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Sommario __________________________________________________________________________________________________________________________

i

UUNNIIVVEERRSSIITTÀÀ DDEEGGLLII SSTTUUDDII DDII BBAARRII

FFAACCOOLLTTÀÀ DDII MMEEDDIICCIINNAA EE CCHHIIRRUURRGGIIAA

TTEESSII DDII LLAAUURREEAA SSPPEERRIIMMEENNTTAALLEE

IINNFFEEZZIIOONNEE DDAA BBUURRKKHHOOLLDDEERRIIAA CCEEPPAACCIIAA

NNEEII PPAAZZIIEENNTTII CCOONN FFIIBBRROOSSII CCIISSTTIICCAA::

NNOOSSTTRREE EESSPPEERRIIEENNZZEE

RELATORE: Chiar.mo Prof. Nicola RIGILLO CORRELATORE: Chiar.mo Prof. Lucio ARMENIO

LAUREANDA: Maria Domenica CAZZATO

AANNNNOO AACCCCAADDEEMMIICCOO 22000000 -- 22000011

Sommario __________________________________________________________________________________________________________________________

ii

SOMMARIO Capitolo 1: Introduzione................................................................1

Capitolo 2: Complicanze polmonari e infezione da cepacia...... 11

Capitolo 3: Studio delle condizioni predisponenti l’infezione... 24

Capitolo 4: Conclusioni.............................................................. 39

Bibliografia................................................................................. 45

Capitolo1° Introduzione __________________________________________________________________________________________________________________________

1

Capitolo 1

INTRODUZIONE

1.1. DEFINIZIONE DELLA MALATTIA

La Fibrosi Cistica è una malattia ereditaria, trasmessa come

tratto autosomico recessivo, cronica ed evolutiva, ad espressività

variabile.

Da questa pur breve definizione è già possibile cogliere diversi

importanti aspetti della malattia:

1) è una malattia ereditaria: questo significa che si nasce già

malati di fibrosi cistica e non è possibile la guarigione, a

meno di modificare l’assetto genetico. Pertanto è cronica

e progressiva negli anni.

2) Autosomica recessiva: il malato è, quindi, o un

omozigote, nato da due soggetti eterozigoti, portatori

entrambi del tutto asintomatici della stessa mutazione


2

genetica, o doppio eterozigote, con due differenti

mutazioni sui due cromosomi parentali.

Figura 1 - Schema di trasmissione ereditaria della F.C.1 3) non tutti i soggetti presentano lo stesso quadro clinico: i

tempi e i modi di comparsa dei sintomi e dei segni di

malattia, e la gravità, variano da soggetto a soggetto, e

nello stesso soggetto da organo a organo, con una

evoluzione imprevedibile.

Come altre mutazioni in natura, anche quelle responsabili della

fibrosi cistica si sono selezionate perché rappresentavano un

vantaggio genetico: difatti i portatori resistevano meglio alle

infezioni intestinali, e particolarmente al tifo addominale.

L’incidenza della malattia nella popolazione mondiale è

1 Per gentile concessione del Centro regionale Toscano di Riferimento per la F.C. presso Azienda Ospedaliera Meyer di Firenze.


3

variabile: rara negli hawaiani e nella razza negra, nei caucasici

è, al contrario, molto frequente (1/3000 nati è colpito dall’

affezione).

Pertanto è doverosa da parte di tutti i medici, e non solo dei

pediatri, la conoscenza della malattia e delle sue complicanze,

nonché della gestione spesso difficile e non gratificante di questi

pazienti.

1.2. ASPETTI BIOCHIMICI

Le mutazioni

coinvolgono tutte il

braccio lungo del

cromosoma 7, dove, in

corrispondenza della

banda q3.1, si trova

espresso un gene di circa

250000 coppie di basi, che

codifica per la proteina

Figura 2 - Cromosoma7 (da “Genetica, P. J. Russell, EdiSES, 1994” modificata).


4

CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator),

responsabile, come vedremo meglio, del trasporto

transmembrana degli ioni a livello delle cellule epiteliali.

La più frequente, e quella che storicamente è stata individuata

per prima, è la mutazione ∆∆∆∆F508 (delezione di tre nucleotidi in

corrispondenza del codone 508, che impedisce l’inserimento di

una fenilalanina nella proteina nascente).

L’incidenza della ∆F508 fra i soggetti affetti da F.C. è

variabile: nei Paesi del Nord Europa copre all’incirca il 90% di

tutte le mutazioni, in Italia ne rappresenta appena il 40%.

Ma del gene si conoscono già circa 800 mutazioni differenti,

con ripercussioni, sicuramente sul piano biochimico, e

probabilmente anche su quello clinico, diverse.

La proteina CFTR è costituita da una singola catena

polipeptidica di 1480 aminoacidi e funziona sia come canale per

gli ioni Cl-, controllato dall’AMPc, sia come regolatore di altri

canali ionici. Negli epiteli normali la CFTR, sintetizzata nel RER


5

(Reticolo Endoplasmatico Rugoso) e glicosilata nell'apparato di

Golgi, viene inserita a livello della membrana plasmatica. Studi

biochimici2 hanno dimostrato che la presenza della ∆F508

conduce ad una alterata processazione della proteina e ad una sua

degradazione all’interno della cellula, mentre altre mutazioni

rendono la stessa, pur normalmente espressa, non funzionante,

così come esemplificato in figura.

Figura 3 - Metabolismo cellulare della proteina CFTR. (da “Principi di medicina Interna” Harrison, Vol 2°, Cap. 257, McGraw-Hill, giugno ’99)

2 in “Principi di medicina Interna”, Harrison, Vol 2°, McGraw-Hill, giugno ’99


6

Gli epiteli colpiti dalla fibrosi cistica presentano, in condizioni

normali, funzioni differenti: alcuni sono deputati

all’assorbimento di liquidi (come nelle vie aeree e intestinali),

altri all’assorbimento di sali (come l’epitelio dei dotti sudoripari),

altri ancora alla secrezione di liquidi (come nei dotti pancreatici).

Non deve pertanto sorprendere che:

1) la fibrosi cistica esplica effetti estremamente diversi sul

riassorbimento di acqua ed elettroliti nei vari epiteli;

2) la fibrosi cistica è una malattia sistemica, perché

sistemica è la presenza di cellule epiteliali, la cui

funzionalità dipende da un corretto controllo del

trasporto ionico transmembrana.

Di seguito sono riportati gli organi e gli apparati coinvolti e le

percentuali del loro coinvolgimento:


7

ORGANI e/o APPARATI %

Apparato respiratorio ~ 90

Apparato gastroenterico e pancreas ~ 80

Ghiandole salivari ~ 80

Fegato ~ 25

Ghiandole sessuali ~ 80

Ghiandole sudoripare ~ 100

1.3. Diagnosi

Proprio l’alterazione del trasporto ionico indotta dalla malattia,

è sfruttata per fare diagnosi postnatale di fibrosi cistica, mediante

il test del sudore.

Tale test, eseguibile già a partire dal secondo trimestre di vita,

consiste, infatti, nella quantificazione degli ioni Cl- e Na+ emessi

con il sudore, dopo averne stimolato la produzione per 10 minuti

con ionoforesi pilocarpinica, da parte di ghiandole sudoripare

della faccia volare dell’avambraccio.


8

La [Cl-] normale, dopo 3 gg. di dieta iposodica, deve essere

< 40 mEq/l. Valori superiori a 50 mEq/l sono già patologici, e se

rinvenuti in tre test consecutivi sono suggestivi di malattia3.

Il BM test, invece, basato sul dosaggio dell’albumina nel

meconio attraverso stick reattivi, in passato molto usato, ha perso

oggi gran parte della sua validità, stante l’elevato numero di falsi

positivi e falsi negativi.

In alcuni centri è attivo anche un servizio di screening

neonatale, effettuato in 3a giornata, basato sulla determinazione

della concentrazione di tripsinogeno nel sangue e,

successivamente, della lattasi sul meconio, entrambi presenti a

valori elevati nei neonati con F.C. Quelli che risultano positivi

vengono indirizzati o verso il test del sudore o verso l’indagine

genetica per l’eventuale conferma di malattia.

L’indagine genetica, che permette di identificare

specificamente le mutazioni, è condotta fondamentalmente:

! sui soggetti risultati positivi al test del sudore;

3 Ebbene ricordare che, a livello delle ghiandole sudoripare, la F.C. causa una eccessiva perdita di acqua ed elettroliti, e che l’entità della deplezione idrosalina può essere tale da portare a disidratazione ipotonica.


9

! su coppie che abbiano già un figlio affetto, o nelle cui

famiglie ci siano già dei casi di malattia, al fine di fare

diagnosi prenatale;

! ai familiari (fratelli, zii, cugini), in età fertile, di una

persona con F.C.

Il primo passo consiste nell’utilizzo di un metodo di

ibridizzazione in situ: si cerca la presenza, in ciascuno dei due

alleli mutati del paziente, di una delle venticinque mutazioni

più frequenti, attraverso un Kit preformato chiamato “Reverse

Dot-Blot”. Tale Kit è costituito da striscette caricate delle

sequenze geniche mutate, con le 25 mutazioni suddette, del

gene CFTR.

Il DNA del paziente, contenente ovviamente la regione

mutata, opportunamente amplificato tramite PCR, viene posto

sulle striscette del KIT: lì dove c’è complementarietà si

realizza una ibridizzazione, evidenziata attraverso metodo

colorimetrico.

Nella ipotesi che la/le mutazioni portate dal paziente non

corrispondano a nessuna delle 25 più frequenti, si procede con

l’analisi diretta del gene, attraverso il metodo DGGE


10

(Denaturing Gradient Gel Elettroforesis), in quanto partiamo

dal presupposto che il nostro soggetto è malato e, quindi,

necessariamente deve essere portatore di mutazione.

E’ evidente che uno studio così complesso non può essere

eseguito su vasta scala, e quindi al momento non è ipotizzabile

l’identificazione dei soggetti portatori, per la prevenzione

della malattia, così come è avvenuto, per esempio, per la

Talassemia.

Capitolo 2° Complicanze polmonari e infezione da cepacia __________________________________________________________________________________________________________________________

11

Capitolo 2

COMPLICANZE POLMONARI E INFEZIONE DA CEPACIA

Abbiamo già detto che il primum movens della malattia è

rappresentato da un’alterazione del meccanismo di trasporto

ionico a livello delle cellule epiteliali, e che ciò può avere effetti

su tutte le ghiandole esocrine e coinvolgere tutti gli apparati.

Dallo schema precedente (pag. 7) si evince pure come sia

praticamente costante il coinvolgimento delle vie aeree, sia

superiori (con quadri di sinusite cronica e poliposi nasale), sia

inferiori. E sicuramente la situazione broncopolmonare occupa

un posto di rilievo nella evoluzione della F.C., ed è di per sé

causa di ricoveri frequenti e di ingravescenza del quadro clinico

dei pazienti.

Poiché il trasporto dell’acqua è strettamente correlato con

quello del Na+, la ritenzione anomala dello ione all’interno delle

cellule dell’epitelio bronchiale, indotta dalla mutazione del gene


12

CFTR, comporta anche una ritenzione dell’acqua, e ciò fa sì che

le secrezioni bronchiali siano particolarmente dense e viscose e

facilmente ristagnino all’interno delle vie aeree, rappresentando

un pabulum ideale per la proliferazione di germi, sia Gram + che

Gram -, prevalentemente di tipo nosocomiale.

Un batterio qualunque che arrivi a livello polmonare, in questi

soggetti scatena una risposta immunitaria molto forte, che a

lungo andare finisce per rappresentare uno svantaggio.

L’iniziale produzione di IL-8, chemiotattica per i globuli

bianchi, è qui tre volte superiore a quella di un soggetto non

affetto da F.C., è quindi il numero di tali leucociti richiamati in

sede è molto elevato. Il processo infiammatorio che si innesca è

tale da determinare non solo l’ulteriore produzione di muco

denso e filante come naturale risposta di difesa, ma anche, e ciò è

più grave, la paralisi delle ciglia vibratili. E il quadro si aggrava

progressivamente con l’instaurarsi di un circolo vizioso.

Non solo! Probabilmente in questi pazienti c’è qualcosa in più.


13

Studi recenti4 hanno dimostrato infatti che i microbi albergano

più facilmente in questi soggetti, in quanto proteine importanti,

dette Difensine, che contribuiscono alla “pulizia” delle vie aeree,

in modo particolare impedendo l’adesione batterica, nei pazienti

F.C. non funzionano perché paralizzate dall’eccesso di Na+Cl-

intracellulare.

L’evoluzione è verso la formazione di bronchiectasie da

pulsione, atelettasie ed enfisema, con conseguente alterazione del

rapporto V/Q.

La sofferenza cronica dell’apparato bronco-polmonare non è

priva di gravi conseguenze sul circolo. Sui malati incombe,

proprio per lo stabilizzarsi di un aumento delle resistenze del

piccolo circolo, il destino dei broncopneuomopatici cronici, e

cioè quello del cuore polmonare cronico, fino allo scompenso

cardiaco destro.

I batteri di più frequente riscontro all’esame dell’espettorato

sono lo Staphylococcus aureus e lo Pseudomonas aeruginosa.

4 Da “Les avancées thérapeutiques“, Professeur Philippe REINERT, Chef du service Pédiatrie de l’Hôpital Intercommunnal de Créteil.


14

Ma negli ultimi anni un altro batterio è sfortunatamente emerso

come maggiore patogeno nei pazienti con F.C., ed è la

Burkholderia cepacia (già Pseudomonas cepacia). E’ questo un

batterio Gram- che crea non pochi problemi nella gestione dei

nostri pazienti, vista la sua multiresistenza agli antibiotici.

Il confronto fra due antibiogrammi, di seguito riportati, uno

per S. aureus e l’altro per B. cepacia, dimostra che, mentre per il

primo batterio, pur responsabile di grave infezione polmonare, è

comunque possibile intervenire con adeguata e mirata terapia

antibiotica, nei confronti del secondo non abbiamo ancora un

valido “strumento di lotta”.

L’unica alternativa rimane, in attesa che venga formulato un

efficace vaccino, l’associazione di almeno 3 antibiotici diversi,

servendosi di antibiogrammi con lo studio dei sinergismi fra i

vari antibiotici, fino ad arrivare alla combinazione che, in quel

paziente e in quel momento, riesce a curare la riacutizzazione,

insieme con una quotidiana fisiokinesiterapia che aiuti il paziente

a drenare i muchi abbondanti.


15

Azienda Ospedaliera Ospedale Policlinico Consorziale U.O. Igiene, Epidemiologia e Sanità Pubblica I

Università degli Studi – Bari

Dipartimento di Med. Pubblica e Med. Interna Sezione di Igiene – Direttore: Prof. S. Barbuti

Accettazione 312 del 03/04/2001 – Referto N. 1 Sesso F

Paziente Data Nascita XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Reparto: 310 PEDIATRIA 2

Descrizione Esame/Test

Risultato U.M.

Valori di Riferimento Esame microscopico Espettorato

RISULTATO:

Presenza di cocchi Gram Positivi

Esame colturale campioni biologici differenti Espettorato

RISULTATO:

Positivo

Identificazione biochimica per batteri Espettorato

Batterio isolato Staphylococcus aureus

Antibiotici Saggiati Staphylococcus aureus

MIC S/R/I

Acido Fusidico <=1 S Ampicillina/sulbactam >=32 R Betalattamasi POS + Catalasi POS + Cefalotina >=32 R Ciprofloxacina >=4 R Clindamicina <=0,5 S Eritromicina 1 R Fosfomicina <=16 S Gentamicina >=16 R Nitrofurantoina <=32 S


16

Norfloxacina >=16 R Oxacillina >=8 R Rifampieina >=4 R Teicoplanina <=4 S Tetraciclina >=16 R Trimetoprim/Sulfam. <=10 S Vancomicina 1 S

+ = POSITIVO I = INTERMEDIO R = RESISTENTE

L’antibiogramma comprende valori di MIC espressi in mcg/ml

Esame colturale miceti in campioni biologici diversi Espettorato

RISULTATO:

Presenza di C. albicans

Azienda Ospedaliera Ospedale Policlinico Consorziale U.O. Igiene, Epidemiologia e Sanità Pubblica I

Università degli Studi – Bari

Dipartimento di Med. Pubblica e Med. Interna Sezione di Igiene – Direttore: Prof. S. Barbuti

Accettazione 336 del 03/04/2001 – Referto N. 1 Sesso F

Paziente Data Nascita XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Reparto: 310 PEDIATRIA 2

Descrizione Esame/Test

Risultato U.M.

Valori di Riferimento Esame colturale campioni biologici differenti Espettorato

RISULTATO:

Positivo

Identificazione biochimica per batteri Espettorato

Batterio isolato Burkholderia cepacia (Pseudomonas cepacia)


17

Antibiotici Saggiati Burkholderia cepacia

(Pseudomonas cepacia)

MIC S/R/I

Amikacina >=64 R Amoxicillina/A. CLAV. >=32 R Ampicillina >=32 R Aztreonam >=32 R Carbenicillina >=512 R Cefazolina >=32 R Cefepime >=32 R Cefoperazone >=64 R Cefoxitina >=32 R Ceftazidime >=32 R Ceftizoxime >=256 R Ceftriaxone >=64 R Cefuroxime – Acetil >=32 R Cefuroxime – Sodio >=32 R Ciprofloxacina >=4 R Cloramfenicolo >=32 R Gentamicina >=16 R Imipenem >=16 R Levofloxacin >=8 R Lomofloxacina >=8 R Meropenem >=16 R Netilmicina >=32 R Nitrofurantoina >=128 R Norfloxacina >=128 R Ossidasi POS + Piperacillina >=256 R Piperacillina/tazobactam 64 I Tetraciclina >=16 R Ticarcillina 128 R Ticarcillina/A. CLAV. >=256 R Tobramicina >=16 R Trimetoprim/Sulfam. >=320 R

+ = POSITIVO I = INTERMEDIO R = RESISTENTE

L’antibiogramma comprende valori di MIC espressi in mcg/ml

Quanto detto ha non poche conseguenze:

1) l’impossibilità di sterilizzare efficacemente i focolai

broncopneumonici fa sì che le riacutizzazioni in questi


18

pazienti siano più frequenti, e che quindi le loro

condizioni generali diventino progressivamente più

scadenti;

2) le terapie antibiotiche massive a cui tali pazienti sono

costretti, se da un lato sono indispensabili per contenere

l’infezione, dall’altro sono debilitanti e non prive di

effetti collaterali;

3) questi pazienti sono quelli che si ricoverano più spesso,

e le degenze sono sovente molto lunghe: bisogna quindi

considerare anche le spese ospedaliere, oltre a quelle

delle terapie mediche e della fisiokinesiterapia, nonché

il carico sociale derivante dall’assenza dal lavoro delle

madri che assistono i figli sia in ospedale che a

domicilio;

4) infine, ma certamente non per importanza, l’evoluzione

quasi sempre infausta dell’infezione da B. cepacia: nel

giro di due anni sono infatti deceduti 6 giovani pazienti.

La morte sopraggiunge per grave insufficienza


19

respiratoria, quando entrambi i polmoni sono seriamente

compromessi, e quindi per scompenso cardiaco.

Di seguito sono riportate immagini da TAC torace senza mdc

di una nostra paziente con infezione da B. cepacia.

Figura 4: Scansione lobi polmonari superiori Bronchiectasie sede apicale sx


20

Figura 5: Scansione aree medio-polmonari Consolidamento parenchimale sede medio-polmonare dx


21

Figura 6: Scansione lobi polmonari basali Bronchiectasie sede lobare inferiore sx


22

Si possono osservare: numerosi reperti bronchiectasici diffusi,

soprattutto in sede lobare superiore sx, nonché lobare inferiore

sx; si possono osservare altresì aree di consolidamento

parenchimale in sede medio-polmonare dx.

A questo reperto diagnostico corrisponde un reperto

auscultatorio caratterizzato da riduzione diffusa del MV, rantoli a

piccole e medie bolle su tutto l’ambito polmonare, e soffio

bronchiale in sede lobare inferiore sx.

Il trapianto sequenziale dei polmoni, o talvolta, se necessario,

di cuore e polmoni, che resta oggi l’unica strategia di intervento

risolutiva nei casi più disperati, nonostante sia gravata pur essa

da non poche complicanze, in questi pazienti spesso non è

possibile:

a) o per le scadenti condizioni generali, che stentano a

migliorare anche dopo terapia di sostegno attraverso la

nutrizione parenterale, che impediscono di affrontare

l’intervento;


23

b) o per concomitante interessamento di più organi, in

modo particolare il fegato, che richiederebbe un ancor

più pericoloso doppio trapianto;

c) o per la particolare resistenza alle terapie antibiotiche

dei focolai, con conseguente elevato rischio di

complicanze infettive postoperatorie non gestibili.

Capitolo 3° Studio delle condizioni predisponesti l’infezione __________________________________________________________________________________________________________________________

24

Capitolo 3

STUDIO DELLE CONDIZIONI PREDISPONENTI L’INFEZIONE

Proprio perché la prognosi quoad valetudinem e quoad vitam

risulta, nella maggior parte dei casi, pessima, ci si è posti il

problema di capire se è possibile prevedere, nell’eterogeneo

gruppo dei pazienti affetti da F.C., quali sono coloro che

svilupperanno una infezione da B. cepacia, in modo tale da

intervenire ab initio, o cercando di prevenirla, o eliminando gli

eventuali fattori di rischio.

Lo studio da me condotto ha preso in considerazione diversi

aspetti:

1) assetto genetico;

2) stato nutrizionale, valutato attraverso le curve di

crescita;

3) concomitante presenza di altri quadri clinici complicanti

le condizioni globali dei pazienti.


25

Il primo passo è stato quello di selezionare 2 campioni: uno

costituito dai 16 pazienti in cura che risultano portatori di

infezione da cepacia, l’altro gruppo di controllo formato da 16

pazienti, scelti in modo random, che non hanno sviluppato al

momento tale infezione.

La presenza della cepacia viene, presso il nostro centro,

dimostrata sia attraverso l’esame PCR condotto sull’espettorato e

volto alla ricerca del DNA batterico, sia mediante esame

colturale dell’espettorato stesso, su terreni selettivi, previa

colorazione di Gram (esame questo che richiede tempo e fortuna,

stante la difficoltà e la lentezza con cui il batterio cresce, e il

problema dell’isolamento, dai media selettivi, di una varietà di

organismi fenotipicamente simili).

3.1. STUDIO DELL’ASSETTO GENETICO

In base all’assetto genetico, in ciascuno dei due gruppi sono

stati identificati tre sottogruppi:

a) omozigoti ∆F508;


26

b) eterozigoti ∆F508;

c) omozigoti o doppi eterozigoti per altre mutazioni.

I risultati ottenuti sono i seguenti:

Pz Fc con cepacia N° %

Omo ∆F508 2 12,50 Etero ∆F508 11 68,75 Altro 3 12,75

Totale

16

100

Pz Fc no cepacia N° %

Omo ∆F508 1 6,25 Etero ∆F508 9 56,25 Altro 6 37,50

Totale

16

100 0

2

4

6

8

10

12

Omo Etero Altro

Cepacia

No cepacia


27

Per poter comprendere se le percentuali così ottenute nei due

gruppi siano o meno significativamente diverse dal punto di vista

statistico, applichiamo il test di confronto fra proporzioni per tutti

i 3 sottogruppi.

1° TEST

Sottogruppo degli Omozigoti

n1 = 16 x1 = 2 p1 = 0,125 p = 0,09

n2 = 16 x2 = 1 p2 = 0,0625 q = 0,91

Dove n1 n2 = numerosità campionarie x1 x2 = numero pazienti omozigoti p1 = x1/ n1; p2 = x2/ n2

p = (x1 + x2)/(n1 + n2) q = 1 – p L’ipotesi H0 è che p1 = p2 L’ipotesi contraria H1 è che p1 ≠ p2

La statistica test è Z =

+

−

21

21

11nn

pq

pp

Per α = 0.05, l’intervallo di riferimento L, in base al quale accettiamo o rifiutiamo H0, è ± 1,96.


28

Facendo gli opportuni calcoli → Z = + 0.62 Poiché – 1.96 ≤ + 0.62 ≤ + 1.96, accettiamo H0 : p1 = p2

2° TEST

Sottogruppo degli Eterozigoti

n1 = 16 x1 = 11 p1 = 0,6875 p = 0,625

n2 = 16 x2 = 9 p2 = 0,5625 q = 0,375

Dove x1 x2 = numero pazienti eterozigoti Facendo gli opportuni calcoli → Z = + 0.73 Poiché – 1.96 ≤ + 0.73 ≤ + 1.96, accettiamo H0 : p1 = p2

3° TEST

Sottogruppo dei Pz con altre mutazioni

n1 = 16 x1 = 3 p1 = 0,1875 p = 0,2812

n2 = 16 x2 = 6 p2 = 0,375 q = 0,7188

Dove x1 x2 = numero pazienti con altre mutazioni Facendo gli opportuni calcoli → Z = - 1.18 Poiché – 1.96 ≤ + 1.18 ≤ + 1.96, accettiamo H0 : p1 = p2


29

I 3 test dimostrano che non esistono differenze statisticamente

significative fra le % nei due gruppi.

Ciò induce a concludere che la presenza di una mutazione

piuttosto che un’altra non influenza la possibilità di contrarre

l’infezione da B. cepacia, e che pertanto non può essere l’assetto

genetico un criterio di discriminazione in tal senso.

Si potrebbe obiettare che la numerosità dei campioni a

disposizione è piuttosto esigua per poter considerare il risultato

estendibile a tutta la popolazione dei soggetti affetti da F.C.; ma

la nostra esperienza, come Centro di Riferimento Pugliese, ci ha

permesso di notare come effettivamente, nell’ambito di fratelli

malati, che hanno quindi le stesse mutazioni, l’infezione da

cepacia segue la medesima distribuzione del resto dei pazienti.

3.2. STUDIO DELLO STATO NUTRIZIONALE

Lo stato nutrizionale dei pazienti affetti da F.C. difficilmente

risulta buono. E ciò sia perché, nonostante la somministrazione di

enzimi sostitutivi, vi è comunque una riduzione nella quantità di

nutrienti assorbiti; sia perché con le abbondanti secrezioni essi


perdono anche notevoli quantità di proteine; sia perché le

infezioni recidivanti da un lato e le massive terapie antibiotiche

dall’altro, li debilitano non poco.

La valutazione dello stato dei pazienti è stata condotta

attraverso l’analisi delle curve di crescita, e particolarmente della

curva ponderale che, risentendo meno del gentilizio rispetto a

quella staturale, è un indice più fedele della situazione

nutrizionale.

A titolo puramente esemplificativo, si riportano qui di seguito

le tavole dei centili per maschi e femmine5.

5 da “Pediatria essenziale”, Burgio, Pernotto, Ugazio, UTET, 19

Figura 8

Figura 7

- Tavola dei centili del peso nella popolazione femminile

- Tavola dei centili del peso nella popolazione maschile

30

97, pagg. 354 - 355


31

Nell’ambito di ciascuno dei due campioni, i pazienti sono stati

divisi in:

1) pazienti che hanno una curva di crescita normale, con valori di peso compresi fra 50° (o anche più) e 20° percentile;

2) pazienti in sottopeso lieve-medio, con valori compresi fra il 20° e il 3° percentile;

3) pazienti in grave sottopeso con valori < 3° percentile

I risultati ottenuti sono riportati in tabella.

PESO CEPACIA NO CEPACIA TOTALE

Normale 3 7 10

Lieve sottopeso 3 8 11

Grave sottopeso 10 1 11

Totale 16 16 32

Per verificare se esiste o meno una correlazione fra il peso e

l’infezione da cepacia, applichiamo il test χ2.


32

A partire dalla tabella precedente dei valori osservati (Oij),

costruiamo la tabella dei valori attesi (Eij).

PESO CEPACIA NO CEPACIA TOTALE

Normale 5 5 10

Lieve sottopeso 5,5 5,5 11

Grave sottopeso 5,5 5,5 11

Totale 16 16 32

La statistica test χ2 è uguale ( )

∑−

ijij

ijij

EEO 2

Facendo gli opportuni calcoli, χ2 è uguale a 11,24.

Il valore critico per la distribuzione χ2 tabulato, per 2 gradi di

libertà e per α = 0.05, è 5.9.

Poiché il χ2 calcolato è > del χ2 tabulato, affermiamo che non

esiste una relazione tra le due variabili e rigettiamo l’ipotesi H0.

Pur tuttavia, se andiamo a confrontare, nei due gruppi, le

proporzioni di pazienti con grave ritardo di crescita, applicando


33

la statistica test Z, osserviamo che esse sono statisticamente

diverse:

n1 = 16 x1 = 10 p1 = 0,625 p = 0,34375

n2 = 16 x2 = 1 p2 = 0,0625 q = 0,65625

x1 x2 = numero pazienti con grave ritardo di crescita

Facendo gli opportuni calcoli → Z = + 3.5 Poiché + 3.5 > + 1.96 (valore tabulato per α = 0,05), rifiutiamo H0 : p1 ≠ p2.

In termini più semplici, questo ci dice che, se pure non

possiamo concludere che esista un legame di causalità tra lo stato

nutrizionale e la infezione da B. cepacia, resta comunque vero

che è fra i pazienti con cepacia che sono raggruppati il maggior

numero di quelli con grave sottopeso, e quindi con riduzione più

severa delle difese immunitarie.

L’analisi del rapporto temporale tra peggioramento dello stato

nutrizionale e diagnosi di infezione da B. cepacia, ha messo in

evidenza che in alcuni casi tale infezione è sopraggiunta dopo

che il paziente ha cominciato, per un motivo qualunque, a

dimagrire; in altri invece l’infezione è intervenuta in una


34

situazione di relativa normalità, peggiorando essa il quadro

clinico; in altri casi ancora, rari, la cepacia non ha modificato per

nulla la situazione preesistente del paziente.

Pertanto, i rapporti tra paziente e batterio sono molto più

complessi di quello che può sembrare apparentemente, e

coinvolgono aspetti ancora poco esplorati, come eventuali

polimorfismi allelici, o vere e proprie mutazioni geniche

coesistenti; il ceppo più o meno aggressivo di B. cepacia.

A questo proposito, va ricordato che le Burkholderie cepacia

isolate sono attualmente classificate in 5 differenti genomovars o

specie. I genomovars compresi fra I e V sono designati come

“cepacia-complex”, anche se due di questi sono stati proposti

come nuove specie batteriche (Burkholderia multivorans –

formalmente genomovar II, e Burkholderia vietnamiensis –

costituente il genomovar V).

La strategia di identificazione di queste si basa sulla ricerca di

specifiche variazioni nella sequenza nucleotidica del gene recA,


35

che è posseduto da tutte le specie appartenenti al cepacia

complex.

Il genomovar III appare associato a trasmissione tra paziente e

paziente e ad una prognosi sfavorevole.

Il gene per il flagello ha una sequenza altamente conservata, e

quindi l’antigene sulla sua superficie potrebbe essere l’ideale

candidato per un nuovo vaccino6.

3.3. STUDIO ALTRI QUADRI CLINICI COMPLICANTI LE CONDIZIONI GLOBALI DEI PAZIENTI

I quadri clinici analizzati sono stati:

a) presenza di insufficienza pancreatica;

b) epatopatia.

Innanzitutto cerchiamo di capire perché, nei pazienti affetti da

F.C., si può arrivare alla compromissione del fegato e del

pancreas.

Analogamente a quanto avviene nell’albero respiratorio, anche

a livello pancreatico le secrezioni, pur essendo, almeno nelle fasi

6 In “A novel vaccine and diagnostic for Burkholderia cepacia complex”, Pharmalicensing, agosto 2001, su www.pharmalicensing.com/licensing/displicopp/418.


36

iniziali, quantitativamente normali, sono qualitativamente

alterate, nel senso di una loro maggiore densità e viscosità, e

facilmente precipitano all’interno dei dotti, provocando una

dilatazione cistica degli stessi e innescando una reazione

infiammatoria circostante che porta alla reazione fibrotica e

quindi alla sostituzione del tessuto ghiandolare pancreatico con

tessuto fibroso (proprio dal quadro anatomo-patologico del

pancreas si dà alla malattia il nome di Fibrosi Cistica).

Stesso discorso vale per il fegato, dove si realizza una

“Sindrome da bile spessa”: i sali biliari o non raggiungono il

duodeno per esplicare la loro funzione digestiva, o pur

giungendovi precipitano, tant’è che è possibile dosarli nelle feci

in quantità doppia rispetto al normale. Ciò comporta l’evenienza

meno grave di colelitiasi e colostasi, per formazione di

concrezioni di colesterolo e pigmenti biliari, e quella, ben più

temibile, anche se fortunatamente più rara, della epatopatia

cronica fino alla cirrosi biliare.


37

L’insufficienza pancreatica secondaria, associata o meno al

deficit di funzionalità epatica e all’alterazione della captazione e

del trasporto degli acidi grassi a catena lunga a livello della

mucosa intestinale, il cui meccanismo di trasporto è strettamente

correlato a quello degli ioni, conduce al maldigestione dei

nutrienti. Tale maldigestione si traduce clinicamente

nell’emissione di feci untuose, ricche di grassi e fibre non

digerite, di proteine ed enzimi, tant’è che proprio attraverso

l’esame delle feci può essere indirettamente sondato lo stato

nutrizionale del paziente.

Dei pazienti esaminati, 14 su 16 in ciascuno dei due gruppi

presentano insufficienza pancreatica, mentre l’interessamento

epatico riguarda 4 pazienti affetti da cepacia e 5 non affetti.

Tali valori, come si può osservare, sono praticamente

sovrapponibili, e questo a testimonianza del fatto che il

coinvolgimento di fegato e pancreas si inscrive nel percorso così

variabile della malattia, e può essere del tutto indipendente da un

eventuale concomitante interessamento dell’apparato


38

broncopolmonare. Resta comunque sempre valido il discorso

fatto nel paragrafo precedente.

Ovvero: non è detto che i pazienti che hanno un

coinvolgimento pancreatico o epatico abbiano anche un

interessamento broncopolmonare, essendo la malattia

dall’espressività quanto mai varia, e quindi non si può

assolutamente affermare che esista una correlazione con

l’infezione da B. cepacia, o da qualunque altro batterio; però se

dovesse esserci la contemporanea compromissione di più organi,

allora sarebbe opportuno valutare ancora più attentamente i

pazienti e la loro capacità di assorbimento dei cibi, per evitare un

dimagrimento che in questo caso sarebbe più pericoloso.

Capitolo 4° Conclusioni __________________________________________________________________________________________________________________________

39

Capitolo 4

CONCLUSIONI

Lo studio condotto ha dimostrato ciò che intuitivamente,

attraverso l’esperienza quotidiana a contatto con questi pazienti,

avevamo purtroppo già compreso: non è in realtà possibile, con

gli strumenti a nostra disposizione, cioè la valutazione clinica e

l’analisi delle mutazione del gene della CFTR, prevedere in

anticipo quali saranno i pazienti che andranno incontro a

infezione da B. cepacia, per prevenirla, né è possibile prevedere

quale sarà il loro destino in seguito all’infezione.

D’altra parte, il confronto fra fratelli ammalati lo dimostra:

essi hanno le stesse mutazioni e vivono negli stessi ambienti

(escludendo la possibilità di una contaminazione ambientale),

eppure non è raro che uno si infetti e l’altro no.

L’unico fattore che abbiamo trovato essere semplicemente più

ricorrente fra i pazienti affetti da B. cepacia è il sottopeso grave,

senza però poter affermare con sicurezza se esso sia la causa o la


40

conseguenza dell’infezione, essendo anche qui la variabilità ad

essere determinante. E in effetti, pazienti che sembrerebbero

essere candidati a contrarre l’infezione, perché debilitati da una

compromissione multiorgano e da frequenti reinfezioni, in realtà

riescono a sfuggirvi, e pazienti che, al contrario, sembrerebbero

più forti, inaspettatamente diventano positivi alla cepacia.

Questo dimostra ancora una volta che i fattori esaminati

rappresentano “condizioni necessarie ma non sufficienti”, e che il

quid in più va cercato altrove, probabilmente, così come già

detto, in mutazioni geniche o polimorfismi coesistenti con la F.C.

e indipendenti da essa.

Diversi geni7 sono stati candidati come potenziali modulatori

della situazione polmonare; fra questi, i più importanti sono

quelli codificanti per: MBL, TNF-α, HLA II, NO sintetasi di tipo

I, TGFβ e proteine A e D associate al surfattante.

7 Da “Genetic Modifiers of Cystic Fibrosis – the Emerging Picture”, 24th European Cystic Fibrosis Conference, June 2001, Vienna, Hofburg Conference Centre, ZIELENSKI J.


41

Al momento il gene più studiato, situato sul cromosoma 10, è

quello che codifica per la Mannose-binding lectin (MBL),

proteina chiave nella risposta immunitaria innata.

Essa infatti, sintetizzata dagli epatociti, è una proteina Ca2+ -

dipendente della fase acuta, con ruolo determinante sia nei

processi di opsonizzazione batterica che di attivazione del

Complemento (via lectinica)8.

Il deficit di MBL, associato a varianti polimorfiche o a vere e

proprie mutazioni del gene, non è di per sé un elemento causativo

di patologia, ma un fattore di predisposizione a contrarre

infezioni di particolare gravità (polmonari, asma, sinusite, otite

media, stomatite, diarrea cronica, …), ove preesistano una o più

condizioni cliniche favorevoli, come, appunto, la presenza di

F.C. E infatti, soggetti F.C. con mutanti alleliche della MBL, che

ne riducono i livelli sierici, presentano più frequentemente una

colonizzazione polmonare da B. cepacia, alterazioni più severe

8 Da “La mannose-binding lectin (MBL): un componete dell’immunità innata implicato in molte patologie”, CARDINALE e AA., Riv. Ital. Pediatria, 2001, in press.


42

della funzionalità respiratoria e sopravvivenza ridotta di circa 8

anni.

Gli studi, ai quali partecipa anche questa Clinica Universitaria,

sono ancora chiaramente in fase iniziale e bisognerà aspettare

qualche anno per avere dei risultati che possano confermare tale

interessante ipotesi, che, tra l’altro, potrebbe anche spiegare

perché due fratelli possano avere un destino diverso rispetto

all’infezione di cui trattiamo.

L’unica cosa certa da fare attualmente rimane quella di

controllare la malattia:

a) dal punto di vista broncopolmonare, per evitare che si

instauri il circolo vizioso di cui si è detto al cap. 2, con

manovre capaci di stimolare la tosse e rimuovere le

secrezioni; con gli antibiotici per curare le infezioni

respiratorie e con l’aerosolterapia per fluidificare il

muco;

b) dal punto di vista clinico globale, per sostenere al

meglio i pazienti, con somministrazione di enzimi


43

pancreatici che favoriscano la digestione e

l’assorbimento dei cibi; con una dieta ipercalorica e, se

necessario, anche con terapia parenterale.

Solo contenendo la malattia, infatti, si può sperare che essi

siano in grado, se non di sfuggire all’infezione, per lo meno di

combatterla più efficacemente.

Sicuramente è però intuitivo che comunque nuove terapie sono

urgentemente richieste per controllare l’infezione da B. cepacia,

dal momento che i convenzionali trattamenti antibiotici risultano

spesso fallimentari.

E’ indiscutibile che negli ultimi anni, con i mezzi a

disposizione, con la diagnosi precoce e con l’esperienza

assistenziale acquisita, la situazione dei pazienti F.C. è

migliorata, e il 50% di essi raggiunge oggi l’età adulta

conducendo una vita pressoché normale, mentre in passato le

forme più gravi portavano precocemente a morte; ma i risultati

sono lontani dall’essere considerati soddisfacenti: il tributo in

vite umane pagato alla malattia, anche per colpa dell’infezione da


44

B. cepacia, resta ancora troppo alto. Soprattutto considerando

l’elevata incidenza della F.C. nella popolazione.

Ecco perché è necessario che la ricerca vada avanti e che

sviluppi nuove strategie di intervento, come la messa a punto di

un vaccino, verso cui essa sembra essere orientata oggi in modo

deciso, che protegga questi pazienti così vulnerabili.

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