UN PO DI STORIA... 1900 - Riscoperta delle leggi della trasmissione ereditaria dei caratteri, che...

UN PO’ DI STORIA...

1900

- Riscoperta delle leggi della trasmissione ereditaria dei caratteri, che Mendel aveva pubblicato nel 1865 e che avevano come assunto l'esistenza di fattori discreti, elementen, i geni, che

determinano i caratteri e che si trasmettono da una generazione all'altra.

1902

- Sutton ipotizza che i fattori mendeliani, i geni, siano localizzati sui cromosomi.

1910-1911

- Morgan inizia a mappare i geni sui cromosomi del moscerino della frutta D.Melanogaster

1944

- Avery MacLeod e McCarty stabiliscono che il DNA è il materiale ereditario.

1953

- Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica per il DNA

1956- Viene stabilito che il patrimonio cromosomico completo dell'uomo è di 46 cromosomi.

1961-1966- Viene decifrato il codice genetico, ovvero stabilito il rapporto tra le 64 triplette possibili a partire

dalle 4 basi nucleotidiche del DNA, e i 20 aminoacidi che formano le proteine.

1967

- Mary Weiss e Green introducono la tecnica dell'ibridazione delle cellule somatiche che rende più agevole la mappatura dei geni umani.

1972

- Berg costruisce la prima molecola DNA ricombinante in vitro utilizzando gli enzimi di restrizione. Vengono realizzati con successo i primi esperimenti di clonazione del DNA.

1973

- Cohen, Chang e Boyer costruiscono il primo batterio ricombinante. Si tiene la prima conferenza sulla mappatura dei geni umani.

1974

- Cohen e Boyer ottengono l'espressione di un gene estraneo trapiantato in un batterio con la tecnica del DNA ricombinante.

1975- Si tiene la conferenza di Asilomar che propone una moratoria sugli esperimenti con il DNA ricombinante

in assenza di linee guida per la sicurezza delle manipolazioni genetiche.

1977- Per la prima volta un gene umano viene ricombinato e inserito in un batterio per clonare una proteina,

la somatostatina Sanger, già premio Nobel come inventore del metodo per sequenziare le proteine, sviluppa un metodo nuovo ed efficiente per sequenziare il DNA (contemporaneamente

Gilbert e Maxam inventano un metodo analogo).

1978- Boyer costruisce una versione sintetica del gene dell'insulina e lo inserisce in un batterio. La

Genentech, fondata nel 1976 dallo stesso Boyer insieme a Swanson, otterrà il permesso di commercializzare l'insulina prodotta per ingegneria genetica nel 1982 e quindi il brevetto

1978-1980- Vengono sviluppate nuove tecniche basate sull'ibridazione molecolare e l'utilizzazione come marcatori

delle variazioni individuali del DNA per mappare fisicamente i geni e le sequenze geniche sui cromosomi. Grazie alle nuove tecniche e alla collaborazione internazionale tra i mappatori, i geni

mappati passano da 579 nel 1981 a 1.879 nel 1991: tra questi vengono mappati il gene della corea di Huntington (1983), il gene per la distrofia muscolare (1987) e il gene per la fibrosi cistica (1989).

1980- Viene concesso il primo brevetto su una forma di vita geneticamente modificata, un microrganismo

che si nutre di petrolio. Mullis inventa la tecnica della PCR.

1981- Viene prodotto il primo animale transgenico.

1983- Viene inventato il primo sequenziatore automatico.

1989- Viene creato il National Center for Human Genome Research (NCHGR), guidato da James Watson per

mappare e sequenziare tutto il DNA umano entro il 2005

1992- Craig Venter crea l'Institute for Genomics Research.

1993- Francis Collins assume la direzione del National Human Genome Research Institute (ex NCHGR).

1995- Viene pubblicata la prima sequenza completa del genoma di un organismo vivente diverso da un

virus, il batterio Haemophilus influenzae.

1996- Viene riportato il sequenziamento completo del primo organismo complesso, il lievito

Saccharomyces cerevisiae.

1997- Viene costruito il primo cromosoma umano artificiale e annunciata la clonazione di un mammifero,

Dolly .

1986

- Viene proposto da diversi biologi molecolari, tra cui Renato Dulbecco, di sequenziare completamente il genoma umano.

1988- Viene concesso il brevetto per un topo transgenico altamente suscettibile al tumore del seno.

1998- Viene pubblicata una prima bozza della mappa del genoma umano, che mostra la localizzazione di più di

30.000 geni. Viene pubblicata la sequenza completa del primo genoma di un animale, il verme Caenorhabditis elegans. Venter e la Perkin Elmer Corporation fondano la Celera Genomics con l'intento di

sequenziare tutto il genoma umano in tre anni con il metodo del whole genome shotgun.

2000- Viene pubblicata la sequenza completa del genoma di Drosophila melanogaster e viene annunciato dalla Celera Genomics il sequenziamento di tutte le basi nucleotidiche del DNA umano con il metodo

whole genome shotgun.

Date storiche della sequenza del DNA

1869

Miescher osservaper la prima volta il DNA

1953Watson e Crick determinano lastruttura della doppia elica

1944Avery propone il DNA come materiale genetico

1965Holley sequenza il tRNAdi lievito

1970

Vengono sviluppate le tecnicheper la sintesi degli oligonucleotidi e perla degradazione chimica del DNA. Viene introdotta l’elettroforesi su gel per la Separazione di frammenti di DNA

1980 Il DNA genomico viene clonato nel fago M13o in vettori plasmidici, nascono i primi programmiinformatici di analisi dei dati, vengono sviluppatenuove tecnologie per il sequenziamento

1977

METODO SANGER(terminazione di catena)METODO MAXAM-GILBERT(degradazione chimica)

1986KARY MULLISIntroduce la PCR 1989

AUTOMAZIONE PARZIALEVengono sviluppate le prime apparecchiatureper il sequenziamento che impiegano sistemi per la rilevazione della fluorescenza.

2000Automazione completaSequenziamento completodel genoma umano

Sequenziamento

Estrazione di DNA o RNA

PCR o amplificazione mediante clonaggio

Purificazione del campione di DNA

Cycle Sequencing

Precipitazione dei prodotti di cycle sequencing

Sequenziamento automatico

Analisi dei dati

Sequenziamento del DNA

Metodi tradizionali ed odierni

Metodi di Maxam-Gilbert e di Sanger

Hanno in comune la generazione di una scaletta di frammenti di DNAA singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base.Frammenti di dimensioni crescenti possono essere separati mediante Corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide.A corsa ultimata il gel viene posto a contatto con una pellicola radioraficaSulla quale lascia impressa la disposizione delle bande.L’immagine ottenuta, letta di seguito darà la sequenza delle basi.

Il metodo Maxam-Gilbert(o metodo di sequenziamento a degradazione

chimica)

Questo metodo, basato sulla degradazione chimica di frammenti di DNA a doppio filamento, è ormai poco utilizzato, perché non adattoal sequenziamento automatico e perché utilizza composti chimici dannosi alla salute

Si differenzia da tutti gli altri metodi perché non utilizza sintesi enzimatiche ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli nucleotidi.

I frammenti di DNA a doppio filamento possono essere generati per frammentazione o digestione enzimatica. In entrambi i casi le molecole a doppio filamento devono essere convertite in molecole a singolo filamento e marcate terminalmente

Marcatura terminale al 5’ o al 3’ del DNA a doppio filamento

Denaturazione e separazione dei due filamenti

Il DNA a singola elica viene suddiviso in quattro campioni, ognunodei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una o due delle 4 basi del DNA.

G = DMS + piperidinaG + A = DMS + piperidina + acido formico C + T = idrazina + piperidinaC = idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M

Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazione parziale: statisticamente tutte le possibili basi saranno degradate producendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalla distanza tra l’estremità marcata e il sito di taglio Separazione dei frammenti marcati mediante gel elettroforesi e Visualizzazione dei risultati mediante autoradiografia

Il metodo Maxam-Gilbert

Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)

Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento

Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da

•Elevata processività•Bassa attività esonucleasica 5’-3’•Bassa attività esonucleasica 3’-5’

(es. Klenow, Sequenasi)


un innesco specifico (primer)

La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad

Uno stampo a singola elica ha bisogno di:

5’-A T C T T T T A G A G T A C C3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

PRIMER DNA Polimerasi

5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

DNA PolimerasiPRIMER

Sintesi del filamento marcato


Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad

• uno stampo a singola elica

• un innesco specifico (primer)

• la marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

ha bisogno di:

• una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

La sintesi del filamento complementare, tuttavia non prosegueindefinitamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossi nucleotiditrifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento

perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Terminazione della catena

ddCTPddCTP

ddCTPddCTP

ddCTPddCTP

5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

DNA Polimerasi

PRIMER

+ ddNTP ( per es. ddCTP)

5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A T G T AddC3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

STOP

Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascunoin corrispondenza di ogni dCTP

DNA stampo a singola elica

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC5’ 3’

Ibridazione conIl primer

+ [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTTP(dNTP)+Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC-C ddC

-CC ddG-CCGATT ddG

-CCGA ddT-CCGAT ddT

Sequenza: 5’-CCGATTG

A C G T

-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC

GT

T

AGCC

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

Direzione dilettura

Pratica ormai superata dal seq. automatico

Marcatura Radioattiva

Primer marcati con 32P oppure 35S dNTP

Colorazione Silver Staining

Evidenzia direttamente su gel le bande senza ulteriori modificazioni, attraverso la precipitazione di Ag

Sequenziamento manuale

Nuovi metodi di sequenziamento

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimmetrica)

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Il pirosequenziamento

1 Colorante - 4 Corsie

Per ogni campione si eseguono 4 reazioni di estensione separate (una per ogni ddNTP) utilizzando un unico colorante

L’uso di 4 corsie aumenta però la variabilità di corsa


4 Coloranti - 1 Corsia

Unica reazione ed unica corsa;

Ad ogni nucleotide è associata una diversa colorazione:

ddATP

Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la variabilità di corsa

ddTTP

ddGTP

ddCTP


Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTPun diverso marcatore fluorescente, è

possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggioe caricare il tutto in un solo pozzetto di gel

ddA

ddC

ddT

ddG

Metodi di Marcatura

Marcatura dei Primers

primers progettati con “tag” colorati a:

Fluorescenza UV

Fluorescenza IR minore Background

maggiore Sensibilità

Marcatura dei Terminatori

ddNTPs marcati con fluorofori o differenti coloranti


Terminatori BigDye

Sistemi a trasferimento di energia a singola molecola, costituiti da accettore e donatore legati da un linker

Vantaggi:

Segnale omogeneo, basso rumore di fondo, luminosità

maggiore, facilità interpretativa per A e G

attigueD A


Dalla cycle sequencingall’elettroforetogramma...

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colorediverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Prevede l’utilizzo di marcatura a fluorescenza rilevata automaticamente da un laser

reazione e caricamento dei campioni sono eseguite manualmente

Esistono kits in commercio che permettono di velocizzare e standardizzare tali operazioni fornendo mix di reazione, soluzioni di poliacrilammide a cui aggiungere soltanto Temed o gel preformati

Sequenziatori a GelSequenziatori a Gel


“slab” gel di poliacrilammide (dal 4% al 6%) molto sottili in condizioni denaturanti (Urea)Apparati verticali di lunghezza variabile a seconda del numero di basi da leggere (22 cm-1 m)

Il forte campo elettrico a cui vengono sottoposti produce elevato calore che deve essere dissipato con piastre di alluminio o ventole

Gel per elettroforesi

l’intervento dell’operatore è minimo

il sistema carica automaticamente il capillare con il polimero di corsa

esegue la separazione elettroforetica

i frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che corrono lungo il capillare

Sequenziatori Capillari Sequenziatori Capillari


Sequenziatori Capillari

Richiede campioni privi di: sali, molecole cariche negativamente, proteine, detergenti e templates non marcati

1 Capillare

16 Capillari

96 Capillari

(Scala di Produzione)


Sistemi di Rilevamento

Camera CCD ( Charge - Coupled Device)

Altissima risoluzioneImmagine Elettroferogramma Sequenza in pochi minuti

Assenza di Filtri

Uso di qualsiasi colorante

Camera a Lettura Multipla

Doppio Laser Doppio Rilevatore Es. NIR o SBS


Software

Controlla e ottimizza i parametri elettroforetici Normalizza le bande Sottrae il backgroundCorregge l’effetto “Smile” Adatta gli algoritmi se mobilità e spaziatura dei picchi escono dal range


Possibili Cause Possibili Soluzioni

• Il primer non trova sito di annealing

• Cambiare primer

• Il DNA presenta contaminazioni di vario tipo

• Ripreparare il DNA

• La quantità di DNA e' insufficiente • Aumentare la quantità di DNA

• La quantià di primer è insufficiente • Aumentare la quantità di primer

• Il primer è stato disegnato male, es. temperatura di melting troppo bassa

• Ridisegnare il primer

Reazione fallita: non presenta picchi definiti e ha un alto rumore di fondo


Campione che presenta rumore di fondo

sufficientemente alto da causare ambiguità (N) nel riconoscimento dei picchi

da parte del software

• La quantità di DNA e' insufficiente e il segnale troppo debole

• Aumentare la quantità di DNA

• Il DNA presenta contaminazioni che inibiscono la reazione

• Purificare meglio il DNA

• Ci sono altri templati contaminanti• Ripreparare il DNA


Perdita di risoluzione precoce per cui i picchi

sono sempre meno definiti

• Il DNA presenta contaminazioni che inibiscono la reazione

• Purificare meglio il DNA


• Clone o PCR multiple con stesso tratto iniziale, es. vettore

• Ripreparare DNA in modo da avere un tipo di templato unico

• Siti multipli di attacco del primer sul DNA • Cambiare primer

• Mutazione frame shift

• Slittamento dopo una regione omopolimerica

Sequenza doppia dopo un

tratto buono


Sequenza fuori scala

• Troppo DNA • Riquantizzare e ridurre la quantità di DNA

• Struttura secondaria che blocca la reazione

• Pretrattare con DMSO


Regione ricca in GC

• Struttura secondaria che impedisce l'avanzamento della polimerasi perchè, per effetto dell'alta Tm del tratto di DNA, i due filamenti non si separano bene

• Sequenziare un prodotto di PCR amplificato sostituendo il 75% del dGTP con 7-deaza-dGTP

• Modificare il ciclo standard di sequenziamento con temperature più alte

Sequenziamento automatico:

Applicazioni in ambito biomedico

Sequenziamento di DNA o cDNA sconosciuto ( es. per caratterizzare regioni del DNA e trascritti genici precedentemente localizzate con analisi di linkage)

• Primer walking

• Shotgun sequencing

utilizzo di vettori di clonaggio

Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per analisi mutazionale

utilizzo di PCR

• Vettori fagici a singolo filamento

• Vettori plasmidici a doppio filamento

• Vettori fagomidici

• Vettori per grossi inserti di DNA

MappingTecnica del

“Chromosome Walking”

Sequenziamento di Library

Progetto Genoma

Sequenziamento Ex Novo

Uso di Primers Universali

Es. M13

Sfrutta l’Overlapping dei vari frammenti

Assemblaggio ed Allineamento delle sequenze tramite

Computer

Tecnica del “Random Sequencing”

Le finalità principali del progetto genoma riguardano l'acquisizione i informazioni utili per individuare l'eventuale implicazione di alterazioni nella sequenza del DNA nello sviluppo di patologie genetiche nell'uomo, e per comprendere le basi genetiche dell'evoluzione e del funzionamento dell'organismo umano

Sintesi di Oligonucleotidi

Probe per Microarray

Oligonucleotidi antigene/antisenso

analisi dell’espressione genica

farmacogenomica

SNPs

Dare un senso ai dati di sequenza non è facile!!

Isole CpG: la citosina può essere metilata nei geni inattivi

Sequenze di siti di splicing in 5’ e 3’:come marcatori per gli introni e le zone di confine con gli esoni

ORF:

mRNA CUUAGCGUAGCUACUAGACUAG

fase 1 CUU/AGC/GUA/GCU/ACU/AGA/CUA/G

fase 2 CU/UAG/CGU/AGC/UAC/UAG/ACU/AG

fase 3 C/UUA/GCG/UAG/CUA/CUA/GAC/UAG

Open readingframe

Perché sequenziare anche organismi diversi da Homo Sapiens?

Ad esempio per confrontare le sequenze altamente conservate, è più probabile che codifichino proteine funzionalmente importanti

Sequenziamento di DNA o cDNA sconosciuto ( es. per caratterizzare regioni del DNA e trascritti genici precedentemente localizzate con analisi di linkage)

• Primer walking

• Shotgun sequencing

utilizzo di vettori di clonaggio

Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per analisi mutazionale

utilizzo di PCR

• Vettori fagici a singolo filamento

• Vettori plasmidici a doppio filamento

• Vettori fagomidici

• Vettori per grossi inserti di DNA

Comparativa e/o Mutazionale Uso Diagnostico

Implicazioni Terapeutiche

Applicazione non di routine

Monitoraggio pazienti in terapia

Test di Genotyping Es. HIV

Dimensione della mutazione

Genoma

Cromosoma

Gene

Poliploidie

Aneuploidie

Riarrangiamenti cromosomici

Piccole delezioni/duplicazioni

Delezioni/duplicazioni geniche

Delezioni/duplicazioni nucleotidiche

Mutazioni nucleotidiche

Bandeggio cromosomico

Fish di interfase

Fish cromosomica

Genetica molecolare

Sequenziamento

Mutazione di unsingolo nucleotide

Mutazioni per inserzione o delezione di nucleotidi in eterozigosi

Sequenziamento del tratto nucleotidico delle immunoglobuline (Ig) relativo al riarrangiamento della regione variabile CDR3 specifica del clone tumorale, da utilizzare in neoplasie linfoidi di tipo B per il monitoraggio della malattia minima residua e come base per la produzione di vaccini anti-idiotipici paziente-specifici.

Sequenziamento della VH-CDR3

Pession et al, Leuk Lymphoma 2003

Sequenziamento regione CDR3 del TCR per caratterizzazione cloni di linfociti T in vitro/vivo

CDR 3

REGIONI CHE DETERMINANO LA COMPLEMENTARIETA’

Sequenziamento regione CDR3 del TCR per caratterizzazione cloni di linfociti T in vitro/vivo

Montagna et al int.j of cancer 2004

Genotipizzazione del genoma virale del lentivirus HIV, responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita umana (AIDS)

una delle caratteristiche di questo virus è quella di andare in contro spesso a mutazioni casuali nel proprio genoma.

ne consegue la selezione di ceppi resistenti ai farmaci

HIV

ViroSeq Kit (Applied Biosystems Inc.)

TRUGENETM HIV-1 Genotyping Kit (Visible Genetics Inc)

Individuazione Resistenze farmaci in

pazienti non rispondenti

Software allinea sequenza con WT

Rileva Mutazioni

Accesso a Banca Dati

Regole che correlano singole o combinazioni di mutazioni al grado di resistenza per ogni

farmaco

HIV

Valutazione dello stato di metilazione di un gene ed in particolare del suo promotore

Tecnica del bisufilto

Il trattamento con bisulfito converte le citosine non metilate in timine

Le citosine metilate (quelle delle isole CpG) rimangono tali

Attenzione nel progettare i primers !! (escludere le parti con CpG)

Decitabina: demetilante inibendo la DNA metil-transferasi

Dott.ssa Formica, dott.ssa Dan, lab. Oncoped.

LAM in particolare con riarrangemento di MLL

The Human Genome Project htt p://w ww.nhgri.nih.gov

un sito dedicato al Progetto GenomaUmano gestito dal NHGRI ( TheNational Human Genome ResearchI nstitute)

GenBank htt p://w ww.ncbi.nlm.nih.govun sito in cui si possono trovaresequenze di DNA e di proteine.

EMBL htt p://w ww.ebi.ac.uk un sito dove sono raccolte lesequenze del genoma umano.

GDB (genome database): htt p://w ww.gdb.org/il più importante databaseconcernente la mappatura delgenoma.

dbESThtt p://w ww.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ index.html

raccoglie le sequenze parzialiott enute dai cDNA

OMI M (on-line MendelianI nheritance in Man)

accesso attraverso GDBcatalogo elett ronico di MendelianI nheritance in Man di VictoMcKusick, un elenco delle malattieumane ereditarie.

MGD (Mouse Genome Database) htt p://w ww.informatics.jax.orgdatabase del genoma murino,

Généthon htt p://w ww.genethon.fr/ mappa genetica basata sui marcatoricon ripetizioni (CA)n

CHLC (Co-operative Human LinkageCenter)

htt p://lp g.nci.nih.gov/CHCL/

database contenente una mappagenetica e dati riguardanti ilgenotipo e i marcatori genetici,contenente un programma perl’analisi di linkage

CEPHhtt p://w ww.cephb.fr/ bio/ ceph-genethon-map.html

mappa f isica del genoma umanobasato sugli YAC.

CELERAhtt p://w ww.celera.com/ il sito internet della società privata

americana diretta da Greg Venter

bibliografia sul progett o genomaumano

www.nature.com/genomics/0

Whitehead I nstitutehtt p://w ww-genome.wi.mit.edu/

mappa f isica del genoma umanobasata sugli YAC

Elenco dei siti che contengono informazioni sul Progetto Genoma Umano e sui frammenti di DNA sequenziati.

Il clonaggio dell’intero genoma umano non è difficile tecnicamente e sono disponibili genoteche in fagi od in cromosomi artificiali di lievito abbastanza ampie da contenere diverse volte il genoma umano; ma il DNA di queste genoteche è stato clonato in modo casuale dal genoma.

Perché abbia un senso il DNA in questi cloni deve essere strutturato nell’ordine corretto, in modo da poter ricostruire il genoma , o suoi frammenti che siano abbastanza ampi da contenere porzioni di sequenze biologicamente interessanti.

Sospetto clinico(sintomatologia, storia familiare)

Isolamento dal sangue perifericodi linfociti circolanti

Analisi delcariotipoEstrazione del DNA

Amplificazione tramite PCR

Diagnosicitogenetica

Southern blot

Corsa su gel SSCP

sequenziamentoRFLP

Creazione odistruzione di un sito di restrizione

diagnosi di delezioniinserzioni duplicazioni

identificazione di nucleotidi alterati

diagnosi di specifichemutazioni puntiformi

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