Università del Piemonte Orientale – Facoltà di Scienze – anno accademico 2006-Università del Piemonte Orientale – Facoltà di Scienze – anno accademico 2006-20072007

Carne e pesceCarne e pesce

Carne e pesce sono, insieme alle uova, tra le Carne e pesce sono, insieme alle uova, tra le più importanti fonti di proteine nella dieta più importanti fonti di proteine nella dieta umana. Si tratta inoltre di alimenti consumati umana. Si tratta inoltre di alimenti consumati dall’uomo fin dalla preistoriadall’uomo fin dalla preistoria

L’analisi di carne e pesce è generalmente più L’analisi di carne e pesce è generalmente più complessa rispetto agli alimenti citati in complessa rispetto agli alimenti citati in precedenza, soprattutto per il fatto che si precedenza, soprattutto per il fatto che si tratta di substrati non omogenei, in cui le tratta di substrati non omogenei, in cui le varie sostanze sono presenti in più forme varie sostanze sono presenti in più forme fisiche. Per questo motivo è quasi sempre fisiche. Per questo motivo è quasi sempre necessario un passaggio preliminare di necessario un passaggio preliminare di estrazione dell’analitaestrazione dell’analita

Con il termine Con il termine carnecarne si intendono i muscoli striati e si intendono i muscoli striati e i tessuti strettamente connessi di:i tessuti strettamente connessi di:

All’interno degli organismi di questi animali, altre All’interno degli organismi di questi animali, altre parti che sono generalmente associate alla carne parti che sono generalmente associate alla carne dal punto di vista merceologico sono le dal punto di vista merceologico sono le frattagliefrattaglie (i (i principali organi interni), la principali organi interni), la trippatrippa (stomaco e (stomaco e intestino) e le intestino) e le animelleanimelle (pancreas, timo, ghiandole (pancreas, timo, ghiandole salivari)salivari)

animali da macello (bovini, suini, ovini, caprini, animali da macello (bovini, suini, ovini, caprini, equini)equini)

animali da cortile (pollame, tacchini, conigli)animali da cortile (pollame, tacchini, conigli) selvagginaselvaggina

La carneLa carne

Le carni destinate all’alimentazione possono essere classificati in Le carni destinate all’alimentazione possono essere classificati in alcuni modi, ad esempio in base alla specie animale da cui alcuni modi, ad esempio in base alla specie animale da cui provengono. Importante è la classificazione in base ai trattamenti provengono. Importante è la classificazione in base ai trattamenti subiti prima del consumo. Si possono avere allora:subiti prima del consumo. Si possono avere allora:

Classificazione delle carniClassificazione delle carni

le carni fresche, che abbiano subìto soltanto trattamenti le carni fresche, che abbiano subìto soltanto trattamenti refrigerantirefrigeranti le carni sterilizzate, come la le carni sterilizzate, come la carne in scatola, per la cui carne in scatola, per la cui preparazione è consentito preparazione è consentito l’uso di additivi (nitrati e l’uso di additivi (nitrati e nitriti, antiossidanti, nitriti, antiossidanti, addensanti, gelificanti, addensanti, gelificanti, esaltatori di sapidità)esaltatori di sapidità)

le carni salate e/o essiccate le carni salate e/o essiccate e/o affumicate e/o cotte: i e/o affumicate e/o cotte: i salumisalumi, insaccati o non, che , insaccati o non, che possono contenere possono contenere numerosi additivinumerosi additivi

La composizione della carne varia ovviamente a seconda della La composizione della carne varia ovviamente a seconda della specie, dell’età, dello stato nutrizionale e dell’alimentazione specie, dell’età, dello stato nutrizionale e dell’alimentazione dell’animaledell’animale

ComposizioneComposizione

ClasseClasse range %range %

AcquaAcqua 50 - 7950 - 79

ProteineProteine 15 – 2315 – 23

Composti azotati non proteiciComposti azotati non proteici 1 - 21 - 2

LipidiLipidi 2 - 302 - 30

CarboidratiCarboidrati 1.21.2

Sali mineraliSali minerali 11

VitamineVitamine traccetracce

La variazione da specie a specie è mostrata in questa tabellaLa variazione da specie a specie è mostrata in questa tabella

Tipo di carneTipo di carneacquaacqua

%%

proteinproteinee

%%

grassigrassi

%%colesterolocolesterolo

mg/100 gmg/100 gcaloriecalorie

Kcal/100 gKcal/100 g

ovinoovino 75.075.0 20.420.4 3.413.41 70.070.0 122122

bovinobovino 75.175.1 22.022.0 1.901.90 60.0.60.0. 115115

suinosuino 74.774.7 22.022.0 1.861.86 65.065.0 114114

pollopollo 72.772.7 20.620.6 5.605.60 81.081.0 144144

tacchinotacchino 63.563.5 20.220.2 15.015.0 74.074.0 231231

ocaoca 52.452.4 15.715.7 31.031.0 86.086.0 364364

leprelepre 73.373.3 21.621.6 3.013.01 65.065.0 124124

La carne dal punto di vista analitico è una matrice piuttosto La carne dal punto di vista analitico è una matrice piuttosto complessa, sicuramente più di quelle finora trattate. Siccome la complessa, sicuramente più di quelle finora trattate. Siccome la maggior parte dei test analitici si effettua per via umida, il maggior parte dei test analitici si effettua per via umida, il pretrattamento del campione risulta critico nella possibilità di pretrattamento del campione risulta critico nella possibilità di ottenere risultati affidabili; in particolare è necessario porre molta ottenere risultati affidabili; in particolare è necessario porre molta attenzione nel campionamento, a causa della scarsa omogeneità di attenzione nel campionamento, a causa della scarsa omogeneità di composizionecomposizione

Problemi nell’analisiProblemi nell’analisi

Generalmente la preparazione del Generalmente la preparazione del campione prevede la rimozione di tutte le campione prevede la rimozione di tutte le parti accessorie al muscolo (ossa, pelle, parti accessorie al muscolo (ossa, pelle, tendini) e il prelievo di un pezzo della tendini) e il prelievo di un pezzo della parte edibile che viene omogeneizzato parte edibile che viene omogeneizzato mediante triturazione e amalgamazione (a mediante triturazione e amalgamazione (a sx lo strumento impiegato); questo sx lo strumento impiegato); questo passaggio può essere coadiuvato passaggio può essere coadiuvato dall’acqua, anche perché è necessario dall’acqua, anche perché è necessario mantenere la temperatura bassa (mantenere la temperatura bassa (<< 7°C) 7°C)

Le analisi devono essere eseguite nel più Le analisi devono essere eseguite nel più breve tempo possibile, soprattutto per le breve tempo possibile, soprattutto per le carni freschecarni fresche

Le principali analisi che si eseguono sulle carni Le principali analisi che si eseguono sulle carni sono le seguenti:sono le seguenti:

Principali analisi per le carni Principali analisi per le carni freschefresche

contenuto di acquacontenuto di acqua contenuto di proteine e azoto solubile (non contenuto di proteine e azoto solubile (non proteico)proteico)

cenericeneri contenuto di sostanza grassacontenuto di sostanza grassa ricerca di anabolizzantiricerca di anabolizzanti tenore di idrossiprolinatenore di idrossiprolina nitrati e nitritinitrati e nitriti metalli pesantimetalli pesanti

Un aspetto complesso riguardante la genuinità della carne è la sua Un aspetto complesso riguardante la genuinità della carne è la sua provenienza: è possibile certificarla con metodi analitici? Inoltre, è provenienza: è possibile certificarla con metodi analitici? Inoltre, è possibile distinguere carne da allevamento biologico da carne di possibile distinguere carne da allevamento biologico da carne di allevamento intensivo? Il consumatore è sicuramente interessato a allevamento intensivo? Il consumatore è sicuramente interessato a sapere, e quindi a verificare l'autenticità dell'informazione, se la sapere, e quindi a verificare l'autenticità dell'informazione, se la carne che mangia proviene da allevamenti biologici (carne che mangia proviene da allevamenti biologici (organic organic farmingfarming in inglese) o da allevamenti intensivi ( in inglese) o da allevamenti intensivi (factory farmingfactory farming))

Carne Carne biologicabiologica o o industrialeindustriale??

Un esempio di quanto sia semplice frodare la legge sulla Un esempio di quanto sia semplice frodare la legge sulla produzione biologica di carne è il seguente. In Gran Bretagna produzione biologica di carne è il seguente. In Gran Bretagna è stata avviata (maggio 2006) un’indagine nazionale sulla è stata avviata (maggio 2006) un’indagine nazionale sulla vendita di falsa carne biologica nelle macellerie e nei vendita di falsa carne biologica nelle macellerie e nei mercati. Si sospetta infatti che alcuni macellai vendano mercati. Si sospetta infatti che alcuni macellai vendano carne convenzionale per biologica, naturalmente incassando carne convenzionale per biologica, naturalmente incassando il prezzo della carne bio, che può essere anche di cinque il prezzo della carne bio, che può essere anche di cinque volte superiore. In Gran Bretagna un pollo del valore di 2-3 volte superiore. In Gran Bretagna un pollo del valore di 2-3 sterline (3-4.5 €) può valerne 10-11 (14.5-16 €) con sterline (3-4.5 €) può valerne 10-11 (14.5-16 €) con un'etichetta biologica; la bistecca convenzionale che siun'etichetta biologica; la bistecca convenzionale che sivende a 10-15 sterline (14-vende a 10-15 sterline (14-22 €) al chilo, può arrivare 22 €) al chilo, può arrivare fino a 29.59 sterline (43.5 fino a 29.59 sterline (43.5 euro) se biologica. Il reato euro) se biologica. Il reato comporta pochi rischi comporta pochi rischi perché è molto difficile per i perché è molto difficile per i clienti accorgersi di essere clienti accorgersi di essere stati frodati, a meno che stati frodati, a meno che dispongano di dispongano di strumentazioni analitiche strumentazioni analitiche fatte in casafatte in casa

Attraverso l'analisi dei rapporti isotopici di C, N e S si può avere uno Attraverso l'analisi dei rapporti isotopici di C, N e S si può avere uno strumento utile per verificare la provenienza geografica della carne, strumento utile per verificare la provenienza geografica della carne, in particolare di quella bovina, e avere informazioni sul tipo di in particolare di quella bovina, e avere informazioni sul tipo di alimentazione del bestiamealimentazione del bestiame

In un recente studio effettuato da ricercatori irlandesi sono stati In un recente studio effettuato da ricercatori irlandesi sono stati messi a confronto campioni di carne bovina proveniente da bestie messi a confronto campioni di carne bovina proveniente da bestie allevate inallevate inUSA, Brasile e Nord Europa. Le USA, Brasile e Nord Europa. Le differenze nella marcatura differenze nella marcatura isotopica della carne sono isotopica della carne sono causate principalmente causate principalmente dall'alimentazione e riflettono le dall'alimentazione e riflettono le proporzioni di piante con proporzioni di piante con cammino fotosintetico Ccammino fotosintetico C33 e C e C44 nella dieta degli animali. Nello nella dieta degli animali. Nello stesso studio si vede come sia stesso studio si vede come sia possibile, per le stesse ragioni, possibile, per le stesse ragioni, differenziare carne da bovini differenziare carne da bovini allevati con metodi biologici o allevati con metodi biologici o con metodi intensivi al'interno di con metodi intensivi al'interno di una stessa regione geografica, una stessa regione geografica, l'Irlandal'Irlanda

La determinazione del rapporto isotopico La determinazione del rapporto isotopico 1313C/C/1212C contro C contro 1515N/N/1414N fornisce un risultato sorprendente: l'ottima N fornisce un risultato sorprendente: l'ottima separazione tra campioni di provenienza americana ed separazione tra campioni di provenienza americana ed europea. Ciò è legato senza dubbio all'impiego quasi europea. Ciò è legato senza dubbio all'impiego quasi esclusivo, nell'alimentazione dei capiesclusivo, nell'alimentazione dei capiamericani, di piante Camericani, di piante C44 come il granturco o come il granturco o erbe subtropicali: ciò erbe subtropicali: ciò causa valori di causa valori di 1313C C meno negativi (tra -12 e meno negativi (tra -12 e -8) per le carni -8) per le carni provenienti dal provenienti dal continente americanocontinente americano

C'è buona separazione C'è buona separazione anche tra campioni di anche tra campioni di carne irlandese e carne irlandese e campioni di altra campioni di altra provenienza europeaprovenienza europea

pallini neri: allevamento biologicopallini neri: allevamento biologico

pallini bianchi: allevamento intensivopallini bianchi: allevamento intensivo

La carne convenzionale presenta valori di La carne convenzionale presenta valori di 1313CC meno negativi (-24.5‰ ± 0.7) rispetto meno negativi (-24.5‰ ± 0.7) rispetto alla carne biologica (-26.0‰ ± 0.2), come alla carne biologica (-26.0‰ ± 0.2), come ci si può aspettare se si pensa ad ci si può aspettare se si pensa ad un’alimentazione basata su mangimi un’alimentazione basata su mangimi concentrati o su erba. Per i campioni di concentrati o su erba. Per i campioni di carne convenzionale con valori più negativi carne convenzionale con valori più negativi di -24‰ si può ipotizzare l’impiego di di -24‰ si può ipotizzare l’impiego di mangimi contenenti piante Cmangimi contenenti piante C44 (mais, (mais, melassa di canna da zucchero)melassa di canna da zucchero)

Considerando l’azoto, la carne Considerando l’azoto, la carne convenzionale presenta valori di convenzionale presenta valori di dd1515NN più più elevati (7.8‰ ± 0.4) di quelli di carne elevati (7.8‰ ± 0.4) di quelli di carne biologica (6.6‰ ± 0.4). Il motivo di questa biologica (6.6‰ ± 0.4). Il motivo di questa differenza è meno chiaro: si può pensare differenza è meno chiaro: si può pensare all'influenza del contenuto di legumi nella all'influenza del contenuto di legumi nella dieta biologica. Un discorso analogo può dieta biologica. Un discorso analogo può valere per la differenza riscontrata nei valere per la differenza riscontrata nei valori di valori di δδ3434S (7.9‰ per il biologico, S (7.9‰ per il biologico, 7.2‰ per il convenzionale), forse legata 7.2‰ per il convenzionale), forse legata all'impiego, nella dieta biologica o come all'impiego, nella dieta biologica o come fertilizzante, di alghe, organismi che fertilizzante, di alghe, organismi che presentano un arricchimento di presentano un arricchimento di 3434SS

La quantità di acqua presente nella carne fresca è un La quantità di acqua presente nella carne fresca è un parametro importantissimo per determinarne la parametro importantissimo per determinarne la genuinità, soprattutto quando messo in relazione al genuinità, soprattutto quando messo in relazione al contenuto di proteine. Il rapporto acqua/proteine è contenuto di proteine. Il rapporto acqua/proteine è infatti una costante biologica indipendente da specie infatti una costante biologica indipendente da specie animale, razza e alimentazione: esso è compreso tra animale, razza e alimentazione: esso è compreso tra 3.5-4. Valori maggiori indicano probabilmente 3.5-4. Valori maggiori indicano probabilmente un’addizione fraudolenta di acqua per iniezione o un’addizione fraudolenta di acqua per iniezione o immersione (es. bistecca che si immersione (es. bistecca che si ritiraritira in fase di cottura) in fase di cottura)

Percentuali maggiori di acqua (ma sempre in accordo al Percentuali maggiori di acqua (ma sempre in accordo al suddetto rapporto) si possono avere in carne da suddetto rapporto) si possono avere in carne da individui giovani e magri e in muscoli che si muovono di individui giovani e magri e in muscoli che si muovono di più, come i quarti anterioripiù, come i quarti anteriori

Determinazione del contenuto di Determinazione del contenuto di acquaacqua

La maggior parte dell’acqua contenuta nella carne La maggior parte dell’acqua contenuta nella carne è in forma libera o è in forma libera o acqua di imbibizioneacqua di imbibizione, trattenuta , trattenuta meccanicamente dalle strutture proteiche. meccanicamente dalle strutture proteiche. Soltanto il 4% del totale è legata Soltanto il 4% del totale è legata elettrostaticamente ai gruppi polari delle proteine. elettrostaticamente ai gruppi polari delle proteine. Entrambe le forme sono cedute facilmente per Entrambe le forme sono cedute facilmente per riscaldamentoriscaldamento

La determinazione dell’acqua è semplice: si La determinazione dell’acqua è semplice: si effettua mediante essiccazione del campione in effettua mediante essiccazione del campione in stufa a 180°C. La differenze di peso prima e dopo stufa a 180°C. La differenze di peso prima e dopo il prosciugamento rappresenta la quantità di acqua il prosciugamento rappresenta la quantità di acqua presentepresente

Il contenuto di proteine si determina mediante il noto metodo di Il contenuto di proteine si determina mediante il noto metodo di Kjeldhal:Kjeldhal:

Il metodo, impiegato per la caratterizzazione di numerosi alimenti, Il metodo, impiegato per la caratterizzazione di numerosi alimenti, fornisce in realtà un dato corrispondente all’azoto totale presente fornisce in realtà un dato corrispondente all’azoto totale presente nel campione. Per avere il dato relativo alle proteine, la quantità di nel campione. Per avere il dato relativo alle proteine, la quantità di azoto determinata deve essere moltiplicata per un fattore specifico azoto determinata deve essere moltiplicata per un fattore specifico del tipo di alimento. Nel caso della carne esso è pari a 6.25 (per del tipo di alimento. Nel caso della carne esso è pari a 6.25 (per confronto, il valore per il latte è 6.38, per gli sfarinati 5.7)confronto, il valore per il latte è 6.38, per gli sfarinati 5.7)

Contenuto di proteineContenuto di proteine

proteineproteine

digestione con Hdigestione con H22SOSO44 + catalizzatore (Cu, + catalizzatore (Cu, Hg)Hg)

NHNH44SOSO44

addizione di idrossidoaddizione di idrossido

NHNH33

distillazione di NHdistillazione di NH33 su volume noto di HCl 0.1 su volume noto di HCl 0.1 NN

NHNH44ClCl titolazione dell’eccesso di HCl con NaOHtitolazione dell’eccesso di HCl con NaOH

Oltre alla determinazione dell’azoto proteico, è Oltre alla determinazione dell’azoto proteico, è interessante nella carne determinare anche il interessante nella carne determinare anche il tenore di azoto non proteico o solubile, presente tenore di azoto non proteico o solubile, presente per circa il 2% e costituito da numerosi composti per circa il 2% e costituito da numerosi composti quali amminoacidi liberi e oligopeptidi, ammine, quali amminoacidi liberi e oligopeptidi, ammine, nucleosidi e nucleotidi, basi azotate pirimidiniche e nucleosidi e nucleotidi, basi azotate pirimidiniche e puriniche, creatina e creatinina, urea e ammoniacapuriniche, creatina e creatinina, urea e ammoniaca

La determinazione avviene stemperando il La determinazione avviene stemperando il campione tritato in acqua e titolando l’azoto sulla campione tritato in acqua e titolando l’azoto sulla soluzione filtrata dopo precipitazione delle soluzione filtrata dopo precipitazione delle proteine solubili con acido tricloroacetico. In proteine solubili con acido tricloroacetico. In questo caso il fattore di conversione per passare questo caso il fattore di conversione per passare dall’azoto ai composti è pari a 10dall’azoto ai composti è pari a 10

N solubileN solubile

Se ne determina il peso dopo calcinazione in Se ne determina il peso dopo calcinazione in muffola del campione posto in crogiolo di muffola del campione posto in crogiolo di porcellana. Sulle ceneri è possibile determinare porcellana. Sulle ceneri è possibile determinare l’alcalinità, il contenuto di metalli e anioni, ecc.l’alcalinità, il contenuto di metalli e anioni, ecc.

CeneriCeneri

Si determina con un metodo ponderale, il metodo Soxhlet Si determina con un metodo ponderale, il metodo Soxhlet dal nome del noto sistema di estrazionedal nome del noto sistema di estrazione

Determinazione della sostanza Determinazione della sostanza grassagrassa

Il metodo si basa appunto Il metodo si basa appunto sull’estrazione del grasso dal sull’estrazione del grasso dal campione secco, previa campione secco, previa essiccazione e disidratazione con essiccazione e disidratazione con solfato di sodio anidro. Si estrae solfato di sodio anidro. Si estrae con etere di petrolio per 10 ore; con etere di petrolio per 10 ore; alla fine, dopo aver allontanato il alla fine, dopo aver allontanato il solvente per evaporazione, si pesa solvente per evaporazione, si pesa il residuo costituito da grassi il residuo costituito da grassi direttamente nel pallone di direttamente nel pallone di raccolta precedentemente taratoraccolta precedentemente tarato

Con opportune strumentazioni, la Con opportune strumentazioni, la procedura è automatizzabile d procedura è automatizzabile d eseguibile su più campioni eseguibile su più campioni contemporaneamentecontemporaneamente

La determinazione degli anabolizzanti nella carne è molto La determinazione degli anabolizzanti nella carne è molto importante, per via degli aspetti legati all’azione che residui importante, per via degli aspetti legati all’azione che residui di questi composti possono avere sulla nostra salute, sotto di questi composti possono avere sulla nostra salute, sotto forma di patologie varie. Si tratta di un campo complesso, in forma di patologie varie. Si tratta di un campo complesso, in ragione delragione del

Ricerca degli anabolizzantiRicerca degli anabolizzanti

gran numero di sostanze impiegate in gran numero di sostanze impiegate in maniera fraudolenta. maniera fraudolenta. L’impiego di L’impiego di anabolizzanti per promuovere la anabolizzanti per promuovere la crescita e aumentare il rapporto crescita e aumentare il rapporto carne/grasso negli animali è stato carne/grasso negli animali è stato bandito nell’UE dal 1988 ma non in bandito nell’UE dal 1988 ma non in paesi come USA, Canada, Australia, paesi come USA, Canada, Australia, Nuova Zelanda, Sudafrica e MessicoNuova Zelanda, Sudafrica e Messico

In parallelo è cresciuta la necessità di In parallelo è cresciuta la necessità di metodi d’analisi robusti e accuratimetodi d’analisi robusti e accurati

Esistono tre modalità di analisi:Esistono tre modalità di analisi: Esami istologici e istochimici: accertano l’avvenuto Esami istologici e istochimici: accertano l’avvenuto

trattamento, sono aspecifici e non dimostrano la presenza trattamento, sono aspecifici e non dimostrano la presenza di residui negli animali esaminatidi residui negli animali esaminati

Prove biologicheProve biologiche (somministrazione di un campione (somministrazione di un campione sospetto ad animali da esperimento)sospetto ad animali da esperimento): sono aspecifiche, : sono aspecifiche, rivelano la presenza di residui di sostanze ad attività rivelano la presenza di residui di sostanze ad attività estrogena che non sono inattivate a livello gastricoestrogena che non sono inattivate a livello gastrico

Esami chimici: metodi di screening (RIA, ELISA, TLC, HPLC), Esami chimici: metodi di screening (RIA, ELISA, TLC, HPLC), metodi di conferma (GC-MS, HPLC-DAD, HPLC-MS, GC-MS, metodi di conferma (GC-MS, HPLC-DAD, HPLC-MS, GC-MS, GC-MS/MS), evidenziano la singola molecolaGC-MS/MS), evidenziano la singola molecola

Le tecniche cromatografiche, pur richiedendo procedure Le tecniche cromatografiche, pur richiedendo procedure laboriose di preparazione del campione, consentono di laboriose di preparazione del campione, consentono di identificare e quantificare un numero elevato di sostanze identificare e quantificare un numero elevato di sostanze attive. Peraltro, il Parlamento Europeo ha recentemente attive. Peraltro, il Parlamento Europeo ha recentemente approvato una normativa sulle performances richieste dai approvato una normativa sulle performances richieste dai metodi analitici, secondo la quale è necessario l’impiego di metodi analitici, secondo la quale è necessario l’impiego di sistemi di rivelazione più efficienti dei convenzionali sistemi di rivelazione più efficienti dei convenzionali detector. Spazio, quindi, alle tecniche GC-MS ed HPLC-MSdetector. Spazio, quindi, alle tecniche GC-MS ed HPLC-MS

Alcuni anabolizzanti ad azione ormonale sono i seguenti:Alcuni anabolizzanti ad azione ormonale sono i seguenti:

steroidi endogeni (naturali): 17steroidi endogeni (naturali): 17--estradiolo (dx alto), progesterone, estradiolo (dx alto), progesterone, testosterone (dx medio)testosterone (dx medio)

La complessità dell’analisi è aumentata dal fatto che spesso non si La complessità dell’analisi è aumentata dal fatto che spesso non si determinano direttamente le molecole anabolizzanti, ma i loro determinano direttamente le molecole anabolizzanti, ma i loro metaboliti. I quali, però, non sempre sono prodotti da un unico metaboliti. I quali, però, non sempre sono prodotti da un unico progenitore, es. progenitore, es. il norandrosterone, considerato marcatore del il norandrosterone, considerato marcatore del nandrolone, è un metabolita anche di norandrostenediolo e nandrolone, è un metabolita anche di norandrostenediolo e norandrostenedionenorandrostenedione

HO

OHCH3

O

H3C

CH3OH

HOCH2CH3

OHCH3CH2

sostanze ormonoidi: DES sostanze ormonoidi: DES (dietilstilbestrolo, dx), zearalenone(dietilstilbestrolo, dx), zearalenone

steroidi esogeni (sintetici): steroidi esogeni (sintetici): estradiolo benzoato, testosterone estradiolo benzoato, testosterone proprionato, trembolone acetatoproprionato, trembolone acetato

L’approccio convenzionale alla determinazione degli anabolizzanti L’approccio convenzionale alla determinazione degli anabolizzanti nella carne con metodi cromatografici richiede uno step di nella carne con metodi cromatografici richiede uno step di estrazione e successivi passaggi di purificazione prima di procedere estrazione e successivi passaggi di purificazione prima di procedere all’analisi. L’estrazione con solventi è selettiva nei confronti degli all’analisi. L’estrazione con solventi è selettiva nei confronti degli ormoni, ma generalmente una buona percentuale dei grassi ormoni, ma generalmente una buona percentuale dei grassi presenti è coestratta, causando problemi in fase di eluizione presenti è coestratta, causando problemi in fase di eluizione cromatografica. I grassi possono essere allontanati per cromatografica. I grassi possono essere allontanati per precipitazione a freddo dopo ultracentrifugazioneprecipitazione a freddo dopo ultracentrifugazione

Esempio di separazione cromatografica con GC-MS di ormoni Esempio di separazione cromatografica con GC-MS di ormoni (miscela standard addizionata ad un campione di carne). Gli analiti (miscela standard addizionata ad un campione di carne). Gli analiti sono trasformati in eteri di trimetilsilano prima dell’iniezione in sono trasformati in eteri di trimetilsilano prima dell’iniezione in colonnacolonna

Separazione con Separazione con HPLC-MS di HPLC-MS di anabolizzanti in anabolizzanti in prodotti per l’infanzia prodotti per l’infanzia a base di carnea base di carnea)a) TICTIC

b)b) corrente ionica di corrente ionica di - e - e -zeranolo-zeranolo

c)c) corrente ionica di corrente ionica di - e - e -estradiolo e -estradiolo e -estradiolo -estradiolo deuterato deuterato (standard interno)(standard interno)

d)d) corrente ionica di corrente ionica di dietilstilbestrolodietilstilbestrolo

Una buona alternativa consiste nell’impiego dellaUna buona alternativa consiste nell’impiego della tecnica di tecnica di immunoaffinitàimmunoaffinità, che sfrutta una reazione tra l’analita ed un , che sfrutta una reazione tra l’analita ed un anticorpo specifico, in grado di legarlo; per questo motivo, essa anticorpo specifico, in grado di legarlo; per questo motivo, essa risulta molto più selettiva rispetto alle tecniche estrattive risulta molto più selettiva rispetto alle tecniche estrattive convenzionali. L’estrazione si realizza mediante colonnine convenzionali. L’estrazione si realizza mediante colonnine impaccate con un gel polisaccaridico di supporto a cui sono legati impaccate con un gel polisaccaridico di supporto a cui sono legati covalentemente gli anticorpi; il rilascio dell’analita si ottiene con un covalentemente gli anticorpi; il rilascio dell’analita si ottiene con un opportuno solvente che provoca una parziale denaturazione nella opportuno solvente che provoca una parziale denaturazione nella struttura dell’anticorpo, permettendo il rilascio deglistruttura dell’anticorpo, permettendo il rilascio deglianalitianaliti

La denaturazione è La denaturazione è reversibile entro certi reversibile entro certi limiti: ricondizionando la limiti: ricondizionando la fase legante con un fase legante con un opportuno tampone opportuno tampone acquoso, con pH e forza acquoso, con pH e forza ionica fisiologici, gli ionica fisiologici, gli anticorpi riacquisiscono anticorpi riacquisiscono la loro capacità legante e la loro capacità legante e quindi il materiale quindi il materiale sorbente può essere sorbente può essere riutilizzatoriutilizzato

Il contenuto di idrossiprolina, amminoacido tipico Il contenuto di idrossiprolina, amminoacido tipico delle proteine collagene ed elastina e assente in delle proteine collagene ed elastina e assente in altre proteine, è un indice della percentuale di altre proteine, è un indice della percentuale di tessuto connettivo nelle carni e nei preparati a tessuto connettivo nelle carni e nei preparati a base di carne (es. salumi) ed è inversamente base di carne (es. salumi) ed è inversamente proporzionale alla loro qualità proteica e, quindi, proporzionale alla loro qualità proteica e, quindi, commercialecommerciale

La determinazione si effettua per via La determinazione si effettua per via spettrofotometrica. Dopo idrolisi acida del spettrofotometrica. Dopo idrolisi acida del campione di carne con HCl, l’idrossiprolina è campione di carne con HCl, l’idrossiprolina è ossidata con clorammina T. Addizionando 4-ossidata con clorammina T. Addizionando 4-dimetilamminobenzaldeide si sviluppa una dimetilamminobenzaldeide si sviluppa una colorazione rossa di cui si misura l’assorbanzacolorazione rossa di cui si misura l’assorbanza

Determinazione Determinazione dell’idrossiprolinadell’idrossiprolina

Nitriti e nitrati sono sali di notevole importanza dal punto di Nitriti e nitrati sono sali di notevole importanza dal punto di vista tossicologico. Essi possono infatti generare vista tossicologico. Essi possono infatti generare nitrosammine, composti potenzialmente cancerogeni. La nitrosammine, composti potenzialmente cancerogeni. La tossicità dei nitriti è chiaramente superiore e il suo legame tossicità dei nitriti è chiaramente superiore e il suo legame con la formazione delle nitrosammine è più conclamato; con la formazione delle nitrosammine è più conclamato; tuttavia, anche in presenza di soli nitrati non può essere tuttavia, anche in presenza di soli nitrati non può essere esclusa la possibilità di riduzione a nitriti. In particolare nello esclusa la possibilità di riduzione a nitriti. In particolare nello stomaco ci sono le condizioni perché avvenga la seguente stomaco ci sono le condizioni perché avvenga la seguente reazione:reazione:

NONO33-- + 2H + 2H++ + 2e + 2e-- NO NO22

-- + H + H22OO

Nitrati e nitriti possono entrare nella composizione delle Nitrati e nitriti possono entrare nella composizione delle carni in quanto assunti dagli animali tramite l'acqua e le carni in quanto assunti dagli animali tramite l'acqua e le verdure concimate con preparati a base di azotoverdure concimate con preparati a base di azoto

Nitrati e nitritiNitrati e nitriti

Oltre alla possibile presenza iniziale nella carne, Oltre alla possibile presenza iniziale nella carne, queste sostanze sono ampiamente usate come queste sostanze sono ampiamente usate come additivi per prodotti carnei (E249 potassio nitrito, additivi per prodotti carnei (E249 potassio nitrito, E250 sodio nitrito, E251 sodio nitrato e E252 E250 sodio nitrito, E251 sodio nitrato e E252 potassio nitrato) in virtù delle proprietà ad ampio potassio nitrato) in virtù delle proprietà ad ampio spettro che si possono riassumere nei seguenti spettro che si possono riassumere nei seguenti punti:punti: sicurezza microbiologica, in particolare nel sicurezza microbiologica, in particolare nel

prevenire lo sviluppo del botulinoprevenire lo sviluppo del botulino stabilizzazione del colore, in quantità tre volte stabilizzazione del colore, in quantità tre volte

superiori a quelle necessarie come conservantisuperiori a quelle necessarie come conservanti prevenzione dei fenomeni di ossidazione lipidicaprevenzione dei fenomeni di ossidazione lipidica influenza sulla composizione aromatica, il tipico influenza sulla composizione aromatica, il tipico

cured aromacured aroma, non ottenibile con altre tecniche di , non ottenibile con altre tecniche di aromatizzazionearomatizzazione

I limiti di legge per le carni prevedono I limiti di legge per le carni prevedono un’addizione massima di 150 mg/kg per i nitriti e un’addizione massima di 150 mg/kg per i nitriti e 250 mg/kg per i nitrati. Da notare che un litro 250 mg/kg per i nitrati. Da notare che un litro d'acqua che contenesse la quantità massima di d'acqua che contenesse la quantità massima di nitriti o nitrati permessa per legge non sarebbe nitriti o nitrati permessa per legge non sarebbe potabile, in quanto i limiti per l’acqua sono potabile, in quanto i limiti per l’acqua sono rispettivamente 0 e 50 mg/lrispettivamente 0 e 50 mg/l

Attualmente sono allo studio sistemi alternativi Attualmente sono allo studio sistemi alternativi che non implichino l’impiego dei nitriti, per che non implichino l’impiego dei nitriti, per esempio addizionando zucchero e vitamina C (noto esempio addizionando zucchero e vitamina C (noto antiossidante). La comunità scientifica da un lato antiossidante). La comunità scientifica da un lato riconosce a nitrati e nitriti un ruolo non sostituibile riconosce a nitrati e nitriti un ruolo non sostituibile di difesa contro le malattie di origine batterica, di difesa contro le malattie di origine batterica, dall’altro è conscia della potenziale pericolosità dall’altro è conscia della potenziale pericolosità associata all’uso di queste sostanzeassociata all’uso di queste sostanze

Con tali premesse è evidente l'esigenza di Con tali premesse è evidente l'esigenza di individuare un metodo analitico universale, di individuare un metodo analitico universale, di facile applicazione e accurato per determinare facile applicazione e accurato per determinare nitriti e nitrati in carni e salumi. Il metodo ufficiale nitriti e nitrati in carni e salumi. Il metodo ufficiale per la determinazione nei prodotti carnei è per via per la determinazione nei prodotti carnei è per via spettrofotometrica ma prevede una procedura spettrofotometrica ma prevede una procedura laboriosa e resa difficoltosa dalla complessità della laboriosa e resa difficoltosa dalla complessità della matrice carnea, in cui si ritrovano macromolecole matrice carnea, in cui si ritrovano macromolecole di differente natura. Inoltre, il metodo di differente natura. Inoltre, il metodo spettrofotometrico fa ricorso a reattivi tossici e spettrofotometrico fa ricorso a reattivi tossici e richiede lunghi tempi di analisi. Il metodo è per richiede lunghi tempi di analisi. Il metodo è per questo motivo poco utilizzatoquesto motivo poco utilizzato

Sono stati quindi sviluppati diversi metodi in HPLC, Sono stati quindi sviluppati diversi metodi in HPLC, principalmente con sistema di rivelazione UV, ma principalmente con sistema di rivelazione UV, ma per la scarsa sensibilità necessitavano di lunghi per la scarsa sensibilità necessitavano di lunghi protocolli di clean-up durante la preparazione del protocolli di clean-up durante la preparazione del campionecampione

Per ovviare a questi inconvenienti, recentemente sono stati Per ovviare a questi inconvenienti, recentemente sono stati proposti metodi in cromatografia ionica, sia con sistema di proposti metodi in cromatografia ionica, sia con sistema di rivelazione UV sia in conducibilità soppressa. Inoltre, rivelazione UV sia in conducibilità soppressa. Inoltre, recentemente al sistema ionico può essere accoppiato uno recentemente al sistema ionico può essere accoppiato uno spettrometro di massa per la conferma dei picchi, nel spettrometro di massa per la conferma dei picchi, nel tentativo di identificare i possibili interferenti. Il sistema IC-tentativo di identificare i possibili interferenti. Il sistema IC-MS ha attualmente grandi potenzialità in campo MS ha attualmente grandi potenzialità in campo agroalimentareagroalimentare

Nei metodi di separazione cromatografica il passaggio critico Nei metodi di separazione cromatografica il passaggio critico è la preparazione dei campioni e in particolare la modalità di è la preparazione dei campioni e in particolare la modalità di estrazione degli anioni dalla matrice proteica. Le possibilità estrazione degli anioni dalla matrice proteica. Le possibilità sono due: estrazione mirata ad allontanare le sostanze sono due: estrazione mirata ad allontanare le sostanze interferenti (come i grassi), oppure estrazione selettiva per interferenti (come i grassi), oppure estrazione selettiva per gli analiti. In questo secondo caso buona accuratezza e gli analiti. In questo secondo caso buona accuratezza e riproducibilità si ottengono con una semplice estrazione in riproducibilità si ottengono con una semplice estrazione in fase acquosa in un omogeneizzatore, seguita da fase acquosa in un omogeneizzatore, seguita da centrifugazione e filtrazione. L’analisi dovrebbe essere centrifugazione e filtrazione. L’analisi dovrebbe essere completata dopo non più di 12 ore dall’estrazione, per completata dopo non più di 12 ore dall’estrazione, per evitare la conversione di nitrito a nitratoevitare la conversione di nitrito a nitrato

Determinazione di nitrato e nitrito in un campione Determinazione di nitrato e nitrito in un campione di prosciutto mediante IC e rivelazione di prosciutto mediante IC e rivelazione spettrofotometricaspettrofotometrica

1) nitrite, 1.16 ppm1) nitrite, 1.16 ppm

2) nitrate, 0.54 ppm2) nitrate, 0.54 ppm

Colonna: Dionex IonPac Colonna: Dionex IonPac AS11 e AG11AS11 e AG11

Eluente: NaOH 5 mMEluente: NaOH 5 mM

Rivelazione : UV, 225 Rivelazione : UV, 225 nmnm

Il contenuto di metalli nella carne è un parametro Il contenuto di metalli nella carne è un parametro di secondaria importanza. La carne contiene di secondaria importanza. La carne contiene soprattutto metalli alcalini e alcalino-terrosi (K in soprattutto metalli alcalini e alcalino-terrosi (K in quantità nettamente superiore, poi Mg, Ca e Na), quantità nettamente superiore, poi Mg, Ca e Na), oltre a discrete quantità di Fe e tracce di Cu, Mn, oltre a discrete quantità di Fe e tracce di Cu, Mn, Zn, Co e Mo. Si tratta quindi di elementi Zn, Co e Mo. Si tratta quindi di elementi desiderabili a livello fisiologico, per i quali desiderabili a livello fisiologico, per i quali l’assunzione di carne rappresenta una buona fontel’assunzione di carne rappresenta una buona fonte

La possibilità che siano presenti dosi elevate di La possibilità che siano presenti dosi elevate di metalli pesanti (Cd, Hg, Pb) è alquanto bassametalli pesanti (Cd, Hg, Pb) è alquanto bassa

Metalli pesantiMetalli pesanti

Con il termine Con il termine pescepesce si intendono le carni e le altre si intendono le carni e le altre parti edibili di animali acquatici forniti dalle attività parti edibili di animali acquatici forniti dalle attività di pesca e dall’acquacoltura. Più correttamente di pesca e dall’acquacoltura. Più correttamente l’ittiofauna è costituita da pesci veri e propri, l’ittiofauna è costituita da pesci veri e propri, molluschi, crostacei e altri gruppi di minor molluschi, crostacei e altri gruppi di minor interesseinteresse

È interessante notare che in tutto il mondo si È interessante notare che in tutto il mondo si consumano circa 1000 specie differenti di animali consumano circa 1000 specie differenti di animali acquaticiacquatici

Prodotti itticiProdotti ittici

La composizione del pesce è abbastanza simile a quella della La composizione del pesce è abbastanza simile a quella della carne, soprattutto per quanto riguarda la ripartizione dei carne, soprattutto per quanto riguarda la ripartizione dei macronutrienti. Le principali differenze riguardano:macronutrienti. Le principali differenze riguardano:

ComposizioneComposizione

le caratteristiche delle proteine, responsabili della diversa le caratteristiche delle proteine, responsabili della diversa consistenza delle carniconsistenza delle carni

la diversa qualità dei grassi, in particolare la presenza degli la diversa qualità dei grassi, in particolare la presenza degli acidi grassi polinsaturi omega 3acidi grassi polinsaturi omega 3

la presenza di particolari sostanze responsabili della la presenza di particolari sostanze responsabili della deperibilità dei prodotti ittici e del loro odore peculiaredeperibilità dei prodotti ittici e del loro odore peculiare

La composizione della carne varia ovviamente a seconda La composizione della carne varia ovviamente a seconda della specie, dell’età, dello stato nutrizionale e della specie, dell’età, dello stato nutrizionale e dell’alimentazione dell’animaledell’alimentazione dell’animale

ClasseClasse range %range %

AcquaAcqua 60 – 8060 – 80

ProteineProteine 15 – 2515 – 25

Composti azotati non proteiciComposti azotati non proteici 0.5 – 10.5 – 1

LipidiLipidi 0.5 – 220.5 – 22

CarboidratiCarboidrati 0.5 – 10.5 – 1

Sali mineraliSali minerali 0.8 - 20.8 - 2

VitamineVitamine traccetracce

I crostacei e i molluschi hanno caratteristiche leggermente I crostacei e i molluschi hanno caratteristiche leggermente diverse da quelle degli altri pesci, più simili a quelle del diverse da quelle degli altri pesci, più simili a quelle del pesce magropesce magro

Caratteristica dei pesci marini è la presenza Caratteristica dei pesci marini è la presenza dell’ossido di trimetilammina o TMAO, un dell’ossido di trimetilammina o TMAO, un composto azotato solubile che dopo la morte composto azotato solubile che dopo la morte dell’animale genera per reazioni batterica dell’animale genera per reazioni batterica trimetilammina, dimetilammina e formaldeide, trimetilammina, dimetilammina e formaldeide, dando luogo al tipico odore sgradevole dando luogo al tipico odore sgradevole di pescedi pesce

(CH(CH33))33NO NO (CH (CH33))33NN

N

H

Nei pesci d’acqua dolce la perdita Nei pesci d’acqua dolce la perdita di freschezza è invece segnalata di freschezza è invece segnalata da derivati della piperidina (dx), da derivati della piperidina (dx), composto eterociclico formatosi composto eterociclico formatosi dalla lisinadalla lisina

Il campione sottoposto all’analisi deve essere sempre Il campione sottoposto all’analisi deve essere sempre piuttosto voluminoso per ridurre al minimo le perdite di piuttosto voluminoso per ridurre al minimo le perdite di umidità. L’esemplare va pulito, eviscerato e deliscato; inoltre umidità. L’esemplare va pulito, eviscerato e deliscato; inoltre va rimossa la pelle, a meno che non sia necessario effettuare va rimossa la pelle, a meno che non sia necessario effettuare analisi del grasso o delleanalisi del grasso o delle

Problemi nell’analisiProblemi nell’analisi

sostanze liposolubili. Il campione va sostanze liposolubili. Il campione va poi finemente triturato e amalgamato poi finemente triturato e amalgamato in maniera analoga a quanto descritto in maniera analoga a quanto descritto per l’analisi della carne. Nel caso di per l’analisi della carne. Nel caso di analisi inorganiche, può essere analisi inorganiche, può essere semplicemente essiccato in muffolasemplicemente essiccato in muffola

Il campione così trattato va Il campione così trattato va mantenuto in un recipiente a tenuta mantenuto in un recipiente a tenuta d’aria in frigorifero fino al momento d’aria in frigorifero fino al momento dell’analisi, che deve essere eseguita dell’analisi, che deve essere eseguita nel più breve tempo possibilenel più breve tempo possibile

Anche per il pesce è prassi determinare parametri di routine Anche per il pesce è prassi determinare parametri di routine come l’umidità, le ceneri, l’azoto proteico e totale, i grassi. In come l’umidità, le ceneri, l’azoto proteico e totale, i grassi. In più c’è una serie di analisi specifiche utili a saggiare lo stato più c’è una serie di analisi specifiche utili a saggiare lo stato di freschezza del prodotto relativamente a:di freschezza del prodotto relativamente a:

Principali analisi per il Principali analisi per il pescepesce

alterazione della frazione lipidicaalterazione della frazione lipidica numero di perossidinumero di perossidi indice di acido tiobarbituricoindice di acido tiobarbiturico

alterazione della frazione proteica o dei composti azotatialterazione della frazione proteica o dei composti azotati indice di ipoxantinaindice di ipoxantina determinazione delle basi volatilideterminazione delle basi volatili determinazione della TMAdeterminazione della TMA

Ci sono poi test sulla genuinità del prodotto, relativi Ci sono poi test sulla genuinità del prodotto, relativi all’identificazione di diverse specie ittiche, e test riguardanti all’identificazione di diverse specie ittiche, e test riguardanti la presenza di sostanze tossichela presenza di sostanze tossiche

La determinazione del numero di perossidi è La determinazione del numero di perossidi è indicativa del grado di ossidazione primaria dei indicativa del grado di ossidazione primaria dei lipidi. Si esegue sulla frazione lipidica del lipidi. Si esegue sulla frazione lipidica del campione di pesce, in maniera analoga alla stessa campione di pesce, in maniera analoga alla stessa determinazione effettuata sull’olio, ovvero con una determinazione effettuata sull’olio, ovvero con una titolazione titolazione iodometricaiodometrica. Un volume noto di KI si . Un volume noto di KI si mette a contatto con la frazione lipidica del mette a contatto con la frazione lipidica del campione;campione;

KI + -O-O- KI + -O-O- I I22

lo iodio liberato dall’ossidazione degli eventuali lo iodio liberato dall’ossidazione degli eventuali perossidi presenti è poi titolato con tiosolfato in perossidi presenti è poi titolato con tiosolfato in presenza di indicatore salda d’amidopresenza di indicatore salda d’amido

Numero di perossidiNumero di perossidi

Si riferisce alla presenza di prodotti secondari Si riferisce alla presenza di prodotti secondari dell’ossidazione dei lipidi, in particolare l’aldeide malonica. dell’ossidazione dei lipidi, in particolare l’aldeide malonica. La determinazione è colorimetricaLa determinazione è colorimetrica

Dalla frazione lipidica estratta in solvente organico, l’aldeide Dalla frazione lipidica estratta in solvente organico, l’aldeide è estratta in solvente acquoso in presenza del reattivo acido è estratta in solvente acquoso in presenza del reattivo acido tiobarbiturico. Dopo riscaldamento, l’estratto sviluppa un tiobarbiturico. Dopo riscaldamento, l’estratto sviluppa un colore rosso di cui si misura l’assorbanza in confronto a colore rosso di cui si misura l’assorbanza in confronto a soluzioni standardsoluzioni standard

Indice di acido Indice di acido tiobarbituricotiobarbiturico

N

N

O

O

H

H

SH

O

OH

Si tratta di uno dei test più indicativi della freschezza del Si tratta di uno dei test più indicativi della freschezza del pesce. L’ipoxantina è una base purinica proveniente dal pesce. L’ipoxantina è una base purinica proveniente dal catabolismo degli acidi nucleici; inoltre costituisce il prodotto catabolismo degli acidi nucleici; inoltre costituisce il prodotto di degradazione dell’ATP muscolare, fenomeno la cui entità è di degradazione dell’ATP muscolare, fenomeno la cui entità è proporzionale alla freschezza del pesceproporzionale alla freschezza del pesce

Il metodo è nuovamente colorimetrico: si misura Il metodo è nuovamente colorimetrico: si misura l’assorbanza a 280 nm dell’acido urico generatosi per via l’assorbanza a 280 nm dell’acido urico generatosi per via enzimatica dall’ipoxantina a pH 8.2 in presenza di enzimatica dall’ipoxantina a pH 8.2 in presenza di xantinaossidasixantinaossidasi

xantinaossidasixantinaossidasi

Indice di ipoxantinaIndice di ipoxantina

N

NN

N

H

O

H

N

NN

N

H

O

H

O

H

H

O

Anche questo test è indicativo della freschezza del Anche questo test è indicativo della freschezza del pesce. Le basi volatili sono le ammine lineari TMA pesce. Le basi volatili sono le ammine lineari TMA e DMA, tipiche dei pesci marini, e l’ammoniaca, e DMA, tipiche dei pesci marini, e l’ammoniaca, principale base nei pesci di acqua dolce. principale base nei pesci di acqua dolce. Globalmente sono indicate come TVB, Total Globalmente sono indicate come TVB, Total Volatile Bases Volatile Bases

La determinazione si effettua per titolazione acido-La determinazione si effettua per titolazione acido-base. Le basi sono estratte dal campione di pesce base. Le basi sono estratte dal campione di pesce con acido perclorico; l’estratto è neutralizzato e con acido perclorico; l’estratto è neutralizzato e sottoposto a distillazione, raccogliendo il distillato sottoposto a distillazione, raccogliendo il distillato su una soluzione acida a titolo noto il cui eccesso su una soluzione acida a titolo noto il cui eccesso si determina per titolazione con basesi determina per titolazione con base

Determinazione delle basi Determinazione delle basi volatilivolatili

La trimetilammina è il principale La trimetilammina è il principale indicatore di freschezza nei pesci indicatore di freschezza nei pesci marini. Importante è il rapporto marini. Importante è il rapporto TMAO/TMA in quanto il tenore di TMAO/TMA in quanto il tenore di TMAO varia molto da specie a TMAO varia molto da specie a speciespecie

Determinazione della TMADeterminazione della TMA

NCH3

H3C

H3CN+O-

CH3

H3C

H3C

Per la determinazione del TMA e del TMAO (previa riduzione Per la determinazione del TMA e del TMAO (previa riduzione a TMA) ci sono alcuni metodi; il principale è il dosaggio a TMA) ci sono alcuni metodi; il principale è il dosaggio colorimetrico dopo reazione con acido picrico: si misura colorimetrico dopo reazione con acido picrico: si misura l’assorbanza a 420 nm del picrato di trimetilammina, giallol’assorbanza a 420 nm del picrato di trimetilammina, giallo

Il profilo elettroforetico delle proteine presenti in un campione può Il profilo elettroforetico delle proteine presenti in un campione può mettere in evidenza l’eventuale frode commerciale o la presenza di mettere in evidenza l’eventuale frode commerciale o la presenza di sostanze tossiche in un prodotto ittico. L’analisi prevede sostanze tossiche in un prodotto ittico. L’analisi prevede l’estrazione di un concentrato proteico da una frazione muscolare l’estrazione di un concentrato proteico da una frazione muscolare del campione, dal quale si elimina la frazione lipidica. La del campione, dal quale si elimina la frazione lipidica. La determinazione può essere effettuata anche sulle proteine determinazione può essere effettuata anche sulle proteine sarcoplasmatiche, solubili in acqua: in questo caso è sufficiente sarcoplasmatiche, solubili in acqua: in questo caso è sufficiente mettere a contatto il campione macinato con una soluzione mettere a contatto il campione macinato con una soluzione acquosa. L’analisi è effettua con la tecnica CZEacquosa. L’analisi è effettua con la tecnica CZE

InIn

Identificazione di diverse specie Identificazione di diverse specie itticheittiche

In questo esempio sono In questo esempio sono mostrati i tracciati relativi mostrati i tracciati relativi alle proteine solubili di alle proteine solubili di alcune specie di pesci alcune specie di pesci piatti quali platessa, piatti quali platessa, rombo e sogliola. La rombo e sogliola. La figura mostra figura mostra l’elettroferogramma di l’elettroferogramma di una miscela standard una miscela standard (Cyt, citocromo; Lys, (Cyt, citocromo; Lys, lisozima; Alb, albumina; lisozima; Alb, albumina; Conalb: conalbumina)Conalb: conalbumina)

RomboRombo SogliolaSogliola

Platessa europeaPlatessa europea Platessa Platessa americanaamericana

I prodotti ittici vanno incontro più di altri alimenti I prodotti ittici vanno incontro più di altri alimenti allo sviluppo di microorganismi e quindi possono allo sviluppo di microorganismi e quindi possono costituire un veicolo di malattie infettive, costituire un veicolo di malattie infettive, parassitosi, intossicazioni. Nel controllo dei parassitosi, intossicazioni. Nel controllo dei prodotti ittici è quindi molto importante la prodotti ittici è quindi molto importante la conoscenza dell’ambiente da cui proviene il conoscenza dell’ambiente da cui proviene il pescato, in quanto prodotti anche in ottimo stato pescato, in quanto prodotti anche in ottimo stato di salute possono trasmettere sostanze tossiche o di salute possono trasmettere sostanze tossiche o microorganismi patogeni per l’uomo. La presenza microorganismi patogeni per l’uomo. La presenza di sostanze tossiche può avere diverse origini:di sostanze tossiche può avere diverse origini:

Sostanze tossiche nei prodotti Sostanze tossiche nei prodotti itticiittici

attività microbicaattività microbica produzione endogena di biotossine (pesci produzione endogena di biotossine (pesci velenosi)velenosi)

contaminazioni ambientali, in particolare da contaminazioni ambientali, in particolare da mercuriomercurio

Le sostanze prodotte da attività microbica possono essere:Le sostanze prodotte da attività microbica possono essere:

tossine microbiche vere e proprie, come quella prodotta dal tossine microbiche vere e proprie, come quella prodotta dal Clostridium botulinumClostridium botulinum tipo E, uno dei pochi germi patogeni tipo E, uno dei pochi germi patogeni della flora indigena dei pesci; esso può risultare presente della flora indigena dei pesci; esso può risultare presente anche in pesci che vivono in zone incontaminate, ma anche in pesci che vivono in zone incontaminate, ma fortunatamente la tossina è distrutta con la cottura; un fortunatamente la tossina è distrutta con la cottura; un altro esempio è la tossina stafilococcica, prodotta dallo altro esempio è la tossina stafilococcica, prodotta dallo Stafilococcus aureusStafilococcus aureus che fa parte della flora accidentale del che fa parte della flora accidentale del pesce: si tratta di un composto più termostabile; infine, pesce: si tratta di un composto più termostabile; infine, l’esotossina termolabile di natura proteica prodotta dal l’esotossina termolabile di natura proteica prodotta dal Vibrio coleraeVibrio colerae, responsabile dell’epidemia di colera del , responsabile dell’epidemia di colera del 1973 a Napoli1973 a Napoli

composti che si formano durante i processi di alterazione: composti che si formano durante i processi di alterazione: molti casi di intossicazione in seguito a consumo di pesce molti casi di intossicazione in seguito a consumo di pesce sono stati attribuiti alla presenza di istamina formatasi a sono stati attribuiti alla presenza di istamina formatasi a partire dall’istidinapartire dall’istidina

L’istamina proviene dalla decarbossilazione dell’istidina:L’istamina proviene dalla decarbossilazione dell’istidina:

Numerose specie batteriche contengono l’enzima decarbossilasi, Numerose specie batteriche contengono l’enzima decarbossilasi, tra cui tra cui EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceae, , PseudomonasPseudomonas, , Clostridium perfrigensClostridium perfrigens, , Vibrio sppVibrio spp e soprattutto e soprattutto Morganella morganiiMorganella morganii

Livelli tossici di istamina si possono trovare solo nei pesci a carne Livelli tossici di istamina si possono trovare solo nei pesci a carne rossa, che contengono elevate quantità di istidina libera, e non, in rossa, che contengono elevate quantità di istidina libera, e non, in quelli a carne bianca e in crostacei e molluschi. Il limite di legge è quelli a carne bianca e in crostacei e molluschi. Il limite di legge è 100 mg/Kg. Da notare che l’100 mg/Kg. Da notare che l’ingestione di 70–1000 mg per singolo ingestione di 70–1000 mg per singolo pasto può condurre al cosiddetto pasto può condurre al cosiddetto avvelenamento sgombroideavvelenamento sgombroide che in che in soggetti particolarmente sensibili porta alla mortesoggetti particolarmente sensibili porta alla morte

N NH

H2C C

H

NH2

COOH

N NH

H2C C

H

NH2

HL-istidin-decarbossilasi

- CO2

La determinazione dell’istamina si può effettuare per HPLC, per IC o La determinazione dell’istamina si può effettuare per HPLC, per IC o per CZE, sfruttando il suo comportamento basico. L’analita è per CZE, sfruttando il suo comportamento basico. L’analita è estratto dal campione di pesce con una soluzione acida (HCl o estratto dal campione di pesce con una soluzione acida (HCl o HClOHClO44))

Nella figura sono mostrati Nella figura sono mostrati il cromatogramma il cromatogramma ottenuto con HPLC (sopra) ottenuto con HPLC (sopra) e l’elettroferogramma e l’elettroferogramma (sotto) di un campione di (sotto) di un campione di tonno addizionato con tonno addizionato con istamina (picco 1) e lo istamina (picco 1) e lo standard interno 1,1-standard interno 1,1-dimetilbiguanide (picco dimetilbiguanide (picco 2); in entrambi i casi il 2); in entrambi i casi il rivelatore è un DAD, cioè rivelatore è un DAD, cioè un Diode Array Detectorun Diode Array Detector

Essendo una base, l’istamina si può anche separare per Essendo una base, l’istamina si può anche separare per cromatografia ionica. L’estrazione dal campione di pesce avviene cromatografia ionica. L’estrazione dal campione di pesce avviene sempre con una soluzione acida; gli eventuali grassi presenti sono sempre con una soluzione acida; gli eventuali grassi presenti sono eliminati per controestrazione con esano e per passaggio su eliminati per controestrazione con esano e per passaggio su colonnina RP-C18colonnina RP-C18

La separazione avviene su La separazione avviene su colonna a scambio colonna a scambio cationico ed eluente acido cationico ed eluente acido perclorico. Un reattivo perclorico. Un reattivo post-colonna contenente post-colonna contenente NaOH favorisce la NaOH favorisce la rivelazione in rivelazione in amperometria pulsata con amperometria pulsata con elettrodo di oroelettrodo di oro

picco 1: istamina in un picco 1: istamina in un campione di tonnocampione di tonno

Oltre all’istamina e alla già citata TMA, è utile verificare la presenza nel Oltre all’istamina e alla già citata TMA, è utile verificare la presenza nel pesce di altre ammine biogeniche. In condizioni di stoccaggio non corretto, pesce di altre ammine biogeniche. In condizioni di stoccaggio non corretto, esse si possono formare a seguito di disponibilità di amminoacidi liberi in esse si possono formare a seguito di disponibilità di amminoacidi liberi in presenza di batteri capaci di operare la decarbossilazione. Le più importanti presenza di batteri capaci di operare la decarbossilazione. Le più importanti ammine biogeniche nei prodotti ittici sono cadaverina, putrescina, ammine biogeniche nei prodotti ittici sono cadaverina, putrescina, spermidina, spermina, agmatina (alifatiche), tiramina (alicicliche), istamina e spermidina, spermina, agmatina (alifatiche), tiramina (alicicliche), istamina e triptammina (eterocicliche). La loro presenza è un indice di deterioramento triptammina (eterocicliche). La loro presenza è un indice di deterioramento dovuto ad attività battericadovuto ad attività batterica

H2N (CH2)4 NH2

H2N (CH2)5 NH2

La determinazione delle ammine biogene si può La determinazione delle ammine biogene si può effettuare con HPLC, con IC oppure, in maniera più effettuare con HPLC, con IC oppure, in maniera più semplice, con TLC. L’estrazione dal campione può semplice, con TLC. L’estrazione dal campione può avvenire con una soluzione diavvenire con una soluzione di

CadaverinaCadaverina

PutrescinaPutrescina

acido tricloroacetico; in acido tricloroacetico; in seguito l’estratto è seguito l’estratto è trattato con cloruro di trattato con cloruro di dansile per trasformare dansile per trasformare le ammine in una forma le ammine in una forma più adatta alla più adatta alla separazioneseparazionePer la separazione in TLC (sx) si Per la separazione in TLC (sx) si

usa una lastrina di gel di silice e usa una lastrina di gel di silice e una miscela eluente una miscela eluente cloroformio/dietil cloroformio/dietil etere/trietilammina 6:4:1; la etere/trietilammina 6:4:1; la rivelazione è fluorimetricarivelazione è fluorimetrica

La determinazione delle ammine biogene con IC, anche se richiede una La determinazione delle ammine biogene con IC, anche se richiede una strumentazione più costosa della TLC, è relativamente pratica. La procedura strumentazione più costosa della TLC, è relativamente pratica. La procedura è analoga a quanto descritto per l’istamina: estrazione dal campione in è analoga a quanto descritto per l’istamina: estrazione dal campione in ambiente acido, purificazione con RP-C18, separazione in scmbio cationico e ambiente acido, purificazione con RP-C18, separazione in scmbio cationico e rivelazione amperometrica in ambiente basicorivelazione amperometrica in ambiente basico

Per quanto riguarda le sostanze tossiche di natura endogena, va detto che Per quanto riguarda le sostanze tossiche di natura endogena, va detto che nel Mediterraneo non sono presenti specie ittiche velenose. Unica eccezione nel Mediterraneo non sono presenti specie ittiche velenose. Unica eccezione è rappresentata dai pesci anguilliformi (murena, grongo, anguilla) che è rappresentata dai pesci anguilliformi (murena, grongo, anguilla) che contengono una tossina termolabile, inattivata in fase di cotturacontengono una tossina termolabile, inattivata in fase di cottura

Tra i pesci esotici, invece, esistono molte verietà velenose: il pesce palla, Tra i pesci esotici, invece, esistono molte verietà velenose: il pesce palla, una vera prelibatezza per i Giapponesi, può risultare fatale per il una vera prelibatezza per i Giapponesi, può risultare fatale per il consumatore se non è preparato adeguatamente. Nel 1977 in Italia, ci consumatore se non è preparato adeguatamente. Nel 1977 in Italia, ci furono diversi casi di intossicazioni, di cui uno mortale, a causa di alcune furono diversi casi di intossicazioni, di cui uno mortale, a causa di alcune code di pesce palla erroneamente inserite all'interno di una partita di rane code di pesce palla erroneamente inserite all'interno di una partita di rane pescatrici decapitate o pescatrici decapitate o code di rospocode di rospo; i due pesci, decapitati ed eviscerati, ; i due pesci, decapitati ed eviscerati, possono essere confusipossono essere confusi

Coda di rospoCoda di rospo

Pesce pallaPesce palla

La tossina prodotta dal pesce palla e dai La tossina prodotta dal pesce palla e dai tetraodontidi (ordine a cui esso appartiene) è tetraodontidi (ordine a cui esso appartiene) è una potente neurotossina termostabile: la una potente neurotossina termostabile: la tetraodotossina o TTX (dx). L’azione di tetraodotossina o TTX (dx). L’azione di questa tossina si esercita sul sistema questa tossina si esercita sul sistema nervoso, bloccando la conduzione degli nervoso, bloccando la conduzione degli impulsi nervosi e provocando la paralisi; impulsi nervosi e provocando la paralisi; l’avvelenamento è noto come Puffer Fish l’avvelenamento è noto come Puffer Fish Poisoning o PFP. Una dose di 1-2 mg è già Poisoning o PFP. Una dose di 1-2 mg è già letale per l’uomoletale per l’uomo

Un’altra neurotossina che provoca effetti analoghi Un’altra neurotossina che provoca effetti analoghi è la saxitossina (sx), contraibile attraverso è la saxitossina (sx), contraibile attraverso l’assunzione di molluschi lamellibranchi. Si tratta di l’assunzione di molluschi lamellibranchi. Si tratta di un alcaloide termostabile che causa un alcaloide termostabile che causa un’intossicazione spesso mortale, nota come un’intossicazione spesso mortale, nota come Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), un esempio Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), un esempio delle sindromi causate da molluschi bivalvi per delle sindromi causate da molluschi bivalvi per azione delle cosiddette azione delle cosiddette shellfish toxinsshellfish toxins. Mitili, . Mitili, ostriche e altri bivalvi si nutrono di alghe ostriche e altri bivalvi si nutrono di alghe dinoflagellate velenose senza morire e così facendo dinoflagellate velenose senza morire e così facendo trasmettono iltrasmettono il

veleno al consumatore. Altri tipi di avvelenamento sono noti come Diarrhetic veleno al consumatore. Altri tipi di avvelenamento sono noti come Diarrhetic (DSP), Neurotoxic (NSP) e Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), dagli effetti (DSP), Neurotoxic (NSP) e Amnesic Shellfish Poisoning (ASP), dagli effetti facilmente intuibilifacilmente intuibili

Un altro tipo di intossicazione è la ciguatera, causata da pesci che vivono Un altro tipo di intossicazione è la ciguatera, causata da pesci che vivono lungo le barriere coralline. Le tossine sono prodotte da organismi bentonici lungo le barriere coralline. Le tossine sono prodotte da organismi bentonici ed entrano nella catena alimentare fino ai pesci, rendendoli tossici per vari ed entrano nella catena alimentare fino ai pesci, rendendoli tossici per vari annianni

Le tossine endogene descritte sono di natura complessa; la loro Le tossine endogene descritte sono di natura complessa; la loro determinazione quali- e quantitativa richiede metodi efficaci di determinazione quali- e quantitativa richiede metodi efficaci di pretrattamento e di separazione. In più le TTXs non hanno gruppi cromofori, pretrattamento e di separazione. In più le TTXs non hanno gruppi cromofori, quindi non si può impiegare la classica rivelazione UV-visibile. È possibile quindi non si può impiegare la classica rivelazione UV-visibile. È possibile sfruttarne il comportamento acido/base per ottenere le condizioni adatte di sfruttarne il comportamento acido/base per ottenere le condizioni adatte di estrazione ed eluizioneestrazione ed eluizione

In questo esempio un’aliquota di pesce In questo esempio un’aliquota di pesce Fugu pardalisFugu pardalis (un (un tetraodontide tetraodontide comune nei mari del Giappone) è estratta a caldo con acido acetico diluito; comune nei mari del Giappone) è estratta a caldo con acido acetico diluito; l’estratto è filtrato, purificato per passaggio su resina a fase inversa e poi l’estratto è filtrato, purificato per passaggio su resina a fase inversa e poi per estrazione con CHClper estrazione con CHCl33. La soluzione residua è analizzata con IIC (Ion . La soluzione residua è analizzata con IIC (Ion Interaction Chromatography) con rivelazione fluorimetrica. Usando fasi Interaction Chromatography) con rivelazione fluorimetrica. Usando fasi mobili leggermente diverse è possibile separare le TTXs (sx) e le saxitossine mobili leggermente diverse è possibile separare le TTXs (sx) e le saxitossine (dx) in vari organi del pesce in esame (dx) in vari organi del pesce in esame

In questo esempio è impiegata la tecnica CZE per la separazione di tossine In questo esempio è impiegata la tecnica CZE per la separazione di tossine ASP (acido domoico) e PSP da molluschi prelevati in Galizia. L’estrazione dal ASP (acido domoico) e PSP da molluschi prelevati in Galizia. L’estrazione dal campione di tessuto omogeneizzato si effettua con miscela acqua/metanolo campione di tessuto omogeneizzato si effettua con miscela acqua/metanolo 1:1. Per la determinazione delle tossine ASP, l’estratto è purificato 1:1. Per la determinazione delle tossine ASP, l’estratto è purificato passandolo prima supassandolo prima suresina a scambio anionico, da cui gli analiti resina a scambio anionico, da cui gli analiti

sono desorbiti con acido formico, e poi su sono desorbiti con acido formico, e poi su resina a scambio cationico da cui gli analiti resina a scambio cationico da cui gli analiti sono desorbitisono desorbiticon sodio tetraborato/acetonitrile; la con sodio tetraborato/acetonitrile; la

separazione CZE (sx) è effettuata su separazione CZE (sx) è effettuata su capillare di silice e la rivelazione è capillare di silice e la rivelazione è spettrofotometrica a 242 nm. Per le spettrofotometrica a 242 nm. Per le tossine PSP, l’estratto è purificato su tossine PSP, l’estratto è purificato su resina C18 e filtrato; la separazione resina C18 e filtrato; la separazione CZE (dx) è effettuata su capillare PVA CZE (dx) è effettuata su capillare PVA e rivelazione UV a 200 nme rivelazione UV a 200 nm

A differenza della carne, nel pesce la contaminazione da metalli A differenza della carne, nel pesce la contaminazione da metalli pesanti rappresenta un aspetto da non sottovalutare. Innanzitutto pesanti rappresenta un aspetto da non sottovalutare. Innanzitutto l’ambiente in cui si sviluppano i pesci, marino, lacustre o fluviale l’ambiente in cui si sviluppano i pesci, marino, lacustre o fluviale che sia, può essere considerato una soluzione più o meno diluita di che sia, può essere considerato una soluzione più o meno diluita di ioni metallici con cui i pesci stessi possono interagire. Alcuni ioni metallici con cui i pesci stessi possono interagire. Alcuni organismi acquatici, inoltre, hanno spiccata tendenza a organismi acquatici, inoltre, hanno spiccata tendenza a preconcentrare ioni metallici come mercurio e piombo; in casi preconcentrare ioni metallici come mercurio e piombo; in casi particolarmente sfavorevoli (es. Minamata) gli organismi possono particolarmente sfavorevoli (es. Minamata) gli organismi possono modificare la forma chimica degli ioni assorbiti, secondo reazioni di modificare la forma chimica degli ioni assorbiti, secondo reazioni di biotrasformazione (in questo caso biotrasformazione (in questo caso biometilazionebiometilazione))

HgHg2+2+ CH CH33HgHg++

in cui la forma risultante è notevolmente più tossica, per l’uomo, in cui la forma risultante è notevolmente più tossica, per l’uomo, rispetto a quella originaria in quanto si tratta di un composto che rispetto a quella originaria in quanto si tratta di un composto che può penetrare attraverso le membrane cellulari e accumularsi può penetrare attraverso le membrane cellulari e accumularsi nell’organismo, a differenza della specie inorganicanell’organismo, a differenza della specie inorganica

Per questo motivo è molto importante conoscere l’ambiente da cui Per questo motivo è molto importante conoscere l’ambiente da cui proviene il pesce pescatoproviene il pesce pescato

Metalli pesanti nel pesceMetalli pesanti nel pesce

Il contenuto di mercurio nei prodotti ittici rappresenta un Il contenuto di mercurio nei prodotti ittici rappresenta un caso di particolare rilevanza, in quanto il pesce (soprattutto caso di particolare rilevanza, in quanto il pesce (soprattutto predatori di grossa taglia come tonno, pesce spada, predatori di grossa taglia come tonno, pesce spada, palombo, anguilla, luccio, ecc.) è la fonte principale, sebbene palombo, anguilla, luccio, ecc.) è la fonte principale, sebbene indesiderata, di questo metallo nella nostra dietaindesiderata, di questo metallo nella nostra dieta

Il mercurioIl mercurio

La tossicità del mercurio è La tossicità del mercurio è nota da secolinota da secoli

L’impiego di sali si L’impiego di sali si mercurio nella mercurio nella lavorazione del pellame lavorazione del pellame per la fabbricazione di per la fabbricazione di cappelli di feltro causava cappelli di feltro causava danni al sistema danni al sistema nervoso, come è nervoso, come è testimoniato dal bizzarro testimoniato dal bizzarro comportamento del comportamento del Cappellaio Matto in Cappellaio Matto in Alice Alice nel Paese delle nel Paese delle MeraviglieMeraviglie

Nelle acque la concentrazione di Hg totale si aggira Nelle acque la concentrazione di Hg totale si aggira attorno alle decine di ng/l (a parte casi particolari, es. attorno alle decine di ng/l (a parte casi particolari, es. Priolo 2001 con concentrazioni 20.000 superiori alla Priolo 2001 con concentrazioni 20.000 superiori alla norma). Il mercurio presente nell'acqua viene ingerito dal norma). Il mercurio presente nell'acqua viene ingerito dal plancton e risale via via la catena alimentare, diventando plancton e risale via via la catena alimentare, diventando sempre più concentrato. È il cosiddetto fenomeno del sempre più concentrato. È il cosiddetto fenomeno del bioaccumulo. bioaccumulo. I pesci che sono al vertice della piramide I pesci che sono al vertice della piramide alimentare arrivano ad avere una concentrazione da alimentare arrivano ad avere una concentrazione da 3.000 a 27.000 volte maggiore di quella dell'acqua in cui 3.000 a 27.000 volte maggiore di quella dell'acqua in cui vivono; nelle ostriche si arriva a 100.000 voltevivono; nelle ostriche si arriva a 100.000 volte

Il mercurio nel mareIl mercurio nel mare

I pesci più contaminati I pesci più contaminati contengono 0.1-0.3 ppm di contengono 0.1-0.3 ppm di Hg. In acque molto Hg. In acque molto contaminate (es. Reno in contaminate (es. Reno in Germania) il contenuto può Germania) il contenuto può arrivare a 2 ppm. All’apice arrivare a 2 ppm. All’apice della catena alimentare si della catena alimentare si può arrivare a 20 ppm. può arrivare a 20 ppm. Nell'uomo si ha un'ulteriore Nell'uomo si ha un'ulteriore concentrazione e quando Hg concentrazione e quando Hg nel cervello supera certi nel cervello supera certi valori, sopraggiungono i valori, sopraggiungono i problemi neurologiciproblemi neurologici

Per la determinazione del mercurio totale le tecniche più sensibili sono la Per la determinazione del mercurio totale le tecniche più sensibili sono la spettroscopia di fluorescenza atomica (AFS) e la spettroscopia di spettroscopia di fluorescenza atomica (AFS) e la spettroscopia di assorbimento atomico. In entrambi i casi la sensibilità può essere assorbimento atomico. In entrambi i casi la sensibilità può essere fortemente incrementata con il sistema detto fortemente incrementata con il sistema detto a vapori freddia vapori freddi o o cold vapourcold vapour (CV-AFS e CV-AAS). Si tratta di trasformare il mercurio presente come ione (CV-AFS e CV-AAS). Si tratta di trasformare il mercurio presente come ione HgHg2+2+ in mercurio elementare Hg in mercurio elementare Hg00, per mezzo di una riduzione , per mezzo di una riduzione in situin situ con con agenti riducenti quali SnClagenti riducenti quali SnCl22 o NaBH o NaBH44; la specie Hg; la specie Hg00 è poi istantaneamente è poi istantaneamente volatilizzata (da cui il termine vapori freddi) e atomizzata da un flusso di volatilizzata (da cui il termine vapori freddi) e atomizzata da un flusso di azoto o aria e portata alla cella di determinazioneazoto o aria e portata alla cella di determinazione

HgHg2+2+ + Sn + SnIIIIClCl22 Hg Hg00 + Sn + SnIVIVClCl22Per abbassare i limiti Per abbassare i limiti di rivelabilità, nel di rivelabilità, nel percorso precedente percorso precedente alla cella è possibile alla cella è possibile inserire una trappola inserire una trappola di oro che funga da di oro che funga da preconcentratore, preconcentratore, dal quale il mercuriodal quale il mercuriotrattenuto è trattenuto è rilasciato per rilasciato per desorbimento desorbimento termico. Il lod di Hg termico. Il lod di Hg può scendere fino a può scendere fino a frazioni di ppt (ng/l)frazioni di ppt (ng/l)

La determinazione con le tecniche di spettroscopia atomica si effettua per La determinazione con le tecniche di spettroscopia atomica si effettua per via umida, il che richiede la solubilizzazione del campione o per lo meno via umida, il che richiede la solubilizzazione del campione o per lo meno dell’analita, con problemi notevoli di contaminazione; non è consigliabile, dell’analita, con problemi notevoli di contaminazione; non è consigliabile, per esempio, effettuare le analisi in un laboratorio in cui si svolgono analisi per esempio, effettuare le analisi in un laboratorio in cui si svolgono analisi polarografiche o voltammetriche. Generalmente è bene lavare la vetreria polarografiche o voltammetriche. Generalmente è bene lavare la vetreria con HNOcon HNO33 prima di procedere al trattamento del campione prima di procedere al trattamento del campione

La determinazione del mercurio nel pesce si effettua estraendo l’analita con La determinazione del mercurio nel pesce si effettua estraendo l’analita con una miscela acida. Il campione deve essere omogeneizzato ed essiccato a una miscela acida. Il campione deve essere omogeneizzato ed essiccato a bassa temperatura per evitare perdite di analita: il mercurio elementare, bassa temperatura per evitare perdite di analita: il mercurio elementare, che è liquido a temperatura ambiente, può passare in fase vapore già a che è liquido a temperatura ambiente, può passare in fase vapore già a 100°C, per cui il trattamento del campione da analizzare è un passaggio 100°C, per cui il trattamento del campione da analizzare è un passaggio estremamente critico. Essiccamento prolungato a bassa temperatura (< estremamente critico. Essiccamento prolungato a bassa temperatura (< 60°C) o liofilizzazione sono da preferire per avere un campione secco da cui 60°C) o liofilizzazione sono da preferire per avere un campione secco da cui partire; sul secco si può effettuare una digestione acida con HNOpartire; sul secco si può effettuare una digestione acida con HNO33 coadiuvata da Hcoadiuvata da H22OO22 per liberare l’analita dagli eventuali gruppi complessanti per liberare l’analita dagli eventuali gruppi complessanti presenti nelle macromolecole (es. gruppi tiolici negli amminoacidi metionina, presenti nelle macromolecole (es. gruppi tiolici negli amminoacidi metionina, cistina e cisteina). La digestione è più efficiente se effettuata in forno a cistina e cisteina). La digestione è più efficiente se effettuata in forno a microonde in bomba di teflonmicroonde in bomba di teflon

Questa procedura porta naturalmente alla determinazione del mercurio Questa procedura porta naturalmente alla determinazione del mercurio totale, in quanto le eventuali forme di mercurio organico sono degradate a totale, in quanto le eventuali forme di mercurio organico sono degradate a mercurio inorganicomercurio inorganico

HNOHNO33

HgHg2+2+, C, CxxHHyyHgHgn+n+ Hg Hg2+2+

ione mercurio Hgione mercurio Hg2+2+ e relativi sali e relativi sali vapori di mercurio elementale Hgvapori di mercurio elementale Hg00

composti di organomercurio, es. composti di organomercurio, es. CHCH33HgCl, CHHgCl, CH33CHCH22HgCl, (CHHgCl, (CH33))22HgHg

La tossicità del mercurio varia notevolmente a La tossicità del mercurio varia notevolmente a seconda della sua forma chimico-fisica. Essa si seconda della sua forma chimico-fisica. Essa si incrementa nella serie:incrementa nella serie:

L’UE ha stabilito un limite massimo di 0.5 mg/Kg nelle parti L’UE ha stabilito un limite massimo di 0.5 mg/Kg nelle parti commestibili di pesci e molluschi (peso umido), ma nessun commestibili di pesci e molluschi (peso umido), ma nessun limite è stato indicato per forme di organomercurio, forse per limite è stato indicato per forme di organomercurio, forse per la difficoltà di applicare sistematicamente le procedure la difficoltà di applicare sistematicamente le procedure analitiche di speciazioneanalitiche di speciazione

In effetti la In effetti la speciazionespeciazione, cioè la determinazione delle varie , cioè la determinazione delle varie forme chimico-fisiche in cui un elemento può essere forme chimico-fisiche in cui un elemento può essere presente, è un compito estremamente complesso, sia perché presente, è un compito estremamente complesso, sia perché i composti possono essere instabili o altamente reattivi, sia i composti possono essere instabili o altamente reattivi, sia perché le concentrazioni in gioco sono spesso al di sotto perché le concentrazioni in gioco sono spesso al di sotto delle capacità delle tecniche analitiche convenzionali. In delle capacità delle tecniche analitiche convenzionali. In definitiva, per eseguire uno studio di speciazione è definitiva, per eseguire uno studio di speciazione è necessario rivolgersi alle tecniche accoppiate o necessario rivolgersi alle tecniche accoppiate o ifenateifenate (dall’inglese (dall’inglese hyphenhyphen che indica il trattino di sillabazione) che indica il trattino di sillabazione) nelle quali un sistema cromatografico è interfacciato, o, nelle quali un sistema cromatografico è interfacciato, o, appunto, ifenato, ad un sistema di rivelazione spettroscopica appunto, ifenato, ad un sistema di rivelazione spettroscopica che funge da rivelatore non convenzionaleche funge da rivelatore non convenzionale

Questa combinazione sfrutta i vantaggi di Questa combinazione sfrutta i vantaggi di entrambi i sistemi:entrambi i sistemi: la parte cromatografica produce frazioni pure di la parte cromatografica produce frazioni pure di analitaanalita

la parte spettrale fornisce informazioni su un la parte spettrale fornisce informazioni su un componente purocomponente puro

Le tecniche ifenate Le tecniche ifenate più comuni sono GC-più comuni sono GC-MS ed LC-MS, MS ed LC-MS, disponibili in versioni disponibili in versioni commerciali commerciali largamente diffuse. largamente diffuse. Altre tecniche sono Altre tecniche sono meno diffuse, es. GC-meno diffuse, es. GC-ICP/MS (sotto), LC-ICP/MS (sotto), LC-ICP/MSICP/MS

Nel caso del mercurio, le tecniche di speciazione devono fare i conti Nel caso del mercurio, le tecniche di speciazione devono fare i conti con un elemento presente in concentrazioni solitamente e con un elemento presente in concentrazioni solitamente e fortunatamente basse, e con forme chimiche alquanto volatili. fortunatamente basse, e con forme chimiche alquanto volatili. Mentre la separazione delle varie forme non è un problema dal Mentre la separazione delle varie forme non è un problema dal punto di vista cromatografico (si può effettuare in GC, in HPLC e in punto di vista cromatografico (si può effettuare in GC, in HPLC e in IC), può esserlo l’impiego dei rivelatori convenzionali per IC), può esserlo l’impiego dei rivelatori convenzionali per cromatografia che non hanno la necessaria sensibilità. Attualmente, cromatografia che non hanno la necessaria sensibilità. Attualmente, però, è possibile impiegare i sistemi ifenati (es. GC-ICP-AES, sotto)però, è possibile impiegare i sistemi ifenati (es. GC-ICP-AES, sotto)

In particolare il sistema CV costituisce il miglior sistema di In particolare il sistema CV costituisce il miglior sistema di rivelazione in interfacciamento a sistemi cromatograficirivelazione in interfacciamento a sistemi cromatografici

Schema di un sistema HPLC-CV-AASSchema di un sistema HPLC-CV-AASSchema di un sistema HPLC-CV-Schema di un sistema HPLC-CV-

AASAAS

1

2

3

5

6

7

89

10

11

13

12

14

1516scarico

4

scarico

1 Serbatoio di eluente

2 Modulo cromatografico

3 Valvola d’iniezione

4 Colonnina di preconcentrazione

5 Colonna cromatografica

6 Giunzione a T

7 Pompa per HPLC

8 Serbatoio di NaBH4

9 Cella a flusso

10 Gas di trasporto (N2)

11 Flussimetro

12,13

Setti porosi di vetro

14 Trappola di Mg(ClO4)2

15 Rivelatore CV-AAS

16 Registratore

per trattamento con composti solforati, come per trattamento con composti solforati, come la tiourea e la cisteina (dx), i cui gruppi =S ed la tiourea e la cisteina (dx), i cui gruppi =S ed –SH sono in grado di estrarre tutti i composti –SH sono in grado di estrarre tutti i composti di mercurio presenti nel campionedi mercurio presenti nel campione

per conversione dei composti di mercurio nei per conversione dei composti di mercurio nei corrispondenti alogenuri ed estrazione in corrispondenti alogenuri ed estrazione in solvente organico; eventualmente si effettua solvente organico; eventualmente si effettua una controestrazione in soluzione acquosa di una controestrazione in soluzione acquosa di cisteina se la tecnica cromatografica non è cisteina se la tecnica cromatografica non è compatibile con solventi organici (es. IC)compatibile con solventi organici (es. IC)

Per applicare le tecniche di speciazione, che operano comunque per Per applicare le tecniche di speciazione, che operano comunque per via umida, è necessario un pretrattamento che non alteri le forme via umida, è necessario un pretrattamento che non alteri le forme chimiche presenti. Non è possibile quindi impiegare miscele chimiche presenti. Non è possibile quindi impiegare miscele ossidanti per solubilizzare il campione di pesce, in quanto ciò ossidanti per solubilizzare il campione di pesce, in quanto ciò causerebbe la rottura del legame C-Hgcauserebbe la rottura del legame C-Hg

La solubilizzazione si può eseguire in vari modi:La solubilizzazione si può eseguire in vari modi:

S

NH2H2N

HS CH2 CH

NH3

COOH

TioureaTiourea

CisteinaCisteina

In questo esempio è mostrata l’analisi di un campione di tonno In questo esempio è mostrata l’analisi di un campione di tonno BCR, cioè il cui contenuto di Hg è certificato e pari a 3.52 ppm. Il BCR, cioè il cui contenuto di Hg è certificato e pari a 3.52 ppm. Il campione omogeneizzato, liofilizzato ed estratto con soluzione di campione omogeneizzato, liofilizzato ed estratto con soluzione di tiourea, è analizzato mediante HPLC in fase inversa trasformando tiourea, è analizzato mediante HPLC in fase inversa trasformando tutte le specie presenti in complessi neutri con il chelante APDC tutte le specie presenti in complessi neutri con il chelante APDC (ammonio pirrolidin ditiocarbammato)(ammonio pirrolidin ditiocarbammato)

1)1) CHCH33HgHg++

2)2) CC22HH55HgHg++

3)3) HgHg2+2+

a)a) campione tal qualecampione tal quale

b)b) campione campione addizionato con addizionato con CHCH33HgHg++, C, C22HH55HgHg++ e e HgHg2+2+