche test più rapidi: INDAGINE MOLECOLARE vado ad individuare la presenza di genoma nel sangue tramite Realtime-PCR.

EMOCOLTURA CLASSICANon è stata superata, ma è stata abbinata all’indagine molecolare, ma viene comunque sempre fatta. Si prende un campione di sangue e lo si mette a contatto con terreni che permettano la crescita di eventuali batteri presenti.Si prende un volume di sangue del paziente e si dispensa in una serie di bottiglie, ognuna con un terreno diverso. I flaconi contengono:

- Terreno di coltura liquido arricchito- Composto che lisa leucociti- Anticoagulante (SPS)

34

- Resina che lega e neutralizza antibiotici eventualmente presenti.Queste bottiglie vengono messe in un termostato particolare (BACTEC): se ci sono batteri questi crescono, attivano un metabolismo e producono CO2, che viene registrata da un substrato presente nelle bottiglie, che emetta fluorescenza e viene letta in realtime dal termostato.

PRELIEVO: deve essere fato rispettando tutte le regole di sterilità. È importante che venga fatto alla comparsa del picco febbrile. Si fa più di un prelievo (2 o 3), vengono fatti nel giro di 24 ore o a distanza di poche ore. Questo è importante perché sto cercando la batteriemia ancora con bassa carica microbica (nelle prime fasi) quindi in questo modo aumento la probabilità di beccare l’infezione, qualora presente.

Se il termostato BACTEC rileva fluorescenza, significa che il campione si è positivizzato; in base alla bottiglia posso già individuare più o meno che batterio può essere (in base al terreno di coltura) ma non è una certezza diagnostica.Per fare diagnosi posso fare:

- Indagini più veloci: colorazione GRAM e esame microscopico. Si comunicano subito i risultati in reparto perché si può iniziare subito la terapia.

- PNA FISH: si utilizzano sonde ibridate dirette al DNA di determinati ceppi batterici.- Indagini più lente: subcoltura con terreni solidi selettivi e differenziali per poi poter fare antibiogramma

(necessita di altre 24-48 ore).

DIAGNOSI DI SEPSILa coltura va a identificare solo i batteri liberi e presenti all’interno dei leucociti, mentre la PCR riesce ad identificarli tutti (anche quelli morti e il DNA libero).Si usa un test rapido con real-time-PCR chiamato LightCycler SeptiFast: serve sia per batteri che per funghi. È in grado di identificare gli agenti eziologici che principalmente causano sepsi, ma non è in grado di identificare tutti i microrganismi.Questo sistema non va a sostituire la coltura e l’antibiogramma, si fai n parallelo per velocizzare la diagnosi.

35

INFEZIONI DEL SNCIn base al distretto anatomico interessato, distinguiamo tra:

MENINGITE: infezione diffusa ENCEFALITE: infezione diffusa. ASCESSO CEREBRALE: è un’infezione localizzata.

MENINGITE Infiammazione delle meningi, tre sottili membrane che rivestono l’encefalo e il midollo spinale.I microrganismi raggiungono il SNC, sito normalmente sterile, tramite diverse vie:

- Viremia o batteriemia- Ingresso diretto dal tratto respiratorio superiore o cute (frattura cranica)- Passano intracranico attraverso una venula dal nasofaringe- Diffusione dal focus contiguo di infezione (seni paranasali, ascesso cerebrale, …)

MENINGITE BATTERICA: non è solo causata dalla N. MENINGITIDIS, quindi bisogna chiarire che ci sono tante altre cause, tra cui S. PNEUMONAE e HAEMOPHILUS.

MENINGITE VIRALE: può derivare ad esempio da una parotite, può dare sequele neurologiche a vita.Il più frequente è ENTEROVIRUS.La diagnostica è difficile perché sono molti; sono tutti virus che danno entrano per via oro-fecale, si replicano nell’intestino e danno viremia, attraverso cui possono raggiungere anche il SNC.

Importanti gli HERPES: quando si riattivano nei neuroni possono dare anche encefalite. Bisogna sempre chiedersi se è un’encefalite erpetica o no: questo è importante perché abbiamo una buona disposizione di farmaci, mentre per gli altri tipi abbiamo meno disponibilità di farmaci.

36

DIAGNOSIIl paziente ha sintomi neurologici molto generici e sospetto una infezione. Il prelievo è sempre LIQUOR, ma posso analizzare anche il SANGUE (perché vi passano per raggiungere il SNC).

Il liquor viene prelevato con una puntura lombare e deve subito essere inviata in laboratorio: in questo modo vado ad analizzare il numero di leucociti. Siccome il liquor è ipotonico, i leucociti possono esplodere quindi bisogna fare analisi velocemente.Su liquor posso fare:- Indagini chimico-fisiche : posso valutare una serie di parametri chimici che possono essere molto importanti da un

punto di vista diagnostico. Dosiamo:o Proteine e glucosio: hanno un range che varia in base all’età, ma varia notevolmente in caso di infezioni; in più

mi indica anche se l’infezione è batterica, fungina o virale.Proteine aumentanoGlucosio: si riduce se sono batteri o funghi perché consuma glucosio, rimane invariato se infezione virale.

o Numero di leucociti e linfociti: se l’infezione è da funghi e virus troviamo soprattutto linfociti, se è da batteri troviamo soprattutto neutrofili.

- Indagine microscopica : posso andare a fare centrfugazione e a analizzare il sedimento del liquor: posso fare colorazione di gram (infatti non dovrebbero esserci batteri, se ne individuo con gram allora individuo molto velocemente infezione). Faccio anche colorazione di Zhiel-Neelsen per i micobatteri.

- Ricerca di antigeni batterici : utilizzando la reazione antigene-anticorpo. È una procedura veloce e è un approccio diagnostico importante, ma non bisogna fermarsi qui.

- Coltura : si fa sempre, dà una diagnosi sicura al 100%. In più posso anche fare antibiogramma per verificare la sensibilità agli antibiotici, faccio terapia antibiotica mirata.

37

DIAGNOSI VIRALE: si possono fare colture cellulari, adatte soprattutto per l’isolamento degli enterovirus. Molti virus sono difficilmente coltivabili in colture di cellule, in particolare coxsackie A. In questi casi si dovranno utilizzare le indagini sierologiche per evidenziare un movimento anticorpale nei confronti degli antigeni di gruppo degli enterovirus.Un’altra metodica è la PCR valida per HSV e enterovirus.

ENCEFALITEDiagnosi tramite prelievo di LCR e biopsia cerebrale.

ASCESSO CEREBRALEProvocato dalla presenza di microrganismi virulenti in un’area cerebrale ischemica o devitalizzata per danni pregressi. I microorganismi più frequentemente isolati sono: streptococchi, funghi, enterobacteriaceae, batteri anaerobi, staphylococcus aureus.Per via della posizione localizzata e per la presenza di pus, è individuabile tramite indagine radiografica.

38

INFEZIONI DEL TRATTO GENITALEInfezioni diffusissime, il distretto genito-urinario è porta di entrata per una serie di infezioni che possono anche non essere solo genitali ma sistemiche es HIV ma anche batteri come sifilide o gonorrea. Uretrite: sia maschile che femminileVaginite, cervicite, endometrite tipicamente femminili.Orchiti, prostatiti tipicamente maschili. Le vie urinarie, a parte la porzione esterna, sono uguali in maschio e femmina, quindi entrambi hanno uretra-vescica-uretere-reni.Le infezioni genitourinarie partono quasi sempre dall’esterno, tendono ad essere ascendenti quindi risalgono: nella femmina questo è pericoloso perché possono raggiungere utero e salpingi, dove può dare salpingite che se tende a cronicizzare può diventare molto pericolosa per la funzionalità d’organo portando addirittura alla sterilità.Le infezioni ascendenti del distretto urinario possono essere molto pericolose, arriva al rene e diventa pielonefrite che è condizione grave: può provocare insufficienza renale che se cronicizza può portare a dialisi/trapianto. Oltre ad essere ascendenti, le infezioni possono diventare sistemiche es HIV o invece danno un’infezione locale es gonorrea, sifilide. Alcune infezioni danno infezioni localizzate, nel punto in cui arrivano (cioè nel distretto genitale).

PATOLOGIE A TRASMISSIONE SESSUALEAlcune di queste infezioni si manifestano con una patologia specifica.

Chlamydia Papillomavirus Herpesvirus Funghi: candida Albicans (soprattutto nel distretto genitale femminile). HIV e epatite B usano le vie genitali per entrare ma non si localizzano qui, quindi non le prendiamo in

considerazione per la diagnostica.

39

DIAGNOSTICAHo più campionamenti possibili a disposizione:

- TAMPONE vaginale, uretrale, cervicale, anale, …- URINE: se sono infezioni delle vie urinarie. Soprattutto nell’uomo passano anche nel distretto genitale quindi

possono essere utilizzate anche per indagini dell’apparato genitale, più ad ampio spettro.- CAMPIONE SEMINALE

COSA CERCO?La diagnostica dell’apparato GU è complicata perché possono essere tanti tipi di microrganismi; per semplificare, si fa una indagine mirata sulla clinica: alcune infezioni causano delle lesioni molto tipiche, oppure secrezioni purulente (gonorrhoeae), …Difficilmente si Ha una indagine colturale generica. Se l’organo è intatto e non ci sono state lesioni, interventi, tumori, le infezioni sono quelle classiche da trasmissione sessuale.

GONORREALa N. GONORRHOOEAE è un diplococco che cresce su agar cioccolato.

- Localizzata : si cerca nel distretto genitale o orofaringeo. Nella donna è più difficile arrivare a sospetto perché è meno clinicamente evidente (nell’uomo produce pus), e si cerca con tampone vaginale.

- Sistemica : se diventa sistemica (dovrebbe essere diagnosticata nella prima manifestazione) posso cercarla in vari distretti: cute, sangue, articolazioni.

La donna infettata in gravidanza e che replica microrganismi è a rischio: se replica in grandi quantità nel canale del parto il bambino si può infettare. INFEZIONI PERINATALI: infezione che il bambino acquisisce:

Durante la gravidanza Nel passaggio del canale del parto Durante l’allattamento.

Il feto si può infettare anche con il contatto con materiale fecale, soprattutto in parti molto movimentati (con lunghi tempi di travaglio). In questo caso il bambino può andare incontro a polmoniti o setticemie da E. coli.

DIAGNOSIDiagnosi facile, si fa sempre:

- Tampone genitale e striscio su vetrino: con colorazione di gram si cerca di individuare diplococchi. Ha maggior sensibilità se si tratta di essudato purulento, ed è maggiormente sensibile nell’uomo che nella donna. Non si fa per soggetti pauci o asintomatici.

- Diagnosi colturale: su terreno di agar cioccolato con vancomicina (inibitore dei gram+). Più sensibile anche ocn altri tipi di tampone e anche in soggetti pauci o asintomatici.

SIFILIDEÈ più complicata. È data dal T. PALLIDUM che non è coltivabile su terreni di coltura.

STADI DI PROGRESSIONE DELLA SIFILIDE: Sifilide primaria : Papula dura non dolorosa sui genitali esterni, nella zona anale o sulle labbra, che si ulcera e

guarisce in 4-6 settimane. Il T. pallidum è osservabile al m.o. La linfoadenopatia persiste per mesi. Sifilide secondaria : è la fase di batteriemia; si sviluppa 4-6 settimane dopo la fase primaria. Lesioni cutanee

generalizzate multiple maculo-papulose infettanti, con adenolinfopatia generalizzata non dolorosa. Un terzo dei casi guarisce, i rimanenti vanno in fase di latenza.

Sifilide latente : è asintomatica; Comprende due fasi: latente precoce (fino al secondo anno dall’infezione primaria; il pz è ancora infettante), latente tardiva (dal secondo anno dopo l’infezione primaria; il pz si immunizza alle recidive e diventa resistente a infezioni esogene).

Sifilide terziaria : presenta lesioni vascolari, nervose e lesioni granulomatose (gomme) a livello di cute, ossa, articolazioni e fegato.

40

Sifilide congenita: Dal 4’ mese di vita il feto è suscettibile all’infezione treponemica. Le lesioni possono essere tali da provocare aborto o generare un quadro simile alla sifilide secondaria dell’adulto con interessamento di occhi, meningi, ossa, cute, fegato.

DIAGNOSINon si fa l’indagine colturale perché non cresce nei normali terreni per batteri; cresce inoltre molto lentamente.

1. MICROSCOPIA IN CAMPO OSCURO: con impregnazione argentica riesco a individuare la forma delle spirochete. È il metodo elettivo per una diagnosi primaria precoce.

2. IMMUNOFUORESCENZA individuo la forma delle spirochete.3. INDAGINE SIEROLOGICA: metodo più usato per fare diagnosi. L’infezione ha un periodo di incubazione molto

lungo in cui parte la risposta anticorpale. Comprende:a. TEST DI SCREENING NON TREPONEMICI : utilizzo antigeni che sono simili e crossreagiscono con gli

anticorpi anti-treponema (RPR e VDRL). Sono però a basa specificità (possono dare falsi positivi), quindi se viene positivo faccio poi test con antigeni del treponema (più costosi ma molto più specifici).La positività di questi assay dipende anche dal tempo di infezione: il VDRL diventa positivo dopo 3-5 settimane dopo infezione e si negativizza dopo terapia, mentre gli altri rimangono positivi anche dopo terapia.

b. TEST DI CONFERMA TREPONEMICI : si utilizzano antigeni del treponema (FTA-ABS e TPHA), ottenuti tramite coltura in testicolo di coniglio. Sono molto sensibili e molto specifici. Si fa prima ELISA e poi si conferma con WESTERN BLOT.

ULCERA VENEREAUlcera genitale dolorosa con adenopatia suppurativa. È causata dall’HEMOPHILUS DUCREY; periodo di incubazione di 3 settimane.DIAGNOSI: isolamento colturale su agar sangue.

La lesione più comune è quella da HSV ma le vescicole erpetiche sono ben riconoscibili. Alcuni tipi di batteri come haemophilus ducreyi e chlamydia trachomatis hanno delle lesioni specifiche ben riconoscibili già clinicamente (competenza di ginecologo e urologo).Verruche genitali possono essere anche dovute a papillomavirus.

LINFOGRANULOMA VENEREOInfezione da CHLAMYDIA TRACHOMATIS.Lesione genitale seguita da interessamento suppurativo dei linfonodi inguinali.

DIAGNOSINon si fa coltivazione su cellule (troppo costosa).

RACCOLTA DEL CAMPIONE GENITALE: si fa spazzolamento cervicale per 10-30 secondi con inoculo in terreno colturale. È importante raccogliere cellule endocervicali perché è un parassita endocellulare obbligato.

ISOLAMENTO COLTURALE: consente di individuare anche infezioni a bassa carica batterica, ma sono tecniche costose perché occorre una coltivazione su cellule (da soli non crescono). Permette il riconoscimento del genotipo.

RICERCA DI ANTICORPI: danno infezioni di tipo cronico quindi il soggetto sviluppa anticorpi. ESAME ISTOLOGICO: si ricercano i corpi elementari (zone intracellulari di replicazione batterica) con tecniche di

immunoistochimica/immunofluorescenza/immunoenzimatica. RICERCA DEL GENOMA: non con PCR qualitativa ma quantitativa: infatti può essere presente anche in soggetti

sani in piccolissime quantità (infezione pregressa), devo vedere se l’infezione è in atto.

HERPES GENITALEAgente eziologico è HSV-2, raramente HSV-1.DIAGNOSI:

1. Clinica2. Coltivazione con cellule infettate con materiale proveniente dalle vescicole. Si osserva l’effetto citopatico e si fa

immunofluorescenza con anticorpi monoclonali.

41

3. PCR dal liquido delle vescicole.

VERRUCHE GENITALI CARCINOMA DELLA CERVICE UTERINACausate da HPV.È un condiloma, è diverso da quello su mani e piedi.Ci interessa sapere se è un genotipo a basso rischio o ad alto rischio. Sono sempre genere alfa e non sono quelli cutanei, sono tutti alfa mucosali.La diagnosi posso farlo anche nelle prime fasi, prima che ci sia una lesione macroscopica, ma in fase di persistenza del virus. All’osservazione clinica non si vede nulla, ma guardando al microscopio posso trovare infezione.DIAGNOSI:

- CLINICA- ISTOLOGICA- RICERCA DEL GENOMA: lo amplifico con PCR o posso vederlo con test diretti come Hybrid Capture Test: in una

donna con infezione in atto, c’è molto genoma nelle secrezioni vaginali, in questi casi possi identificare la presenza di genoma già senza amplificare.

DIAGNOSI PER CARCINOMA: PCR GENOTIPIZZAZIONE: tramite sequenziamento o tramite RFLP. HYBRID CAPTURE TEST: ibrido il DNA con probe ad RNA. Anticorpi in fase solida catturano gli ibridi RNA/DNA;

vengono messi altri anticorpi che legano il complesso, i quali causano luminescenza. LiPA (Line Probe Assay): è una tecnica di ibridazione con sonde specifiche che lega più sequenze del DNA

amplificato, riuscendo quindi ad individuare più genotipi.

SINDROMI CLINICHE AD EZIOLOGIA MULTIPLASono infezioni generiche, che causano infiammazione; nomi diversi a seconda della localizzazione (es cerviciti).CERVICITI:

NEISSERIA GONHORROEAE CHLAMYDIA TRACHOMATIS. È la prima causa di infezione.

VAGINITI: TRICHOMONAS VAGINALIS: diagnosi si fa facendo un tampone vaginale raccogliendo l’essudato vaginale (causa

leucorrea); si mette su striscio colorato con lugol e si fa indagine microscopica diretta essendo un protozoo: è flagellato quindi è facilmente distinguibile. Si può anche fare isolamento colturale con brodi colturali idonei per permetterne la crescita.

CANDIDA ALBICANS: cresce bene su terreno Sabouraud.

URETRITI NON GONOCOCCICHE: UREAPLASMA UREALYTICUM: è un micoplasma, cresce solo su particolari terreni di coltura.U. Urealyticum e Chlamydia possono essere presenti in persone sessualmente attive, mentre Neisseria no.

Se non ho sospetti clinici, posso procedere con un’indagine colturale generica: faccio un tampone e poi pongo in diversi terreni selettivi e differenziali.

42

INFEZIONI DEL FETO E DEL NEONATOSi parla di INFEZIONI CONGENITE O INTRAUTERINE quelle contratte dal feto durante la gestazione, o da madre cronica o da nuova infezione della madre.

ROSOLIA: se la madre non è vaccinata e non è mai entrata in contatto ocn il virus della rosolia (rubivirus), una prima infezione in gravidanza può essere nociva per il feto. Si fa esame sierologico per individuare presenza di IgG, che indicano una pregressa infezione; se si riscontrano IgM allora si tratta di una prima infezione, che quindi può essere dannosa per il feto.

TOXOPLASMA GONDII: è un protozoo che può essere molto pericoloso in una donna incinta che non sia mai venuta in contatto con esso; si va a valutare la sierologia. Infatti l’unica fase in cui il feto può venir infettato è la fase di parassitemia, ossia di distribuzione del parassita in tutto l’organismo attraverso il sangue, dopo di che le cisti si posizionano a livello muscolare e rimangono latenti. Si fa esame sierologico per valutare la presenza di IgG (infezione pregressa, nessun rischio); se sono presenti IgM (nuova infezione, il feto è a rischio), se invece la donna è sieronegativa deve stare attenta a non contrarla in gravidanza.

43

INFEZIONI DELLE VIE URINARIEEntrano dall’esterno, salgono fino alla vescica. Non sempre viene diagnosticata perché non tutti ne parlano (es. i bambini).Prima si parla di infezione delle vie urinarie o cistite, quando raggiunge il rene si parla di pielonefrite.Possono entrare dall’esterno (perché non sono sterili) ma possono anche arrivare dal circolo sanguigno.

Sono favorite da una serie di concause: l’idraulica del sistema urinario deve funzionare bene e niente deve ostacolare il flusso di urina che deve uscire, non deve ristagnare: lo svuotamento della vescica deve essere completo. Può essere dovuto a prostatite nell’uomo, calcoli, problemi neurologici (reflussi), gravidanza, masse tumorali. Se si beve poco aumenta il rischio di infezioni.

Possono essere colpiti tutti i segmenti delle vie urinarie:- CISTITE: infezione a carico della vescica- PIELONEFRITE: infezione a carico del rene- URETRITE: infezione a carico dell’uretra- PROSTATITE: infezione a carico della prostata

METODO DI RACCOLTA E DI CONSERVAZIONE DI URINANel paziente in grado di collaborare, il campione viene raccolto con la TECNICA DEL MITTO INTERMEDIO: dopo accurata detersione dei genitali esterni, il paziente urina scartando il primo getto della minzione e raccogliendo in un apposito contenitore sterile parte della minzione residua.Se il paziente non è in grado di collaborare, si fa puntura sovrapubica o cateterizzazione vescicale estemporanea (si rischia però ingresso di batteri per effetto della manovra). L’urina contenuta nella sacca di drenaggio non può essere utilizzata. Il campione deve essere portato in laboratori entro due ore e conservato in frigorifero.

URINOCOLTURA:La diagnosi di infezione vie urinarie (IVU) è basata sulla dimostrazione certa di un numero significativo di microrganismi nell'urina vescicale. La urinocoltura consente una determinazione accurata del numero totale dei microrganismi per ml di urina, e permette l'identificazione della specie batterica sotto 103: non è infetto. Se è tra 103

e 105 devo tenere sotto controllo il soggetto, sopra 105 ha un’infezione delle vie urinarie.

44

TECNICHE NON COLTURALI RAPIDE:Esistono tre metodi rapidi (24h di vantaggio rispetto alle tecniche colturali), non automatizzati e semplici da eseguire per determinare la presenza di batteri e leucociti all’interno dei campioni di urine:1. Esame microscopico di preparati colorati con gram2. Ricerca di attività enzimatiche nelle urine (enzima nitrato reduttasi)3. Test per la ricerca della catalasi

45

INFEZIONI DI CUTE E ANNESSITutte le specie microbiche possono infettare la cute, compresi protozoi ma anche parassiti superiori.Si dividono in:

- Primitive- Secondarie: es. Zoster, deriva da un ganglio.

Vantaggio della cute è che si vede.La cute può andate incontro a una serie di degenerazioni su cui poi si inseriscono i batteri. In questo caso non basta dare antibiotici, ma bisogna anche capire perché la barriera cutanea normale è stata alterata.La cute non è più integra anche quando diventa bersaglio di patologie degenerative, soprattutto quelle su base autoimmune. Quando il SI impazzisce molto spesso bersaglia la cute causando ferite, croste, …Impetigine: non è dovuta alla perdita della barriera cutanea. È un ‘infezione tipica del bambino perché il microbioma non è ancora matura.

TIPO DI PRELIEVO:l’infezione purulenta sulla ferita non va mai fatto con un tampone. Quando c’è pus bisogna fare un prelievo di pus, perché è più rappresentativo.Il tampone cutaneo ha il limite che la cute è fortemente colonizzata dal microbioma normale.

46