Alice Fulgido & Giuseppe Cazzato. Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione...

Alice Fulgido & Giuseppe Cazzato

Concetti base Mutazioni e riarrangiamenti Processi di riparazione del DNA Metodi di studio dei cariotipi Allineamenti genomici Analisi delle regioni di breakpoint

Concetti baseGENOMA: Intero patrimonio genetico di una specie. Esso però

non comprende solo l’insieme di tutti i geni necessari alla vita di un organismo, ma anche tutto il DNA “non genico”

CROMOSOMI: molecole di DNA organizzate in unità strutturali e

funzionali in cui è suddiviso il genoma

GENE: unità ereditaria fondamentale degli organismi viventi contiene le informazioni genetiche che codificano per

funzioni specifiche all’interno della cellula

Relazione DNA-gene-cromosoma

Confronto tra sequenze genomiche METODI: - Mapping, determinare la posizione dei geni su

un cromosoma e la distanza che li separa- Sequencing , identificare l’ordine delle unità chimiche base del Dna (sequenze nucleotidiche)

BENEFICI:- diagnosi e cura di malattie oggi incurabili- migliori selezioni di prodotti di agricoltura e allevamento- miglioramento nelle tecniche di investigazione criminale

Riproduzione del DNAProcesso molecolare di REPLICAZIONE DEL

DNA comprende: - formazione di legami idrogeno fra le basi

complementari (A, T, C, G) - formazione di un legame covalente

fosfodiesterico

Processo di RIPARTIZIONE DEI CROMOSOMI nelle cellule figlie

Replicazione del DNA

Cos’è una mutazione?Il risultato del cambiamento di una o più basi

del DNA

Cause :- Cambiamenti accidentali(durante i processi di

replicazione e ricombinazione)

- Mutageni (fisici o chimici)

Mutazioni GENICHE: interessano un singolo

gene(consistono in sottrazione, aggiunta o sostituzione di uno o più nucleotidi)

CROMOSOMICHE: estese della struttura dei cromosomi, dipendono da una rottura e da una ristrutturazione anomala degli stessi cromosomi.

GENOMICHE: consistono in alterazioni non

della struttura ma del numero dei cromosomi.

Conseguenze delle mutazioni

perdita di funzione del gene

Misappaiamenti (appaiamenti errati)se non rimossi rapidamente si propagheranno nelle duplicazioni successive

Ma anche“Differenze migliorative”

(che permettono l’evoluzione della specie)

Riarrangiamenti Modifiche della disposizione dei geni sui

cromosomi.

Svolgono un ruolo molto importante nell’evoluzione della specie

Hanno origine da uno o più DSBAvvengono quando i meccanismi di riparazione

falliscono o quando si presentano errori

Tipi: delezione, inserzione, inversione, traslocazione, etc…

Tipi di riarrangiamento

Double Strand Break (DSB)Più frequenti rotture del DNAInteressa entrambi i filamenti complementari

di DNAConseguenza dell'esposizione del DNA ad

agenti genotossici o di normali processi cellulari

Se non riparata prontamente dalla cellula può causare gravi problemi di instabilità genomica

Strategie: HR (SSA), NHEJ, NAHR

Homologous Recombination (HR) Ricombinazione omologaCromosoma omologo al danneggiato è usato come

stampo per la riparazione (error free)Conservativo

Single Strand Annealing (SSA): variante di HR. - Si attiva se il DSB si realizza tra sequenze

ripetute - Eliminazione di estremità non omologhe e

allineamento di sequenze omologhe

Non-Homologous End Joining (NHEJ)

Ricongiungimento delle estremità non omologhe

Non considera l’informazione iniziale del DNA

Può portare a delezioni o mutazioni

NHEJ vs HR

Non-Allelic Homologous Recombination (NAHR)

Responsabile di parecchi disordini genomici umani

Comporta il cosiddetto riarrangiamento non equilibrato: acquisizione o perdita di DNA

Fasi della ricombinazione Rottura e successiva riunione di due cromatidi

(M e F) Produzione di due cromatidi riarrangiati (C1 e

C2)

Ricombinazione: CROSSING-OVERMeccanismo di ricombinazione

del materiale geneticoproveniente dai duegenitori

Risutato: il figlio eredita una mescolanza casuale degli alleli dei due genitori per i diversi caratteri.

Cariotipo Costituzione del patrimonio cromosomico di

una specie dal punto di vista morfologicoAnalisi del cariotipo: rappresentazione ordinata

del corredo cromosomico di un individuo

Studio di cariotipi

Confronto fra cariotipiBandeggio cromosomico (1970)FISH (1990)CGH-arrayMappa genetica

Bandeggio cromosomico Tecnica di colorazione con sostanze fluorescenti

Vantaggi: ricostruzione della mappa di tutti i cromosomi

(morfologia) e messa in evidenza di eventuali mutazioni

confronto fra cariotipi di differenti specie basandosi su tali modelli

rilevazione di molteplici patologie pre e post-natali

Limitazione: bassa sensibilità diagnostica

Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)Ibridazione: processo molecolare che unisce due

singoli filamenti complementari di molecole di DNA per formare molecole con doppio filamento di DNA

Utilizza sonde a fluorescenza che si legano in modo estremamente selettivo ad alcune specifiche regioni del cromosoma

Possibili usi:mappare la sequenze di uno specifico cromosomacolorare i cromosomi per raffrontare due specie o

varietà utilizzando il DNA di interi cromosomiscoprire se un paziente è stato infettato da un

agente patogeno (studi clinici)

Esempio applicazione FISH

Comparative Genomic Hybridization (CGH)Strumento diagnostico per la rilevazione di

sbilanciamenti cromosomici

Principio della tecnica: si basa su una competizione per il legame di 2 DNA genomici (marcati con fluorocromi diversi) a cromosomi in metafase (non marcati e provenienti da un soggetto sano).

Risultato: rapporto delle 2 fluorescenze. In caso di numero di copie normali avrò 2 copie di DNA da testare e 2 copie del DNA di controllo genomico, per cui il rapporto tra i 2 fluorocromi 2/2 è pari a 1.

Limite: la variabilità della morfologia dei cromosomi che ne limitano la risoluzione a circa 3-7 Mb per le delezioni e 2 Mb per le amplificazioni

Array-CGHIl principio: coibridazione del DNA in esame e del

DNA di controllo, marcati con fluorocromi diversi, su un microarray di cloni genomici.

Sostituzione cromosomi delle metafasi di riferimento con una matrice su cui sono spottati cloni YAC, BAC o PAC corrispondenti a loci specifici del cromosoma.

Vantaggi: -immediata correlazione tra l’eventuale

alterazione e una precisa posizione nel genoma -standardizzazione della tecnica, ripetibilità e

affidabilità del risultato

CGH vs Array-CGH

Mappa GeneticaBasata sui dati di ricombinazione geneticaProcesso che determina la posizione relativa dei

geni sui cromosomi a partire da un loco preso come riferimento

Realizzata per mezzo di due tecniche principali: - Analisi di linkage (analisi degli alleli di diversi

marcatori all’interno di una famiglia di individui)

- Mappa di radiazione ibrida (l’irradiazione di cellule umane con dosi elevate di raggi X e la successiva fusione delle cellule irradiate con cellule di Hamster, consente di ottenere linee cellulari nelle quali frammenti di cromosomi umani risultano integrati nel genoma di Hamster)

Allineamento genomicoScopo: mettere a confronto sequenze di

genomi della stessa specie o di specie differenti, con l’intento di trovare la percentuale di DNA comune(=conservato), rispetto alla percentuale di DNA che ha subito modificazioni(riarrangiamenti) nel corso dell’evoluzione o a causa di errori all’interno dell’organismo.

Tipi di algoritmi di allineamento: locali e globali

Esempio di allineamento genomico Date due sequenze nucleotidiche,determinare se

sono sufficientemente simili da farci ritenere che siano derivate da un progenitore comune attraverso processi di mutazione.

Quale è l’allineamento (statisticamente) migliore ?

Per confrontare quantitativamente gli allineamenti è necessario definire uno score:

Possibili allineamenti

Algoritmi globali e localiGlobali: - gestiscono l’allineamento di sequenze intere -svantaggio: i segmenti delle sequenze devono

essere ordinati e non presentare cambiamenti.

Locali: -si allineano sottosequenze delle sequenze di

partenza (ad esempio l’algoritmo di Smith-Waterman) -privilegiati rispetto a quelli globali

Risultato di una procedura di allineamento

Metodo seed-extend

Strategia di allineamento

Si basa su: - trovare la parte di segmenti

conservati(definiti “ancore”) - allineare attorno alle ancore i segmenti

riarrangiati

Step

ANCHORING: Individuare le potenziali regioni di omologhi (ancore)

Filtrarle (ossia eliminare i falsi positivi e fare una scelta fra le differenti copie di elementi duplicati)

Allineare le regioni omologhe identificate (tenendo conto di eventuali gap)

Individuazione dei breakpoint (tramite metodi di allineamento genomico)

Lo scopo non è presentare un metodo specifico (ve ne sono molti, con scopi diversi) ma dare le idee base.

Nella discussione utilizzeremo le idee presentate inGRIMM-SYNTENY

CHAINNETCouronne & Patcher (CP)MAUVE

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BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)Strumenti per la ricerca rapida di sequenze di

similarità in banche dati di DNA e proteine.

Perchè?I programmi dinamici (Smith-Waterman) sono stati ideati per allineare due sequenze in modo esatto ma sono troppo lenti per fare ricerche in banche dati.

Come?Sfruttando l’indicizzazione delle sequenze nel DB

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BLAST - funzionamento

1. Crea un elenco di parole di lunghezza W a partire dalla sequenza query.(W=3 per le proteine, W=11 per il DNA)

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2. Per ogni parola crea un elenco di parole affini (W-mers) con score maggiore di una soglia T

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3. Analizza tutte le sequenze del DB cercando un match con un W-mers

4. Cerca di estendere ciascun hit in entrambe le direzioni (senza gap) e mantiene gli HSP che superano una certa soglia S

Anchoring [1/2]

GRIMM-SYNTENY esegue PatternHunter (gapped)

e prende allineamenti unici e non sovrappostiCHAINNET

esegue BLASTZ (gapped) e prende solo gli allineamenti non interrotti

CPBLAT match quasi esatto (+ veloce)

MAUVESolo allineamenti con match esatto e unico

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Individua la similarità locale tra due genomi

Num. di basi trovate

Anchoring (variante)

Problema:Due specie “distanti” DNA intergenico è mal conservato

Sol.1: allineamento più lasco più falsi positivi

Proposta: utilizzare il DNA codificante (meglio conservato)ed effettuare l’allineamento a livello di proteine(le ancore saranno i geni)

Secondo gli studi di Bourque (confronto mammiferi/polli)i risultati con i due tipi di ancore sono consistenti.

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FilteringIdea: basarsi sul contesto.

1.Raggruppare le ancore

GRIMM-SYNTENY: Manhattan distance < soglia Gruppi con almeno C coppie di basi

CP Raggruppa senza tenere conto dell’orientamento delle

ancore Allineamento globale dei gruppi

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Filtering2. Collegare le ancore

(considerando ordine e orientazione delle ancore)

ChainnetUsa un albero a k-dimensioniUn’ancora potrebbe appartenere a più cateneNon butta via niente ma assegna un punteggio

MauveRipete i passi precedenti con parametri sempre più stringentiConserva le catene con più di X elementi

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AllineamentoSi passa dalle ancore ad un unico allineamento

estendendo i gruppi/catene trovati sinora

Livelli di soglia e parametri minuziosi => difficile fare un confronto tra gli

algoritmi

Ogni algoritmo è stato studiato per specifiche condizioni e specifiche tipologie di studi.

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Analisi delle regioni di breakpoint

Breakpoint:porzione di genoma che è coinvolta in un riarrangiamento

Regioni di breakpoint:regione genomica tra due segmenti “corretti”

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Analisi delle regioni di breakpoint

Analisi puntualeevoluzione di un breakpoint nel tempoEs: studio malattia e sua evoluzione

Analisi sistematica(tutti) i breakpoint nel complesso

Più utile a livello statistico Molti progetti nell’ultima decade per cercare

caratteristiche comuni

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ObiettivoScoprire i meccanismi molecolari che regolano

i riarrangiamenti.

modello di apparizione dei breakpoint ?? Random [Nadau & Taylor -1980]Hotspot [Pevzner, Kent, …]

(accettato per i breakpoint somatici)

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Studi sistematiciFenomeno:

perdita di similarità tra grandi blocchi di sintenia

Causa ?Errori di allineamento [Trinh, Sankov,

…]Micro-riarrangiamenti [Kent, … ]

-> modello non-random(molti rearrangement rendono quella regione più propensa ad ulteriori rearrangement)

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DupliconiDuplicazioni Segmentali (Low Copy Repeats)

- elementi molto simili (>95%)- relativamente piccoli (1-15 kb)

Spesso sono duplicati nella stessa regione cromosomica e sono quindi soggetti a ricombinazioni omologhe tra due copie in differenti loci NAHR

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Sperimentalmente: Duplicazione segmentale prima di un rearrangement

Associazione tra i due cambiamenti (causa/effetto? ) [Armengol]

Dupliconi e Rearrangement sono indipendentiTrovati solo di recente

[Bailey]Caratteristici dei primati

Si trovano entrambi nelle “regioni di rottura”58

Fragile sitesAree del cromosoma con tendenza a rompersi

in specifiche condizioni di coltura cellulare

La loro presenza indica una zona propensa a possibili riarrangiamenti e a rotture di tipo evoluzionistico(80% secondo gli studi di Ruiz Herrera)

Non esiste un modello e tale correlazione (e

sua tipologia) resta in discussione.

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Analisi puntualeL’esplorazione più in dettaglio del singolo

breakpointporta a modelli per spiegare il rearrangement.

Come al solito, molti studi e molti risultati diversi..

Per quanto riguarda i dupliconi i risultati sono analoghi rispetto agli studi sistematici anche se in molti casi non si è ancora compreso il meccanismo esatto.

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Conclusioni

Molti aspetti riguardanti i processi di rottura dei cromosomi sono ancora irrisolti.

Trend: combinare la potenza dell’approccio puntuale con le ipotesi generate da analisi sistematiche.

Modello di distribuzione dei breakpoint sembra essere quello non-random

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References (principali)

A small trip in the untranquil world of genomes. A survey on the detection and analysis of genome rearrangement breakpoints.

Claire Lemaitre, Marie-France Sagot

Genetica in una prospettiva genomica Hartl Daniel L. – Jones Elisabeth W.

Introduzione alla bioinformaticaG.Valle, M.H.Citterich, M.Attimonelli,

G.Pesole

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