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Unità 3 La tecnologia del DNA ricombinante e la genomica

Qual è la vera portata dei recenti successi della ricerca in ambito genetico e dove ci può portare il progresso nelle tecniche di analisi e studio del nostro genoma?

Lezione 1

LA CLONAZIONE GENICA

2

Le biotecnologie permettono di manipolare gli organismi o i loro costituenti molecolari per ottenere prodotti utili

– In particolare, la tecnologia del DNA ricombinante permette di manipolare il DNA

– I plasmidi sono molecole di DNA circolare che si riproducono autonomamente nei batteri – Sono strumenti fondamentali per l’ingegneria genetica e la

clonazione genica in particolare

3

3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene inserendolo all’interno di un batterio

▪ Come si clona un gene 1. Si isola un DNA plasmidico, che farà da vettore

2. Si isola il DNA donatore da cui si vuole estrarre il gene 3. Si taglia il DNA plasmidico con un enzima di restrizione 4. Si taglia il DNA donatore con lo stesso enzima, ottenendo molti

frammenti 5. Si mescolano DNA plasmidico e DNA donatore 6. Si aggiunge DNA ligasi, che catalizza la formazione di legami

covalenti tra il DNA plasmidico e i frammenti di DNA donatore. Si ottengono così plasmidi ricombinanti che contengono frammenti del DNA donatore

7. Si inserisce il DNA plasmidico in una colonia di batteri, ottenendo batteri ricombinanti

8. Riproducendosi le cellule batteriche daranno origine a cloni di cellule identiche, ognuno contenente un frammento del DNA donatore

3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene inserendolo all’interno di un batterio

4

Esempidiusodeigeni

PlasmideconDNAricombinante

BatterioE.coliPlasmide

Cromosomabatterico

Genechesivuoleclonare

DNA


CellulacontenenteIlgenechesivuoleclonare

Batterioricombinante

Clonidicellule

Igenipossonoessereinseritiinaltriorganismi

Isolamentodeigeniodelleproteinedalbatterioclonato

Leproteinericavatepossonoessereusatedirettamente

Esempidiusodelleproteine


Isolamentodelplasmide

1

IsolamentodelDNA

2

Tagliodelplasmideconl’enzima

3

TagliodelDNAcellulareconlostessoenzima

4

IntegrazionedelframmentodiDNAdeldonatorenelplasmide

5

AggiuntadellaDNAligasi,chechiudel’anelloformandolegamicovalenti

6

Inserzionedelplasmidenelbatterio(trasformazione)

7

Duplicazionedelbatterioincoltura

8

9


Cromosomabatterico


DNA

CellulacontenenteilgenechesivuoleclonareIsolamento

delplasmideIsolamentodelDNA

1

2

6


Cromosomabatterico


DNA

Cellulacontenenteilgenechesivuoleclonare



IsolamentodelDNA



1

2

3

4

7


Cromosomabatterico


DNA




IsolamentodelDNA



1

2

3

4


5

8


Cromosomabatterico


DNA




IsolamentodelDNA



1

2

3

4




AggiuntadellaDNAligasi,chechiudel’anelloformandolegamicovalenti

5

6

9





7

10




Clonidicellule



8

7

11




Clonidicellule

Isolamentodeigeniodelleproteinedalbatterioclonato

Leproteinericavatepossonoessereusatedirettamente

Esempidiusodelleproteine



8

7

Igenipossonoessereinseritiinaltriorganismi

Esempidiusodeigeni

9

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▪ Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche

– Ognuno di questi enzimi lega il DNA in corrispondenza di una specifica sequenza, il sito di restrizione

– Molti enzimi di restrizione producono frammenti di restrizione dotati di estremità coesive, cioè a filamento singolo

– Frammenti dotati di estremità coesive complementari possono legarsi tra loro

– La DNA ligasi permette di formare legami permanenti tra i frammenti formando una molecola di DNA ricombinante

13

3.2 Il DNA viene “tagliato e incollato” utilizzando enzimi specifici

Sequenzadiriconoscimentodell’enzimadirestrizione

1

2

DNA

L’enzimadirestrizionetagliailDNAinframmenti

Estremitàcoesiva

14


1

2

DNA


Estremitàcoesiva

3AggiuntadiunframmentodiDNAprovenientedaun’altrafonte

15


1

2

DNA


Estremitàcoesiva

3

AggiuntadiunframmentodiDNAprovenientedaun’altrafonte

4

Due(opiù)frammentisileganomedianteappaiamentodellebasicomplementari

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1

2

DNA


Estremitàcoesiva

3

AggiuntadiunframmentodiDNAprovenientedaun’altrafonte

4

Due(opiù)frammentisileganomedianteappaiamentodellebasicomplementari

LaDNAligasiincollaifilamenti

MolecoladiDNAricombinante5

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▪ Una libreria genomica raccoglie tutti i frammenti di DNA clonati provenienti da un genoma

▪ I frammenti sono inseriti in vettori necessari alla loro conservazione e duplicazione

– Plasmidi batterici

– DNA fagico – BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

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3.3 I geni clonati possono essere archiviati in “librerie” genomiche

Plasmide

CloneClone

LibreriaLibreria

oppur

DNA

Genomatagliato

19

▪ È possibile creare una libreria che contiene tutti i geni espressi da un organismo partendo dal suo mRNA

– Una volta isolato l’mRNA si utilizza l’enzima trascrittasi inversa per sintetizzare i filamenti di DNA complementari a quelli di mRNA

– Si elimina l’RNA con un enzima che lo degrada – Si sintetizzano filamenti di DNA complementari a

quelli già ottenuti – Il risultato sono dei frammenti di DNA a doppio

filamento detti cDNA (DNA complementare)

20

3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata per produrre geni da clonare

▪ Una libreria di cDNA è utile per studiare i geni responsabili delle funzioni specializzate di un particolare tipo di cellule

▪ Essendo prive di introni, le molecole di cDNA sono più corte e “maneggevoli” rispetto alle versioni complete dei geni

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3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata per produrre geni da clonare

Nucleodellacellula

Isolamentodell’mRNAdallacellulaeaggiuntaditrascrittasiinversa;sintesidelfilamentodiDNAcomplementare

Splicingdell’RNA2

Trascrizione1

3

Demolizionedell’RNA4

SintesidelsecondofilamentodiDNA

5

mRNA

DNAdiungeneeucariote

IntroneEsone

TrascrittodiRNA

Esone Introne Esone

Trascrittasiinversa

Provetta

SintesidelfilamentodicDNA

cDNAdelgene(senzaintroni)

▪ Per individuare un determinato gene all’interno di una libreria genetica possiamo usare una sonda nucleotidica

– Costituita da DNA o RNA fluorescente o marcato radioattivamente

– Contiene una breve sequenza nucleotidica complementare a una porzione del gene di interesse

23

3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni contenenti geni specifici

24

3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni contenenti geni specifici

▪ Come si può usare una sonda nucleotidica – Si trasferiscono alcune cellule dalle colonie di batteri di

una libreria genica su un disco di carta da filtro – Si tratta il disco in modo da lisare le cellule e separare

i filamenti di DNA – Si aggiunge una soluzione contenente la sonda – La colonia contenente il gene di interesse risulterà

marcata – Si prelevano cellule della colonia di partenza e si coltivano

in modo da ottenere grandi quantità del gene di interesse

Sondaradioattiva

DNAasingolofilamento

L’appaiamentocomplementaremarcailgenedesiderato

AggiuntadiDNAasingolofilamentoprovenientedaunalibreriagenomica

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Lezione 2 GLI ORGANISMI

GENETICAMENTE MODIFICATI

26

- Le cellule e gli organismi ricombinanti ottenuti con la tecnologia del DNA sono usati per sintetizzare proteine e altre molecole utili

- È possibile utilizzare diversi tipi di organismi ricombinanti a seconda delle caratteristiche della molecola che si desidera produrre

– Procarioti: per esempio Escherichia coli – Facilmente manipolabili geneticamente ed economici – Possono secernere le sostanze prodotte nel terreno di

coltura

27

3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati per produrre grandi quantità di prodotti genici specifici

– Eucarioti – Saccharomyces cerevisiae

– Può produrre e secernere complesse proteine eucariotiche

– Colture di cellule di mammiferi – Sono indispensabili per produrre glicoproteine

– Mammiferi ricombinanti – Possono produrre molecole utili e secernerle nel propprio

latte

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3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati per produrre grandi quantità di prodotti genici specifici

▪ La tecnologia del DNA ricombinante è molto utilizzata per la produzione di medicinali e la diagnosi di malattie - Terapie ormonali

– Ormoni identici a quelli umani sicuri, puri ed economici – Per esempio: insulina, HGH, TPA

- Diagnosi – Diagnosi precoce di malattie ereditarie – Diagnosi di infezioni da virus difficilmente identificabili

(HIV)

31

COLLEGAMENTOsalute

La tecnologia del DNA ha trasformato l’industria farmaceutica e la ricerca biomedica

- Vaccini – La tecnologia del DNA ricombinante è utile sia

per ottenere i vaccini che per produrli su larga scala

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COLLEGAMENTOsalute

La tecnologia del DNA ha trasformato l’industria farmaceutica e la ricerca biomedica

▪ OGM (Organismi Geneticamente Modificati) hanno un patrimonio genetico modificato

▪ Organismi transgenici contengono materiale genetico derivante da altre specie

34

3.7 Gli organismi geneticamente modificati stanno trasformando l’agricoltura e l’allevamento

▪ Piante GM modificate per – Resistere a erbicidi, parassiti – Maggiore produttività – Migliori valori nutritivi

▪ Animali GM – Attualmente sono utilizzati solo nella ricerca biologica

o per produrre molecole utili in campo farmaceutico

35

3.7 Gli organismi geneticamente modificati stanno trasformando l’agricoltura e l’allevamento

Agrobacteriumtumefaciens

DNAcontenenteilgeneutile

PlasmideTi Inserimentodel

genenelplasmidemediantel’enzimadirestrizioneelaDNAligasi

PlasmideTi

ricombinante

1

Sitodirestrizione

36


DNAcontaininggenefordesiredtrait



PlasmideTi

ricombinante

1

Sitodirestrizione

Cellulavegetalemodificata

IntroduzionedelplasmideincelluleVegetaliColtivateinvitro

2

DNAcontenenteilnuovogeneinuncromosomadellapianta

37


DNAcontaininggenefordesiredtrait



PlasmideTi

ricombinante

1

Sitodirestrizione

Cellulavegetalemodificata

IntroduzionedelplasmideincelluleVegetaliColtivateinvitro

2

DNAcontenenteilnuovogeneinuncromosomadellapianta

Sviluppodellapianta

3

Piantaconilnuovocarattere

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- Esistono diverse norme e procedure indispensabili per limitare i pericoli legati all’utilizzo di OGM

- Timori comuni – Piante GM possono introdurre allergeni negli alimenti

– Le proteine transgeniche possono essere testate

– Prodotti contenenti OGM devono indicarne la presenza in etichetta

- Rischi per le specie naturali – Trasmissione dei geni modificati a specie selvatiche – Riduzione della biodiversità

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COLLEGAMENTOambienteChi ha paura degli OGM

▪ Terapia genica: curare malattie genetiche modificando i geni degli individui malati

▪ Una possibile procedura – Si clona il gene normale e si inserisce in un vettore

retrovirale

– Si prelevano cellule del paziente interessate dalla malattia e si infettano con il vettore

– Il retrovirus inserisce nel genoma delle cellule il proprio DNA insieme al gene clonato

– Le cellule vengono reinserite nel paziente

41

COLLEGAMENTOsalute

Geni di ricambio

▪ Sperimentazione clinica – Nel 2000 è stata avviata una sperimentazione clinica

di terapia genica su 10 bambini malati di SCID – 9 hanno avuto miglioramenti significativi, 3 si sono

ammalati di leucemia (1 è morto), in 2 casi si è visto che il sito di integrazione del gene era la causa della leucemia

▪ Problemi tecnici e dubbi etici – Come integrare i meccanismi di controllo genico – Come evitare il rischio di danneggiare altre funzioni – Eugenetica e altri dubbi etici

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COLLEGAMENTOsalute

Geni di ricambio

Inserimentodelgenenormaleinunretrovirusvettore

1

Acidonucleicovirale

Retrovirus

Unacelluladelmidolloosseovieneinfettataconilvirus

2

IlDNAviralesiintegranelcromosomadellacellula

3

Iniezionedellecellulenelpaziente

4

Celluladimidolloosseodelpaziente

Midolloosseo

Geneclonato(allelenormale)

43

Lezione 3 I METODI DI ANALISI DEL DNA

45

▪ Il DNA profiling è una procedura che prevede l’analisi di frammenti di DNA per stabilire se essi derivino da un particolare individuo

– Vengono confrontati marcatori genetici che variano da persona a persona

– I marcatori contenuti nei campioni biologici vengono amplificati

– L’amplificazione permette di avere a disposizione quantità sufficienti per il confronto

46

3.8 Ogni individuo è caratterizzato da un diverso profilo del DNA

ScenadeldelittoIsolamentodelDNA

1Sospettato1 Sospettato2

AmplificazionedelDNAdimarcatoriselezionati

2

ConfrontodeiDNAamplificati

3

47

3.8 Ogni individuo è caratterizzato da un diverso profilo del DNA

STEP BY STEP

Perché il profilo genetico viene ottenuto confrontando specifici marcatori genetici e non interi genomi?

48

▪ La PCR permette di amplificare specifiche sequenze di DNA

▪ Si basa sull’utilizzo di una coppia di primer – Brevi sequenze nucleotidiche complementari alle due

estremità della sequenza da amplificare – Funzionano da punto di partenza per la sintesi delle

nuove molecole di DNA ▪ Fasi della PCR

– Il campione viene riscaldato per aprire le doppie eliche – Il campione viene raffreddato facendo appaiare i primer

con le sequenze bersaglio – Una DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti di DNA

allungando i primer 49

3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa la reazione a catena della polimerasi (PCR)

- Applicazioni della PCR – Amplificare DNA preistorico

– Indagini scientifiche sulla scena di crimini

– Diagnosi prenatale di malattie genetiche

– Diagnosi di infezioni di virus difficilmente identificabili

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Ciclo1produce2molecole

DNAestrattodalgenoma

3ʹ 5ʹ 3ʹ 5ʹ 3ʹ 5ʹ

Sequenzabersaglio

ConilcaloresiseparanoifilamentidiDNA

Nellamiscelaraffreddataiprimerformanolegamiidrogenoconleestremitàdellesequenzebersaglio

3ʹ5ʹ

3ʹ 5ʹ

3ʹ5ʹ

3ʹ5ʹ 3ʹ5ʹ

Primer NuovoDNA

5ʹ

LaDNApolimerasiaggiungenucleotidiall’estremità3diogniprimer

21

5ʹ3

51



52

STEP BY STEP

Perché la PCR è adatta all’analisi di DNA molto antichi?

53


▪ L’elettroforesi su gel del DNA – Campioni di DNA vengono posti a un capo di una lastra

di gel – Un elettrodo negativo e posto dal lato del DNA, uno

positivo dall’altro – Le molecole di DNA migrano verso il polo positivo – Più sono grandi più si muovono lentamente nel gel – Quando la corrente viene staccata, sul gel si osserva una

serie di bande ognuna corrispondente a frammenti di DNA della stessa lunghezza

54

3.10 L’elettroforesi su gel separa le molecole di DNA in base alle loro dimensioni

MisceladiframmentidiDNAdidiversedimensioni

Elettroforesicompletata

Molecolepiùlunghe(piùlente)

Gel

Generatoreelettrico

Molecolepiùcorte(piùveloci)

55

STEP BY STEP Perché durante l’elettroforesi le molecole di DNA migrano verso il polo positivo? Perché le grandi molecole si spostano più lentamente di quelle piccole?

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3.10 L’elettroforesi su gel separa le molecole di DNA in base alle loro dimensioni

- DNA ripetitivo: sequenze nucleotidiche presenti nel genoma in moltissime copie

– Le STR sono brevi sequenze ripetute molte volte di seguito presenti nel genoma umano

- Analisi delle STR – Il numero di ripetizioni delle STR in un particolere sito

del genoma varia da persona a persona – Per ottenere il profilo genico di una persona, si

analizzano 13 siti specifici

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3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere i profili genetici

- Analisi delle STR – Il numero di ripetizioni delle STR in un particolare sito

del genoma varia da persona a persona – Per ottenere il profilo genico di una persona, si

analizzano 13 siti specifici – Attraverso appositi primer si amplificano le sequenze di

DNA contenute in questi siti con una PCR – I prodotti della PCR vengono sottoposti a elettroforesi – La lunghezza dei frammenti ottenuti permette di

determinare il numero di STR presenti in ogni sito e confrontarli nei diversi campioni

58

3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere i profili genetici

SitodiSTR1

DNAprelevatosullascenadeldelitto

SitodiSTR2

DNAdell’individuosospettato

IlnumerodiSTRcorrisponde

IlnumerodiSTRnoncorrisponde

59

DNAprelevatosullascena

deldelitto

DNAdell’individuo

sospetto

60

▪ Alcune applicazioni del profilo genetico – Indagini di polizia

– Determinare la paternità o i legami parentali – Identificazione di resti umani

– Identificazione di specie animali e vegetali

▪ Attendibilità del test del DNA – Salvo errori procedurali, la probabilità che due individui

a caso abbiano lo stesso profilo genetico è di 1 su 10 miliardi

61

COLLEGAMENTOsocietà

La parola ai geni

▪ SNP: sono variazioni presenti nel genoma umano che interessano singole coppie di basi

▪ RFLP: sono particolari SNP presenti su siti di restrizione che alterano la lunghezza dei frammenti di DNA ottenibili con il taglio da parte dell’enzima di restrizione

– L’analisi dei RFLP viene effettuata separando mediante elettroforesi su gel i frammenti di restrizione ottenuti dai campioni che si vogliono confrontare

63

3.12 Per individuare le differenze nelle sequenze di DNA si possono usare i RFLP

Aggiuntadeglienzimidirestrizione

Campione 1 Campione 2

Taglio

w

z

x

yyTaglioTaglio

w

z

x

yy

Frammentipiùlunghi

Frammentipiùcorti

64

- Il sequenziamento con il metodo di Sanger si basa sulla possibilità di interrompere la duplicazione di un filamento di DNA e individuare l’ultimo nucleotide inserito

65

3.13 Tramite il metodo Sanger è possibile determinare la sequenza di un frammento di DNA

1. ilframmentodiDNAdicuisidesideradeterminarelasequenzavieneseparatoneiduefilamentichelocompongonoaumentandolatemperaturaevienepoimescolatoinunaprovettaaireagentinecessariperlasintesidelDNA

66

2. lasintesideinuovifilamentidiDNAiniziaall’estremità3delfilamentostampoeprocedefinchénonvienecasualmenteincorporatoundidesossiribonucleotide,chenebloccal’allungamento;allafinesiotterràunamisceladiframmentidivarielunghezzecheterminanoconunnucleotidemarcato

67

3. iframmentivengonoseparatipermezzodiun’elettroforesi,cheavvieneall’internodiuncapillarepienodigel

inquestomodoifilamentimigranolungoilcapillareversoilpolonegativodisponendosisecondolalorolunghezzaeunlettorefluorescentepuòidentificarealloropassaggioiltipodinucleotidechecorrispondeall’ultimaposizionediciascunframmento

68

4. idatipossonoesserelettisottoformadiunospettrogrammacheindicalasequenzacomplementarealfilamentostampo

69

Lezione 4 LA GENOMICA

70

▪ Un genoma è l’intero corredo di geni di un organismo

– I primi studi genomica si sono focalizzati su organismi semplici come i procarioti

– Gli studi recenti hanno permesso il sequenziamento del genoma di molti eucarioti, compreso quello umano

▪ La comparazione di genomi di diversi organismi – Permette di individuare le relazioni evolutive

– Aiuta a individuare le funzioni dei geni

71

3.14 La genomica è lo studio scientifico di interi genomi

▪ Una volta sequenziato il genoma di un organismo – Si individuano gli Open Reading Frames

– In caso di geni codificanti si può dedurra le sequenza amminoacidica

– Si identificano le sequenze regolatrici

▪ Queste informazioni possono essere analizzate con due approcci

– Funzionale: approfondendo il ruolo di ciascun gene

– Comparativo: confrontando i genomi di diversi organismi

73

3.15 Si possono ottenere molte informazioni diverse dallo studio dei genomi

- Oltre al genoma di un organismo è possibile studiare – Il suo trascrittoma: l’insieme di molecole di RNA

effettivamente trascritte

– Il suo proteoma: l’insieme di tutte le proteine espresse

- L’analisi di informazioni così ricche e complesse è resa possibile dagli strumenti forniti dalla bioinformatica

75

3.15 Si possono ottenere molte informazioni diverse dallo studio dei genomi

- Il Progetto Genoma Umano è un progetto pubblico di ricerca che ha lo scopo di determinare l’intera sequenza nucleotidica del genoma umano

– Il DNA è stato prelevato da 5 donatori statisticamente rilevanti

– Lo scopo era quello di identificare la sequenza e la posizione di ogni gene presente nel nostro genoma

– Nel 2000 ha raggiunto il suo scopo

76

Cacciatori di geniCOLLEGAMENTOsocietà

- Celera Genomics è una società privata che ha lavorato allo stesso scopo, in parallelo con un sistema diverso

– Con questo metodo ha sostenuto costi più di 10 volte inferiori rispetto al Progetto Genoma Umano

– Pur iniziando in un secondo momento è arrivata ad ottenere il sequenziamento completo in contemporanea

77


- Risultati e applicazioni – Gli esseri umani hanno circa 2100 geni che

rappresentano solo l’1,5 % del DNA – Il resto è composto da introni, sequenze regolatrici, e

in gran parte da sequenze ripetute ed elementi trasponibili

– La mappatura del genoma umano ha permesso di individuare centinaia di geni associati a malattie

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DNAripetitivocomprendenteelementitrasponibiliesequenzeaffini(44%)

DNAripetitivoprivodielementitrasponibili(15%)

DNAnoncodificante(15%)

Introniesequenzeregolatrici(24%)

Esoni(regionideigenicodificantiperunaproteinaotrascritteinrRNAotRNA)(1,5%)

80

▪ Il Progetto Genoma Umano ha applicato una procedura in tre stadi

– Mappa genetica a bassa risoluzione creata analizzando 5000 RFLP

– Mappa fisica indicante il numero di basi compreso tra un marcatore e l’altro

– Sequenziamento dell’insieme di frammenti di DNA precedentemente mappati

81

3.16 Il metodo di sequenziamento shotgun applicato a interi genomi può fornire rapidamente una grande quantità di dati

Frammentazionemedianteenzimadirestrizione

Cromosoma

FrammentidiDNASequenziamentodeiframmenti

Allineamentodeiframmenti

Riassemblaggiodellasequenzacompleta

82

STEP BY STEP Qual è il vantaggio principale del metodo shotgun?

83

3.16 Il metodo di sequenziamento shotgun applicato a interi genomi può fornire rapidamente una grande quantità di dati

- Il confronto tra genomi di specie affini permette di fare luce su eventi evolutivi recenti

- Confronti tra specie più lontane permettono di indagare la storia evolutiva più remota

allalucedell’evoluzione

84

3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza evolutiva tra esseri umani e scimpanzé

- Confronto tra genoma umano e di scimpanzé

– Differenza dell’1,2% per sostituzioni di singole basi – Differenza del 2,7% per inserzioni o delezioni di

porzioni più estese – Una importante differenza riguarda il gene FOXP2

– Sembra abbia subito un veloce cambiamento nella specie umana

– Mutazioni associate a problemi nel linguaggio – Le differenze individuate potrebbero essere importanti per

spiegare l’evoluzione del linguaggio esclusiva della nostra specie

allalucedell’evoluzione

85

3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza evolutiva tra esseri umani e scimpanzé

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