I MICROARRAY

E IL LORO UTILIZZO IN DIAGNOSTICA

Elisa MenegattiUniversità di Torino - Dipartimento di Medicina ed Oncologia Sperimentale

I microarray

Linea ordinata di elementi microscopici su di una superficie piana su cui sono immobilizzati acidi nucleici, proteine, cellule o tessuti capaci di riconoscere e legare molecole specifiche.

DNA microarray

Proteinmicroarray

Cellmicroarray

Tissuemicroarray

DNA microarray

DNA microarray (gene chip, DNA chip, o biochip) è costituito da una collezione sonde (DNA o oligonucleotidi) depositate in una posizione nota su un supporto a formare una microgriglia (da cui il nome microarray) che consente di identificarle in modo univoco.

Il supporto può essere di vetro, plastica o siliconico

100 - 1 million DNA probes in 1 cm2

Dimensioni degli spot da 15 a 350 micron

Principio: appaiamento delle basicomplementari

• espressione genica

• genotipizzazione

• valutazione di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti

• profilo di metilazione

• analisi di micro-RNA

Vengono utilizzati per:

• 2007 = 6517• 2006 = 6236• 2005 = 4406• 2004 = 3509• 2003 = 2421• 2002 = 1557• 2001 = 834• 2000 = 294

294834

1557

2421

3509

4406

62366517

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

1998 2000 2002 2004 2006 2008

Anni

N° c

itazi

oni P

ubM

ed

Una metodologia promettente…

Punti di forza• numero di informazioni disponibili con un’ unico esperimento• miniaturizzazione

• Produzione dell’ array• Marcatura del campione• Ibridazione• Rilevazione del segnale (scan, imaging)• Analisi dei dati

Fasi analitiche

1. PRODUZIONE DELL’ ARRAY

• Per deposizione (cDNA, oligonucleotidi)

• Fotolitografia (oligonucleotidi)

• Ink-jet technology (oligonucleotidi)

SPOTTED MICROARRAY

FOTOLITOGRAFIA

InkJet technology

Marcatura del campione

Ibridazione

Rilevazione del segnale (scan, imaging)

Analisi dei dati

Analisi dell’ immagine

1. Identificazione degli spot (automatica, semiautomatica, manuale)

2. Segmentazione: separa gli spots dal background. Histogram

3. Valutazione dell’ intensità: media o mediana dei pixels rilevati nello spot

4. Correzione del background

Normalizzazione, software dedicati

DIAGNOSTICA

• ANALISI DEI CNV (Copy Number Variants), •pazienti con ritardo mentale•pazienti con dismorfismi•Ricerca di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti

array CGH

• Analisi dei geni espressi

• RICERCA DI MUTAZIONI PUNTIFORMI

• GENOTIPIZZAZIONE (SNP array)• SEQUENZIAMENTO DIRETTO (su array)

SingleNucleotidePolymorphism

array

SNPs analizzabili con un unico assay:

da poche centinaia a 2,3 milioni (distanza minima

raggiungibile 1,5 kb)

Genome-wideassociation studies

SEQUENZIAMENTO DIRETTO

SEQUENZIAMENTO DIRETTOMETODO DI SANGER

ARRAY CON MUTAZIONI CONOSCIUTE

ARRAY SEQUENZIAMENTO

Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46:3355