Dottorato in Medicina Sperimentale XXXIIl Ciclo

Relazione avanzamento progetto di tesi di dottorato Settembre 2018

“Titolo del progetto"

CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DEL TUMORE DELLA MAMMELLA EREDITARIO: dall’analisi dei geni BRCA1 e BRCA2 ai pannelli multi-genici Dottorando: Aldo Germani Coordinatore: Prof. Maurizio Sorice Docenti guida: Prof.ssa Maria Rosaria Torrisi e Dott.ssa Maria Piane Sede di svolgimento del progetto di ricerca: l’U.O.C di Genetica Medica e Diagnostica Cellulare Avanzata (Azienda Ospedaliera Sant'Andrea) Razionale: La maggior parte dei tumori della mammella è sporadico, il 5-10% è ereditario e i geni ad alta penetranza BRCA1/2, giustificano solo il 10-20% dei casi di tumore della mammella/ovaio. Altri geni di suscettibilità, coinvolti nei meccanismi di Homologous Recombination (HR), sono considerati a moderata o bassa penetranza. Mutazioni in questi geni conferiscono alle cellule il profilo molecolare di HD Deficency, un fenotipo clinico/patologico simile ai tumori BRCA1/2 mutati, inclusa la sensibilità ai PARP inibitori. Scopo del progetto: valutare l’incidenza di mutazioni germinali in geni coinvolti nell’HR, mismatch repair (MR) e nel controllo del ciclo cellulare in pazienti con tumore della mammella/ovaio BRCA1/2 negative, ma con storia familiare suggestiva di tumori ereditari; comparare il fenotipo clinico e molecolare delle pazienti BRCA mutate con le pazienti con mutazioni in altri geni di suscettibilità; valutare l’utilità clinica dell’uso dei pannelli multi-genici; contribuire alla classificazione delle varianti identificate nei geni analizzati. Prima fase del progetto: selezione di pazienti non-BRCA

Metodo: 1) sequenziamento massivo parallelo dei geni BRCA1/2 su piattaforma Ion Torrent PGM (Thermo Fisher), per l’analisi di mutazioni puntiformi e indels; 2) MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) e/o MAQ (Multiplex Amplicon Quantification) per l’analisi dei riarrangiamenti genomici.

Seconda fase del progetto: identificazione di mutazioni germinali nei geni dell’HR, mismatch repair e ciclo cellulare nelle pazienti negative al test BRCA

Metodo:Analisi NGS con un pannello “custom” di 25 geni: APC, ATM, BARD1, BMPR1A, BRIP1, CDH1, CDK4, CDKN2A, CHEK2, EPCAM, MRE11A, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PALB2, PMS2, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, SMAD4, STK11 e TP53 su piattaforma PGM

Terza fase del progetto : correlazione genotipo-fenotipo nelle pazienti con mutazioni nei geni BRCA1/2 e negli altri geni analizzati; valutazione dell’utilità clinica dell’uso dei pannelli multigenici nei pazienti con tumore al seno ad esordio precoce o storia familiare significativa e classificazione delle varianti identificate nei geni analizzati.

Metodo: correlazione dei dati clinici al genotipo delle pazienti; elaborazioni dei risultati dell'analisi NGS in termine di frequenza di varianti patogenetiche identificate nei geni non-BRCA; classificazione delle varianti identificate mediante l'uso di database specifici, dati di letteratura e software di predizione per la valutazione dell’impatto delle varianti identificate sulle proteine corrispondenti quali: SIFT (http://sift.jcvi.org/), Poly-Phen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/), Align-GVGD (http://agvgd.iarc.fr/) e Human SplicingFinderFinder (http://www.umd.be/HSF3/). Verranno inoltre consultati i database dbSNP, ClinVar, gnomAD, HGMD allo scopo di verificare se la variante è stata precedentemente descritta a livello germinale.

Risultati preliminari della prima fase: Nell'ambito della selezione delle pazienti non-BRCA da sottoporre alla successiva analisi NGS per i geni dell'HR, MR e ciclo cellulare sono state finora analizzate 81 donne con tumore della mammella/ovaio o appartenenti a famiglie ad alto rischio, mediante Oncomine BRCA Research Assay™ su piattaforma Ion Torrent PGM e MLPA/MAQ, CNV-NGS per l'analisi dei riarrangiamenti genomici. Analisi dei geni BRCA1/2 per mutazioni puntiformi, indels e CNVs Su 81 campioni analizzati sono state identificate 19 varianti alleliche (detection rate 23%) di cui 14 varianti patogeniche (P) (74%, 14 / 19) (una mutazione del sito di splicing, una nonsenso, una missense, 9 frameshift e tre CNVs) e 5 varianti di significato incerto (VUS) (Tabella 1).

Per identificare riarrangiamenti di grandi dimensioni nei geni BRCA1/2 geni è stato inizialmente utilizzato l'MLPA e/o il MAQ. Tuttavia nel corso di questa prima fase è stata testata e validata una pipeline di analisi in grado di rilevare simultaneamente mutazioni puntiformi e CNVs, sfruttando unicamente l'approccio NGS. Il confronto tra i risultati NGS-CNV, MLPA e MAQ ha mostrato come tale metodo sia il più completo e veloce per la rilevazione simultanea di tutte le mutazioni BRCA, evitando l'approccio multistep comunemente utilizzato (Tab.2 e Fig.1). Tale messa a punto è stata oggetto di pubblicazione (*). Tutti i risultati ottenuti dall'analisi NGS-CNV sono stati confermati dall'MLPA: tre campioni (circa il 4%) hanno mostrato una delezione dell'esone 20, delezione da 21 a 22 esoni e delezione dell'esone 24 sul gene BRCA1. I CNVs identificati sono stati confermati sia dall'analisi MLPA che dal MAQ. Le 62 pazienti risultate negative al test BRCA verranno analizzate nella seconda fase del progetto. Tabella 1: Varianti Indel e SNV rilevate dal pannello BRC Oncomine ™.

Tabella 2: Riarrangiamenti genomici identificati mediante NGS-CNV nei pazienti P03, P06 e P09

Gene Transcript Locus Coding Protein Function dbSNP Clinical Significance Enigma Classification

Sample ID

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41267797 c.81-1G>C p.? unknown rs80358018 Pathogenic C 5 P17

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41243725 c.3823A>G p.Ile1275Val missense rs80357280 Uncertainsignificance C 3 P05

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41245667 c.1881C>G p.Val627Val synonymous rs80356838 Uncertainsignificance C 3 P07

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41244526 c.3018_3021delTTCA p.His1006Glnfs*17 frameshiftDeletion rs80357749 Pathogenic C 5 P08

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41243788 c.3756_3759delGTCT p.Ser1253Argfs*10 frameshiftDeletion rs80357868 Pathogenic C 5 P11

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41244262 c.3285delA p.Lys1095Asnfs*14 frameshiftDeletion rs397509051 Pathogenic C 5 P16

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41228628 c.4361T>C p.Val1454Ala missense rs587782606 Uncertainsignificance C 3 P13

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41209079 c.5266dupC p.Gln1756Profs*74 frameshiftInsertion rs80357906 Pathogenic C 5 P04

BRCA1 NM_007294.3 chr17:41215920 c.5123C>A p.Ala1708Glu missense rs28897696 Pathogenic C 5 P10

BRCA2 NM_000059.3 chr13:32905069 c.700delT p.Ser234Profs*7 frameshiftDeletion rs80359630 Pathogenic C 5 P12

BRCA2 NM_000059.3 chr13:32907102 c.1487C>T p.Ser496Phe missense rs397507269 Uncertainsignificance C 3 P01

BRCA2 NM_000059.3 chr13:32906458 c.846_847delCA p.Ile283Trpfs*11 frameshiftDeletion rs886040776 Pathogenic C 5 P15

BRCA2 NM_000059.3 chr17:32913381 c.4889C>G p.Ser1630Ter nonsense rs80358711 Pathogenic C 5 P18

BRCA2 NM_000059.3 chr13:32915053 c.6566dupA p.Asn2189Lysfs*8 frameshiftInsertion rs397507373 Pathogenic C 5 P02

BRCA2 NM_000059.3 chr13:32914953 c.6468_6469delTC p.Gln2157Ilefs*18 frameshiftDeletion rs80359596 Pathogenic C 5 P09

BRCA2 NM_000059.3 chr13:32944593 c.8386C>T p.Pro2796Ser missense rs146120136 Uncertainsignificance C 3 P14

Sample ID Locus Type CNV

Subtype Call Genes CytoBand Length Variant Class Copy Number

CNV Confidence

P03

chr13:32890490 CNV REF exon 2-27 BRCA2 13q13.1(32890490-

32972932)x2 82.442kb 2 100

chr17:41197601 CNV BigDel exon 24 BRCA1 17q21.31(41197601-41197870)x1 269kb exondeletion 1 30.53

chr17:41199538 CNV REF exon 2-23 BRCA1 17q21.31(41199538-

41276123)x2 76.585kb 2 100

P06

chr13:32890490 CNV REF exon 2-27 BRCA2 13q13.1(32890490-

32972932)x2 82.442kb 2 100

chr17:41197601 CNV REF exon 21-24 BRCA1 17q21.31(41197601-

41203234)x2 5.633kb 2 69.58

chr17:41208956 CNV BigDel exon 20 BRCA1 17q21.31(41208956-41209231)x1 275kb exondeletion 1 78.56

chr17:41215248 CNV REF exon 2-19 BRCA1 17q21.31(41215248-

41276123)x2 60.875kb 2 100

P19

chr13:32890490 CNV REF exon 2-27 BRCA2 13q13.1(32890490-

32972932)x2 82.442kb 2 100

chr17:41197601 CNV REF exon 23-24 BRCA1 17q21.31(41197601-

41199764)x2 2.163kb 2 34.61

chr17:41201009 CNV BigDel exon 21-22 BRCA1 17q21.31(41201009-

41203234)x1 2.225kb exondeletion 1 100

chr17:41208956 CNV REF exon 2-20 BRCA1 17q21.31(41208956-

41276123)x2 67.167kb 2 100