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Trasduzione dei segnali del TCR

Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2013/2014

TCR: trasduzione del segnale

• I segnali trasdotti dal TCR inducono l’espressione

coordinata di numerosi geni (silenti nelle cellule naive)

– proliferazione

– differenziamento

– funzioni effettrici

• La trasduzione del segnale del TCR è indotta dalla

stimolazione di più recettori per l’antigene e corecettori

• Il risultato del riconoscimento dell’antigene è

determinato dalla durata e dalla affinità dell’interazione

TCR-complesso peptide MHC


Gli eventi precoci in risposta al riconoscimento dell’antigene

comportano il raggruppamento di diversi recettori di

membrana, la fosforilazione in tirosina di numerose proteine e

il reclutamento di molecole adattatrici


I segnali indotti dal recettore per l’antigene attivano

diverse vie di trasduzione

Un

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4

Eventi di trasduzione del segnale

• attivazione tirosine chinasi/fosfatasi

• coinvolgimento di molecole adattatrici

• generazione di secondi messaggeri – DAG, IP3, Ca2+, cAMP, cGMP

• amplificazione attraverso cascate di enzimi

• attivazione di serina/treonina chinasi/fosfatasi

• attivazione di fattori di trascrizione

• attivazione trascrizione di geni


• TCR ha una bassa affinità per complessi MHC-peptide – Kd 10-5-10-7 M

– Off rate veloce

• Singoli TCR inducono un segnale debole

• Poche delle molecole MHC espresse da APC presentano peptide riconoscibile da un determinato TCR

• Solo 10-100 complessi MHC-peptide (in un totale di 104-105) necessitano di essere riconosciuti da TCR per indurre attivazione

• Lo stesso TCR può essere attivato più volte

• L’intero processo può durare ore

TCR: trasduzione del segnale


• Questa prolungata interazione è permessa dalla costituzione della SINAPSI IMMUNOLOGICA nell’area di contatto tra cellula T e APC

• Il raggruppamento di raft è un evento necessario per la formazione della IS

• A seguito di stimolazione TCR monomerici vengono reclutati in raft e formano dei cluster

• Anche molecole adattatrici e di trasduzione del segnale sono reclutate nei raft (ZAP70, Vav, Grb2)

“Sinapsi Immunologica”


I raft

• I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in lipidi saturi, colesterolo e GM1

• Compartimentalizzano molecole importanti per la trasduzione del segnale – che sono reclutate nei raft attraverso modifiche post-

traduzionali • aggiunta di acido miristico: p56lck e p59fyn

• aggiunta di acido palmitico: p56lck, LAT e PLCg1, H-Ras

• L’integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali indotti da TCR

• In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all’IS


Linfocita T non stimolato

Stimolazione TCR

Stimolazione TCR e CD28

La stimolazione di TCR e CD28 polarizza i

raft verso il sito di contatto


• Inizialmente cellula T e APC interagiscono attraverso molecole di adesione

– LFA-1 ICAM

• In questa fase TCR controlla complessi MHC-peptide

– se non riconosce complessi, l’interazione cellula T-APC cessa

• Se TCR riconosce complessi MHC-peptide invia segnale:

– aumento affinità LFA-1 → stabilizzazione interazione

– arresto migrazione (segnale di stop), ritiro uropode

• meccanismo che ritiene cellule T in organi linfatici secondari

Sinapsi Immunologica (3)


Ruolo di integrine e TCR in

interazione cellule T - APC

TCR non riconosce

complesso Ag-MHC

Dissociazione

APC cellula T

TCR riconosce

Complesso Ag-MHC

Forte adesione

APC cellula T Risposta

funzionale

Adesione debole

Indipendente da Ag


• Stimolazione di TCR e LFA-1 induce polarizzazione cellula T in direzione della APC

• Riorganizzazione citoscheletro – filamenti di actina e talina sono reclutati nei pressi della IS

– MTOC (MicroTubule Organising Center) si sposta dall’uropode a IS

– questi eventi favoriscono il reclutamento di recettori e molecole di trasduzione alla IS

• LFA-1 migra verso la porzione esterna dello SMAC mentre i TCR muovono al centro – il blocco nella formazione di questo cluster centrale blocca

l’attivazione dei linfociti T

• La riorganizzazione è in parte condizionata dalle dimensioni dei complessi recettori-ligandi

Sinapsi Immunologica (4)


MHC B7 ICAM

CD58 ICAM

CD2 TCR CD28 LFA-1 LFA-1

15 nm

Linfocita T

APC


Supra-Molecular Activation Cluster

LFA-1 TCR

cSMAC

pSMAC

Overlay CD28


A seguito di attivazione

PKCq è reclutata nella IS

A seguito di attivazione

CD45 non è reclutata nella IS


Complesso del TCR

• CD3

– catene g, d, e

• omologhe l’una con l’altra

• singolo dominio Ig

– 1 eterodimero e/d

– 1 eterodimero g/e

• catena z

– omodimero z/z

• in 90% CD3

– eterodimero z/h

• in 10% CD3

• h splicing alternativo z

• le catene z sono associate

anche ad altri recettori

• durante la maturazione dei timociti le

proteine del CD3 e z sono espresse

prima del TCR ma saranno presenti

sulla membrana cellulare solo dopo il

corretto assemblaggio con le catene

a/b del TCR


Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif

ITAM

• ITAM: Tyr-x-x-Leuxxxxxx(xx)Tyr-x-x-Leu

• 1 ITAM in catene g, d, e

• 3 ITAM in catene z

• Le sequenze ITAM del CD3/catene z collegano funzionalmente il riconoscimento dell’antigene avvenuto con il TCR alla trasduzione del segnale

ITAM in altre molecole

ITAM

• La fosforilazione delle ITAM del CD3 e delle catene z avviene pochi secondi dopo la stimolazione del TCR

• Due famiglie di PTK fosforilano e interagiscono con le ITAM – Src e Syk

• Inibitori delle PTK inibiscono gli effetti della stimolazione del TCR


TCR CD4

Membrana cellulare

linfocita T

Membrana cellulare

APC

Il corecettore CD4

• Composto da 1 catena

• 4 domini Ig extracellulari

• riconosce dominio b2 di MHC II

• CD4 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica

• Topi KO per CD4 non hanno linfociti T ristretti da MHC II

– se transfettati con CD4 normale sviluppano linfociti T ristretti da MHC II

– se transfettati con CD4 privo del sito di legame per p56lck mancano di linfociti T ristretti da MHC II

• Espresso da timociti, linfociti Tab periferici (ca. 65%), alcune cellule dendritiche

MHC II


Il corecettore CD8

• Composto da 2 catene legate da ponte disolfuro

– eterodimero CD8a/CD8b

– omodimero CD8a/CD8a

• 1 dominio Ig extracellulare/catena

• riconosce dominio a3 di MHC I

• CD8 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica

• Topi KO per CD8 non hanno linfociti T ristretti da MHC I


La Src chinasi p56lck

• “Unique”, sequenza caratteristica della famiglia, lega CD4 e

CD8

• SH3, lega sequenze specifiche ricche in prolina

• SH2, lega P-Tyr all’interno di specifiche sequenze

• Kinase, dominio catalitico

• R, dominio regolatorio

N-terminale C-terminale

Unique SH3 SH2 Kinase R

Y Y


Dominio SH2

• SH2, Src Homology 2

• Dominio proteico

strutturalmente conservato

contenuto in Src ed altre

proteine che trasducono

segnali

• SH2 lega residui di Tyr

fosforilati nel contesto di

specifcihe sequenze

peptidiche

NH2

COOH

Dominio SH2 di p56 Lck


//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d7/1lkkA_SH2_domain.png

L’attività catalitica di Lck è regolata da

cambiamenti conformazionali

• Fosforilazione di Y in dominio catalitico induce cambiamento conformazionale che permette accesso del substrato

• La fosforilazione della Tyr nel dominio regolatorio induce una conformazione chiusa – SH2 interagisce con il C-terminale

SH3

SH2

Dominio catalitico Dominio regolatorio Y

Y P

Y

Y P Y Stimolazione TCR

PTPase

CD45

Csk


La Syk chinasi ZAP-70

• z chain-associated protein 70

• Espressa esclusivamente in linfociti T e NK

• 2 domini SH2 legano ITAM fosforilate con affinità elevata

• La fosforilazione di Y292 ad opera della stessa ZAP-70 inibisce l’attività catalitica

– autoregolazione negativa

• La fosforilazione di Y493 nel dominio catalitico attiva l’enzima

– Y493 fosforilata da p56lck

N-terminale C-terminale

493 292

SH2 Kinase SH2

Y Y

• ZAP-70 si lega alle ITAM fosforilate attraverso 2 domini SH2

ZAP

• p56lck fosforila le ITAM di CD3 e z

• p56lck fosforila Y493 di ZAP-70

• CD4 avvicina Lck a TCR-CD3

• MHCII-Ag, TCR e CD4 interagiscono

CD4

MHCII-Ag

TCR

CD3

zz

TCR

CD3

CD4


LAT, Linker for Activation of T cells (1)

• Molecola adattatrice che permette di reclutare enzimi e altri adattatori

• Permette l’attivazione di almeno3 vie di trasduzione

– Ras Raf Mek Erk Elk Fos

– SLP76 Vav Rac Mekk JNK Jun

– PLCg1

• IP3 Ca2+

• DAG PKC

• Localizzato nei raft attraverso modifica post-traduzionale (palmitoilazione)

• Viene fosforilato da ZAP70


• In assenza di LAT molti degli eventi indotti dalla trasduzione del segnale del TCR sono compromessi:

– flusso di calcio

– attivazione ERK e altre MAP chinasi

– attivazione NF-AT

– attivazione AP-1

– produzione IL-2

• LAT è richiesto anche per lo sviluppo dei linfociti T nel timo

• Topi LATKO non producono cellule T mature

LAT, Linker for Activation of T cells (2)


CD3

abTCR CD4

PIP2

DG

IP3

LA

T

PKCq

PL

C

LAT PLCg1

lck

ZAP


ZAP lck

CD3

abTCR

PL

C

CD4

PIP2 DG

IP3

LA

T

Ca2+

PKCq

CRAC

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ras

Attivazione

fattori

trascrizione

LATPLCg1Ca2+


L’aumento di Ca2+ libero

intracitoplasmatico è transiente


CD3

abTCR CD4

LA

T lck

ZAP

LATSOSRasMAP chinasi

Grb2

Sos

Shc

Raf

MEK

ERK Attivazione

fattori

trascrizione Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2013/2014

CD3

abTCR CD4

LA

T

PL

C

lck

ZAP

vav

CD28

LAT SLP76 VAV

Attivazione

fattori

trascrizione Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2013/2014

Attivazione fattori di trascrizione

• De novo sintesi

– c-Fos

• componente di AP-1

• trascrizione indotta da stimolazione TCR

• Assemblaggio

– dimerizzazione STAT

• fosforilazione da parte di Jak

• Modificazioni covalenti

• Localizzazione


Attivazione di fattori trascrizione U

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013/2

014

Famiglia NFkB

• Primo sito di legame individuato in gene catena

leggera k

• Presente come dimero

– omodimero

– eterodimero

• rel homology domain (RHD)

• Membri di NFkB espressi in tutte le cellule

– RelB espresso in linfociti e poche altre cellule

• In cellule quiescenti dimeri NFkB sono legati a

inibitori di kb (IkB)


Famiglia c-Rel/NF-kB

RelA

c-Rel

RelB

P105/p50

P100/p52

NFkB1

NFkB2

p65


Famiglia I-kB

IkBa

BCL3

IkBb

IkBe


NF-kB Induttori dell’attivazione di NF-kB

TCR/CD28

TNFa, IL-1

LPS

Mitogeni

dsRNA

H2O2

Nitric Oxide

…

Geni inducibili da NF-kB

(coinvolti in risposte immunitarie)

TNFa, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8, IL-12…

IL2Ra

ICAM-1, VCAM-1, E-selectin…

MHC classe I e II

…

IkBa P P Ub Ub

IKK

p50 RelA

IkBa p50 RelA

IkBa P P

P P Ub Ub

fosforilazione

poliubiquitinazione

trascrizione p50 RelA

NLS

degradazione (proteasoma)

p50 RelA

Ub

Ub Ub Ub Ub Ub

RelA

IkBa

p50


• IKK, IkB Kinase

– IKKa, IKKb

• attività chinasica

– IKKg

• attività regolatoria

• NEMO

– NFkB essential

modulator


Cinetica di espressione in

linfociti stimolati da antigene


• Geni immediati

• c-fos, c-jun, nf-at, c-myc, nf-kb < 30’

• Geni precoci

• IFNg < 1h

• IL-3, IL-2Ra 1-2 h

• IL-6 4-6 h

• GM-CSF 20 h

• Geni tardivi

• VLA-4 4 g

• VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-5 7-14 g

Geni espressi dopo attivazione


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