Verdun Di Cantogno 28 Nov 08
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FISH, CGH, ARRAYFISH, CGH, ARRAY--CGH:CGH:tecniche di biologia molecolare duttili tecniche di biologia molecolare duttili
e con ampio spettro di utilizzoe con ampio spettro di utilizzo
Dott.ssaDott.ssa Ludovica Verdun di Ludovica Verdun di CantognoCantognoAnatomia Patologica III Anatomia Patologica III MolinetteMolinette TorinoTorino
Cariotipo a 550 bande G: risoluzione 3/5Mb
FISH: risoluzione 100Kb
SONDA PER LA S. DI DiGEORGE
ideogrammi
Analisi convenzionale (microscopio ottico)
1956: i cromosomi umani sono 46
1960: prima definizione di cariotipo
1966: nomenclatura dettagliata cromosomi
Bandeggio G
bande CHIARE:
- ricche in GC- molti geni
Bande SCURE:
- ricche in AT- pochi geni
centromero
Telomero p
Telomero q
risoluzione cariotipo: 400 550 850
Cromosoma 7
Diverse risoluzioni di bandeggio G
(numero bande totali per corredo aploide)
p = braccio cortoq = braccio lungo
numerazione delle bande dalcentromero al telomero
CASI RISOLVIBILI CASI RISOLVIBILI TRAMITE IL SOLO TRAMITE IL SOLO
CARIOTIPOCARIOTIPO
LA: W+ per trisomia 18
Cariotipo: 47,XY, +13
Cariotipo: 45,XY,der(14;21)(q10;q10)
SP
Cariotipo: 46,XY,der(9;13)
SP: infertilità di coppia
Cariotipo: 46,XY,inv(6)(p25q23)
SP: infertilità di coppia
Individuazione punti di rottura inv(6)
Cariotipo: 46,XY,inv(17)(p11.2q21)
SP:in padre LA con stessa aberrazione
Individuazione punti di rottura inv(17)
CASI CHE RICHIEDONO CASI CHE RICHIEDONO APPROFONDIMENTO APPROFONDIMENTO TRAMITE FISHTRAMITE FISH
SP: lieve ritardo psicomotorio
Cariotipo 46,XY,dup10q o ins..?
Pz. con ritardo psicomotorio:traslocazione Y/autosoma(?)
LIQUIDO AMNIOTICO
CROMOSOMA MARCATORE SOVRANNUMERARIO
•DA-DAPI NEGATIVO
•ACROCENTRICO
•NON SATELLITATOè un iso(18p)?
PAZIENTE WILLIAMS POSITIVO?
? ?
FISH: Fluorescence In SituHybridization
Dal 1980
MATERIALE ADATTO ALLA FISH
•La FISH può essere effettuata su DNA fissato su vetrino proveniente da qualsiasi tipo di tessuto: • liquido amniotico (LA)• sangue periferico (SP)• aspirato midollare (AM)• sezioni di tessuto (in paraffina o congelate)
•Possono essere ibridate sia metafasi che nuclei in interfase. La lettura ed interpretazione dei risultati sarà ovviamente differente nei due casi.
LAVAGGI DI STRINGENZA
La rinaturazione del DNA è indipendente dal pH che può variare da 5 a 9 senza influire sulla reazione
pH: generalmente si lavora a pH neutro
Alte temperature denaturano la doppia elica di DNA (99°-100°C)
Temperatura: > è la teperatura > è la stringenza(a parità di concentrazione di formamide)
Solvente organico in grado di ridurre la stabilità termica del DNA: permette la sua denaturazione a temperature più basse
Formamide: > è la concentrazione > è la stringenza (a parità di temperatura)
Interagiscono con i gruppi fosfato del DNA: diminuiscono la repulsione elettrostatica tra le due eliche facilitandone il riavvicinamento
Cationi monovalenti (SSC):> è la concentrazione < è la stringenza
SONDE PAINTINGSONDE PAINTING
Colorano per intero un singolo cromosoma o parti di esso (arm
painting)
LA
SONDA PAINTING CROMOSOMA 7
LA 701/06
Cariotipo: 46,XY,inv(7)(q22q31.3)?
LA 701/06
SONDA PAINTING CROMOSOMA 7
Non ci sono ulteriori riarrangiamentia carico di questo cromosoma
Conferma ipotesi formulata in bande G:è una inversione paracentrica
SP: ritardo spicomotorio lieve
Cariotipo 46,XY,dup10q o ins..?
SP SONDA PAINTING CROMOSOMA 10
dup(10)
Conferma cariotipo:46,XY,dup(10)(q21.1)
LIQUIDO AMNIOTICO
CROMOSOMA MARCATORE SOVRANNUMERARIO
•DA-DAPI NEGATIVO
•ACROCENTRICO•NON SATELLITATOè un iso(18p)?
LA
confermato: si tratta di un i(18)(p10)
SONDA PAINTING CROMOSOMA 18
SONDE ALFOIDISONDE ALFOIDI
Evidenziano le regioni centromeriche dei singoli cromosomi
(con queste sonde non è possibile discriminare tra i cromosomi (1)/5/19,
13/21, 14/22)
CARIOTIPO: 47,XX,+mar
Caso SP163/04
SP163/04
COLORAZIONE DA-DAPI: POSITIVO
IPOTESI:
•Crom. 15•Crom. 9•Crom. 16•Crom. 1
Sonda PRADER-WILLI/ANGELMAN
SP163/04
MARCATORE NEGATIVO
SP163/04
SONDA CENTROMERO CROMOSOMA 9
MARCATORE NEGATIVO
SP163/04
SONDA CENTROMERO CROMOSOMA 16
MARCATORE NEGATIVO
SP163/04
SONDA CENTROMERO CROMOSOMA 1
MARCATORE POSITIVO
Si tratta di un der(1)
Cromosoma riarrangiato der(?)
Centromero attivo
Il centromero attivo di questo cromosoma provienedal cromosoma 17 per cui, indipendentemente dalla provenienza dell’altro materiale che lo compone, si tratta di un der(17)
Sonde:-centrom. crom. 17-Her-2
Linea cellulare SKBR3:da carcinoma mammarioHER2 amplificato
DIAGNOSI DI ANEUPLOIDIE SU NUCLEI DI LIQUIDO
AMNIOTICO
X
X
21
2121
MD 40/06 Sonda alfoide XSonda alfoide Y
MDS (Sindrome Mielodisplastica):valutazione allotrapianto: trapianto di midollo maschio (donatore) su femmina (paziente)
crom X
crom Y
MD 40/06
Sonda alfoide XSonda alfoide Y
Letti 800 nuclei e 20 metafasi :
Tutte “maschio” (donatore)
3 NUCLEIXY
LEUCEMIA LINFATICA CRONICA A CELLULE B (B-LLC): SONDA CENTROMERO CROMOSOMA 12
Nucleo con tris. 12
Nucleo normale
la trisomiadel cromosoma 12è un marker di questa patologia che spesso sfugge al cariotipo in bande G per selezione sfavorevole delle metafasi con trisomia in coltura
Nonostante il cariotipo negativo, la FISH sui nuclei in interfase rivela una popolazione pari al 40% positiva per trisomia del cromosoma 12
SONDE PER REGIONI A SINGOLA SONDE PER REGIONI A SINGOLA COPIACOPIA
Evidenziano:•regioni correlate a sindromi da geni contigui
•regioni la cui duplicazione, delezione o traslocazione è correlata a neoplasie
PRINCIPALI SINDROMI DA PRINCIPALI SINDROMI DA MICRODELEZIONEMICRODELEZIONE
SINDROME LOCALIZZAZIONE CROMOSOMICA
REGIONE SONDA
% EVIDENZIATA CON FISH
DiGeorge/ (DGS) 22q11.2 D22S75 (N25) 85%
Velocardiofacciale
(VCFS) 22q11.2 D22S75 (N25) 53%
Prader Willi (PWS) 15q11-q13 SNRPN 70%
Angelman (AS) 15q11-q13 D15S12 70%
Williams (WS) 7q11.23 Gene Elastina 97%
Miller-Dieker 17p13.3 LIS-1 90%
Smith-Magenis 17p11.2 D17S258 95%
Ittiosi X-linked (STS) Xp22.3 Gene Steroido
Solfatasi 85%
NEGATIVA
SINDROME DI WILLIAMS
crom. 7
crom. 7
Williams:7q11.23 locusGene Elastina (ELN)
Controllo: 7q31
Sonde:
crom. 7POSITIVA
del(7)
SINDROME DI WILLIAMS
Sonda Williams:7q11.23 locusGene Elastina (ELN)
Sonda di Controllo: 7q31
PZ. WILLIAMS POSITIVO
NEGATIVA
Sindrome di DiGeorge •Sonda DiGeorge22q11.2 (locusTuple1)
•Sonda Controllo22q13.3 (locusARSA)
POSITIVA Sindrome di DiGeorge
•Sonda DiGeorge22q11.2 (locusTuple1)
•Sonda Controllo22q13.3 (locusARSA)
PZ. DiGEORGE POSITIVO
SINDROME PRADER-WILLI/ANGELMAN
Controllo:locus D15Z1 (centr.) e PML (15q22)
PWS/AS:15q11-13 Locus SNRPN
Sonde:
NEGATIVA
SINDROME PRADER-WILLI/ANGELMAN
crom. 15del(15)
POSITIVA
CROMOSOMA MARCATORE •SOVRANNUMERARIO
•DICENTRICO
•DA-DAPI POSITIVO
CASO 1
SONDA PRADER-WILLI/ANGELMAN 15q11-q13: negativoSONDA CENTROMERO CROMOSOMA 15: due segnali
Il Crom. Marcatore è un derivativoisodicentrico 15p
mar
CASO 1