Restagno 07 Nov 08
-
Upload
cmid -
Category
Health & Medicine
-
view
1.092 -
download
0
Transcript of Restagno 07 Nov 08
La genetica delle amiloidosi familiari
� Gabriella Restagno
� SS Diagnostica e Consulenza geneticaAO OIRM-S.Anna
� E-mail: [email protected]
� Conferenze Patologico-cliniche 2008
Le amiloidosi familiari:Le amiloidosi familiari:eterogeneità geneticaeterogeneità genetica
� Gruppo di differenti malattie ognuna risultante da mutazioni in una proteina specifica
� La più comune: transtiretina
� Più rare: apolipoproteina AI, cistatina C, lisozima, catena Aα del fibrinogeno, apolipoproteina AII
Ereditarietà “semplice”, correlazioneGenotipo-fenotipo Caratteri Complessi: interazione
Geni + ambiente
Basi genetiche “semplici” e basi genetiche “complesse”
L’utilizzo dei test genetici è un intervento complesso
� Sospetto diagnostico, informazione e preparazione al test (consulenza pre-test)
� Strategie di esecuzione del test genetico di laboratorio: quali tecnologie
� Interpretazione dei risultati
� Comunicazione al paziente (consulenza post-test)
� Supporto a chi ha ricevuto un test positivo
Non indicato il cariotipo
� Prepared from chromosome
metaphase spreads
� Requires dividing cells
� Each chromosome has its
unique staining pattern
� Results need to be read and
interpreted by a certified
cytogeneticist
� Resolution of technique is ~5
Mb
Indicata l’analisi del DNA
�Le molecole di DNA sono a doppia elica, connesse da pontiidrogeno
�Le varie combinazioni diquesti quattro nucleotidicreano un codice unico per ilDNA chiamato sequenza ( o genotipo, gene, allele)
� Cambiamenti nella sequenzadel DNA sono detti mutazioni(se causa di malattia) o polimorfismi (se varianti“neutre”)
�Un Dna è un lungo polimeroformato da quattro basiazotate (nucleotidi).
PerchPerchéé eseguire leseguire l’’analisi del DNA analisi del DNA (Analisi di un gene specifico allo scopo di accertare o escluder(Analisi di un gene specifico allo scopo di accertare o escludere e
unun’’alterazione associata ad una malattia ereditaria, nelle alterazione associata ad una malattia ereditaria, nelle amiloidosi TTR, amiloidosi TTR, apolipoproteina AI, cistatina C, lisozima, catena Aa del fibrinogeno, apolipoproteina AII, MEFV ))
••Conferma diagnosticaConferma diagnostica
••Identificazione degli eterozigoti (Identificazione degli eterozigoti (““carriercarrier””))
••Test Test presintomaticipresintomatici e predittivie predittivi
••Test di Test di ““suscettibilitsuscettibilità”à” o o ““predisposizionepredisposizione””
La diagnosi genetica può essere eseguita con la ricerca di mutazioni sulla sequenza dei diversi geni
Come di esegue l’analisi del DNA
� Il DNA viene estratto generalmente da un prelievodi sangue (in edta). L’analisi si effettua in tre passaggi:
� 1) Preparazione del campione
� 2) Amplificazione (PCR)
� 3) Rivelazione della mutazione (o del polimorfismo) con differenti metodiche
MutazioneMutazionepuntiformepuntiforme DelezioneDelezione InserzioneInserzione
DuplicazioneDuplicazione
Varianti di uno stesso gene possono causare Varianti di uno stesso gene possono causare sintomi clinici noti (mutazioni) o non dare sintomi clinici noti (mutazioni) o non dare sintomi clinici (polimorfismi)sintomi clinici (polimorfismi)
Mutazioni del DNAMutazioni del DNA
Le amiloidosi ereditarie :Le amiloidosi ereditarie :autosomiche dominanti (AD)autosomiche dominanti (AD)
Le amiloidosi ereditarie :Le amiloidosi ereditarie :da transtiretina (A TTR)da transtiretina (A TTR)
� Mutazioni nella plasma proteina tetramericatranstiretina, composta da 127 aminoacidi
� trasporta ormone tiroideo e VitA attraverso un complesso con RBP in siero e liquor
TTR: il locus
OMIM: *107680, 18q11.2- q12.1
TTR: il gene TTR: il gene 4 esoni, 615 bp (147 4 esoni, 615 bp (147 aminoacidi)aminoacidi)
A TTR: Eterogeneità allelica e fenotipica
A TTR: Eterogeneità allelica e fenotipica
A TTR: la stessa mutazione può dare fenotipi differenti
V30M: variabilità dei sintomi clinici in soggetti di origine etnica differente
V30M: penetranza (% di portatori della mutazione che sviluppano la malattia) inferiore al 50%
Ile84Ser: penetranza circa 100%
Mutazioni in altri geni non TTR
Amiloidosi da ApoAI: il locus
OMIM: *107680, 11q23
ApoAI: 4 esoni, 897 bp, 267 aminoacidi
•Gly26Arg (ggc>cgc): NP, nefropatia
• Trp50Arg (tgg>agg): A sistemica, non NP
•Leu90Pro (cta>cca): A cardiaca e cutanea
•Arg173Pro (cga>cca): A cardiaca, cutanea, laringea
•Leu174Ser (ttg>tcg): A sistemica, non NP
•Ala175Pro ( gcg>ccg): A sistemica, nefropatia, laringea
•del60-71 insVal/Thr: A epatica
•del70-72: nefropatia
Amiloidosi da gelsolina: il locus
OMIM: *137350, 9q34
Amiloidosi da gelsolina: il gene / le mutazioni
Asp187Asn: A sistemica, NP
Asp187Tyr : A sistemica, NP
17 esoni, 2657 bp, 782 aminoacidi, splicing alternativi
Una forma autosomica recessiva: il gene MEFV
OMIM: *6081107, 16p1310 esoni, 3677 bp, 781 aminoacidisplicing alternativi tessuto specifici
il gene MEFV: mutazioni in omozigosi con frequenza differente in diverse popolazioni
M694V: più frequente in popolazioni con amiloidosi sistemica (penetranza 99%, 20-65% dei cromosomi FMF in Arabi, Armeni, Turchi)
E148Q (penetranza 55%)
V726A: più frequente in popolazioni in cui l’amiloidosi èmeno comune
tre mutazioni hotspot ai codoni
148, 680 e 694
I geni delle amiloidosi: metodi d’indagine molecolare
� Per le mutazioni frequenti
� Analisi con primers allele-specifici (ARMS)
� Analisi con sonde oligonucleotidiche allele-specifiche (dot blot, reverse dot blot, kit...)
� Microchip
� Pyrosequencing
Per le mutazioni rare� DGGE� SSCP
� DHPLC � Sequenziamento
1953: doppia elica del DNA ( Watson e Crick )
1955: 46 cromosomi
1961: mRNA
1966: codice genetico
1968: primo enzima di restrizione
1975-1977: sequenza del DNA (Sanger)
1983: mappato il primo gene-malattia
INVENTATA LA PCRINVENTATA LA PCR
2 4 8 16 32 64 128 2 4 8 16 32 64 128 etcetc..
Amplificazione del DNA tramite PCR
(Polymerase Chain Reaction)
� La Polymerase Chain Reaction (PCR) è un
processo di amplificazione del DNA che, a
partire da una sequenza DNA “bersaglio”, ne
consente l’amplificazione selettiva e rapida.
20 µµµµL
Ingredienti:Ingredienti:
DNA da analizzareDNA da analizzare
OligonucleotidiOligonucleotidi(primer)(primer)
NucleotidiNucleotidi
Mg, bufferMg, buffer
TaqTaq PolimerasiPolimerasi
wild type mutato eteroduplici omodupliciwild type wild type mutatomutato eteroduplicieteroduplici omodupliciomoduplici
DHPLC DHPLC ((DenaturingDenaturinghigh performance high performance liquidliquidchromatographychromatography))
•Tecnica di screening che permette di identificare variazioni nella sequenza del DNA in eterozigosi senza uso di gel, fluorescenti ecc., su una speciale colonna cromatografica• Dopo la PCR si esegue una denaturazione (94°C) e un re-annealing (56°C) in cui si formano gli omoduplici originali di filamenti complementari e gli eteroduplici generati dalla combinazione di un filamento wild type e di uno mutato
Profilo cromatografico in DHPLC dell’esone 2 del gene TTR in soggetto eterozigote V30M / wt
V30M
wild-type
Sequenza diretta gene TTR mutazione V30M/wt, esone 2
E89Q
wild-type
Profilo cromatografico in DHPLC dell’esone 2 del gene TTR in soggetto eterozigote E89Q / wt
Sequenza diretta gene TTR E89Q / wt, esone 3
Interpretazione delle mutazioni
� Database
� pubblicazioni
� esperienza dei centri
Problemi aperti : interpretazione prognosticadel significato delle mutazioni
� Database
� Anamnesi familiare
� Mutazioni “de novo”
� Penetranza incompleta
� Espressione variabile (geni modificatori, eterogeneità allelica o di locus, fattori ambientali)
Il punto più critico: i tempi di risposta dei test molecolari
•Dati i costi delle analisi sul DNA (purificazione, DHPLC, sequenze, ecc.) in genere si segue una procedura a passaggi successivi : essenziale una consulenza genetica pre- test
•i tempi di risposta possono variare da una settimana a vari mesi
•in una percentuale variabile di casi non si evidenziano mutazioni
PROSPETTIVE :
LE NUOVE TECNOLOGIE
Messa a punto di pannelli per l’analisi rapida delle mutazioni più frequenti, determinate su basi epidemiologiche
Analisi contemporanea di un elevato numero di mutazioni note, anche in geni diversi: (multiplex PCR)
•Sequenziamento in tempo reale
•Analisi con microarray (microchip)
Next-generation sequencing
Trends in Genetics, Vol 24, marzo 2008
Essenziale
•Necessità di una stretta collaborazione tra clinici, genetisti e laboratoristi
•utilizzo di strumentazione ad elevato throughputper l’analisi molecolare contemporanea di un elevato numero di geni/mutazioni
•attenta valutazione dei risultati dei test molecolari insieme ai dati clinici e di laboratorio
• consulenza genetica