Tissue engineering: Tissue engineering: formazione di lembi di formazione di lembi di cartilagine e cute, cartilagine e cute, utilizzando cellule utilizzando cellule staminali adulte e loro staminali adulte e loro applicazioni cliniche.applicazioni cliniche.Borgo Roma – 12/12/05Borgo Roma – 12/12/05

concetti generaliconcetti generaliconcetti generaliconcetti generali

I parteI parte

Uno dei maggiori obiettivi della medicina moderna è quello di ripristinare tessuti e/o organi danneggiati da malattie o traumi.

Nel XX secolo i trapianti di tessuti (osso, muscolo e cute) e di organi (rene, fegato, polmone) sono stati introdotti con successo nella pratica terapeutica grazie all’impiego di tecniche di anastomosi microvascolari e di idonea terapia immunosoppressiva. Nonostante ciò, molti sono i problemi legati al trapianto di organi, tra i quali i più significativi sono:

scarsa disponibilità di tessuti e d’organi idonei al trapianto e conseguenti lunghi tempi di attesa,

necessità di sottoporre il Paziente a terapia immuno-soppressiva per tutta la vita con conseguenti deficit immunitari,

rischio di tromboembolia nel caso in cui vengano utilizzati materiali sintetici (ad esempio per le valvole cardiache) e di emorragie conseguenti al trattamento anticoagulante,

necessità di sottoporre il paziente a più trapianti (ad esempio per rigetto tardivo o utilizzo in pazienti giovani di materiale sintetico non in grado di adeguarsi alla crescita corporea).

Ingegneria TessutaleIngegneria Tessutale

L’ingegneria tessutale è unL’ingegneria tessutale è un’ area multidisciplinare di area multidisciplinare di ricerca che ha come scopo la rigenerazione di ricerca che ha come scopo la rigenerazione di tessuti ed organi danneggiati del nostro organismo, tessuti ed organi danneggiati del nostro organismo, partendo dal presupposto che la quasi totalità delle partendo dal presupposto che la quasi totalità delle cellule animali possono essere coltivate in cellule animali possono essere coltivate in laboratorio. laboratorio.

Il principio generale è quello di prelevare cellule Il principio generale è quello di prelevare cellule staminali dallo stesso paziente bisognoso di staminali dallo stesso paziente bisognoso di trapianto, farle crescere e differenziare su un trapianto, farle crescere e differenziare su un supporto idoneo in modo da produrre il tessuto che supporto idoneo in modo da produrre il tessuto che deve essere sostituito.deve essere sostituito.

E’ molto importante che:

venga prodotta una quantità di cellule e di tessuto sufficiente per riparare il difetto,venga garantita una giusta differenziazione cellulare in modo da mantenere un corretto fenotipo,venga riprodotta una struttura tridimensionale identica al tessuto o organo da sostituire per garantire una corretta vascolarizzazione.

concetti generaliconcetti generaliconcetti generaliconcetti generali

II parte

Cellule staminaliCellule staminali

sono distinte in:

totipotentitotipotenti: potenzialmente capaci di originare qualsiasi tipo di tessuto. Possono creare un organismo completo.

pluripotentipluripotenti (multipotenti): possono sviluppare una vasta gamma di tessuti ( ad esempio le cellule progenitrici della linea ematopoietica), ma non sono in grado di sviluppare un organismo completo.

unipotentiunipotenti: sviluppano una sola linea cellulare.

Le cellule adibite alle colture possono provenire da prelievi:

autologhi: le cellule vengono prelevate dallo stesso Paziente che necessita del trapianto; omologhi: le cellule vengono prelevate da un individuo della stessa specie (vivente o cadavere);eterologhi: le cellule sono prelevate da un donatore di specie diversa dal ricevente, per esempio il maiale per l’uomo.

Le cellule che possono essere impiegate per la Le cellule che possono essere impiegate per la rigenerazione e riparazione tessutale possono rigenerazione e riparazione tessutale possono

provenire da:provenire da:

1- cellule staminali embrionali1- cellule staminali embrionali: si tratta di cellule totipotenti. La loro estrazione richiede la soppressione dell’embrione, che non supera mai i 14 giorni dalla sua fecondazione.

Vengono distinteVengono distinte::

Staminali embrionali

a- eterologhea- eterologhe: stadio di blastocisti – V giornata prima dell’impianto in utero; (embrioni sovrannu-merari rimasti inutilizzati nelle cliniche per la fertilità)

b- autologheautologhe: sono prelevate dopo che il nucleo di una cellula adulta viene trasferito in un uovo privato del suo nucleo. Possiedono lo stesso patrimonio genetico del donatore della cellula adulta e possono essere trapiantate senza rischi di rigetto (clonazione terapeutica)

Staminali fetalidall’ottava settimana al parto

sono cellule tendenzialmente pluripotenti.

derivano per più da materiale autoptico. Poco studiate.

Staminali da cordone ombelicalepossono essere sia autologhe che omologhe

scarse complicanze immunologiche

poco numerose

applicazioni sembrano ristrette solo alla produzione di cellule emopoietiche.

Staminali adulteprovvedono al mantenimento dei tessuti e alla loro riparazionePossono essere:

multipotenti : le piu’ studiate sono nel midollo osseo CD34+ emopoietiche cellule mesenchimali {osteoblasti, condrociti,

adipociti}

Staminali adulte unipotenti o mature: sviluppano una sola linea cellulare (cellule differenziate),

basso indice proliferativo

oggetto delle mie ricerche (cheratinociti, condrociti e fibroblasti).

Facilmente disponibiliFacilmente disponibili

Storia del donatoreStoria del donatore

Non problemi eticiNon problemi etici

Sorgente rinnovabileSorgente rinnovabile

AutotrapiantiAutotrapianti

PlasticitàPlasticità

è la capacità di una cellula staminale di produrre cellule

figlie che esprimono diversi fenotipi maturi. La plasticità consente ad una cellula staminale impiantata in tessuti già differenziati, di dare origine a tipi cellulari non presenti nel tessuto di origine della cellula staminale stessa. Così, ad esempio, una cellula staminale del midollo osseo può dare origine ad una cellula epatica, cardiaca o nervosa. Questa capacità (detta transdifferenziazione) è strettamente dipendente dalle influenze del microambiente in cui la cellula staminale si trova a crescere.

coltura di condrociticoltura di condrociti

III parteIII parte

Istologia - cartilagineIstologia - cartilagine

CondrocitiCondrociti

FibreFibre

Sostanza intercell.Sostanza intercell.

Sostanza Sostanza amorfaamorfa

IstologiaIstologia

Esistono tre tipi di cartilagine: Esistono tre tipi di cartilagine:

ialina, ialina,

elastica, elastica,

fibrosa. fibrosa.

Tutti i tre tipi sono costituiti da condrociti Tutti i tre tipi sono costituiti da condrociti da matrice extra-cellulare da matrice extra-cellulare

Cartilagine ialinaCartilagine ialina

E’ caratterizzata da fibre collagene E’ caratterizzata da fibre collagene prevalentemente di tipo II che formano un prevalentemente di tipo II che formano un delicato reticolo immerse in un’abbondante delicato reticolo immerse in un’abbondante matrice amorfa o sostanza fondamentale matrice amorfa o sostanza fondamentale ricca in complessi proteico – mucopolisac-ricca in complessi proteico – mucopolisac-caridici.caridici.

Istologia Istologia A. Pas (40x)A. Pas (40x)

I condrociti sono ac-I condrociti sono ac-colti in spazi scavati colti in spazi scavati detti lacunedetti lacune

Le lacune si conden-Le lacune si conden-sano a formare le sano a formare le “capsule”“capsule”

IstologiaIstologiaEmatosilina (10x)Ematosilina (10x)

Le cellule figlie Le cellule figlie formano un clone di formano un clone di elementi accostati tra elementi accostati tra loroloro

Tali cloni sono Tali cloni sono denominati gruppi denominati gruppi isogeniisogeni

Cartilagine fibrosaCartilagine fibrosa

E’ caratterizzata dalla presenza di grossi E’ caratterizzata dalla presenza di grossi fasci fibrosi di collagene in una scarsa fasci fibrosi di collagene in una scarsa matrice matrice

la cartilagine fibrosa è una forma di la cartilagine fibrosa è una forma di transizione tra il tessuto connettivo denso transizione tra il tessuto connettivo denso o compatto e la cartilagine o compatto e la cartilagine

Cartilagine elasticaCartilagine elastica

La cartilagine elastica presente ad esempio nel La cartilagine elastica presente ad esempio nel padiglione auricolare e nel naso è caratterizzata padiglione auricolare e nel naso è caratterizzata dalla presenza di fibre di elastina e da scarsa dalla presenza di fibre di elastina e da scarsa sostanza amorfa nella matrice extracellulare.sostanza amorfa nella matrice extracellulare.

Cartilagine ialinaCartilagine ialina

La principale funzione della La principale funzione della cartilagine ialina è quella di cartilagine ialina è quella di facilitare lo scorrimento delle facilitare lo scorrimento delle superfici articolari e di trasfe-superfici articolari e di trasfe-rire il peso al sottostante osso. rire il peso al sottostante osso.

Quando danneggiata, la Quando danneggiata, la cartilagine presenta scarsa ca-cartilagine presenta scarsa ca-pacità rigenerativa a causa pacità rigenerativa a causa dell’assenza di vascolarizza-dell’assenza di vascolarizza-zione e di innervazionezione e di innervazione

Danni cartilagineiDanni cartilaginei

della sola matricedella sola matrice

difetto parzialedifetto parziale

difetto a tutto spessoredifetto a tutto spessore

Il naturale processo di riparazione porta alla Il naturale processo di riparazione porta alla formazione di formazione di tessuto fibro-cartilagineotessuto fibro-cartilagineo che che non presenta le caratteristiche di resistenza e non presenta le caratteristiche di resistenza e deformabilità al carico tipiche della cartilagine deformabilità al carico tipiche della cartilagine ialina e che sono dovute alla sua particolare ialina e che sono dovute alla sua particolare composizione biochimicacomposizione biochimica

Nonostante numerosi protocolli terapeutici Nonostante numerosi protocolli terapeutici siano stati proposti ed applicati, i risultati siano stati proposti ed applicati, i risultati soprattutto a lungo termite sono risultati soprattutto a lungo termite sono risultati insoddisfacenti.insoddisfacenti.

–due obiettividue obiettivi

Il primo è quello di Il primo è quello di aumentare il numero di celluleaumentare il numero di cellule per per raggiungere la quantità necessaria per riparare il difetto raggiungere la quantità necessaria per riparare il difetto cartilagineo.cartilagineo.Il secondo è quello di ottenere il Il secondo è quello di ottenere il fenotipo correttofenotipo corretto

TRAMITE TRAMITE

Cellule in sospensioneCellule in sospensione

Cellule seminate su supportoCellule seminate su supporto

La presenza di una La presenza di una lesione cartilaginea viene lesione cartilaginea viene normal-mente riscontrata normal-mente riscontrata durante un esame artro-durante un esame artro-scopico. scopico.

Durante tale esame, si Durante tale esame, si può procedere ad un può procedere ad un prelievo di una piccola prelievo di una piccola quantità di cartilagine quantità di cartilagine sana in una zona non di sana in una zona non di

caricocarico..

La biopsia viene quindi inviata al La biopsia viene quindi inviata al laboratorio di colture cellulari, dove i laboratorio di colture cellulari, dove i condrociti si moltiplicano in accurate condrociti si moltiplicano in accurate condizioni di asepsi. Dopo circa 3 – 4 condizioni di asepsi. Dopo circa 3 – 4 settimane le cellule sono in numero settimane le cellule sono in numero sufficiente per essere re-impiantate; sufficiente per essere re-impiantate; trattandosi di cellule autologhe, non vi trattandosi di cellule autologhe, non vi sono rischi di infezioni o di reazioni di sono rischi di infezioni o di reazioni di rigetto.rigetto.

A questo punto si procede alla A questo punto si procede alla seconda parte dell’intervento: seconda parte dell’intervento: si incide l’articolazione, si si incide l’articolazione, si raschiano i bordi e si pulisce il raschiano i bordi e si pulisce il letto della lesione, rimuovendo letto della lesione, rimuovendo la cartilagine danneggiata così la cartilagine danneggiata così da rendere l’area atta a da rendere l’area atta a ricevere le cellule coltivatericevere le cellule coltivate

Una piccola incisione viene Una piccola incisione viene eseguita sulla tibia per eseguita sulla tibia per prelevare un lembo di periostio prelevare un lembo di periostio che ricopre la parte anteriore e che ricopre la parte anteriore e mediale della superficie ossea.mediale della superficie ossea.

Il lembo viene quindi suturato Il lembo viene quindi suturato sopra la lesione ed il sopra la lesione ed il ricettacolo così creato potrà ricettacolo così creato potrà ricevere i condrociti coltivati. ricevere i condrociti coltivati. Le cellule aderendo all’osso Le cellule aderendo all’osso sottostante, rigenereranno gra-sottostante, rigenereranno gra-dualmente un nuovo tessuto dualmente un nuovo tessuto cartilagineo che nel tempo cartilagineo che nel tempo assumerà caratteristiche simili assumerà caratteristiche simili alla cartilagine originaria.alla cartilagine originaria.

Tuttavia, dopo i primi risultati incoraggianti Tuttavia, dopo i primi risultati incoraggianti tale procedura ha mostrato dei difetti:tale procedura ha mostrato dei difetti:

metodica invasiva metodica invasiva

risultati non sempre soddisfacenti (Breinan risultati non sempre soddisfacenti (Breinan – 1997).– 1997).

Uso di supporti - scaffoldsUso di supporti - scaffolds

L’impiego di componenti cellulari supportati da scaffolds adeguatiL’impiego di componenti cellulari supportati da scaffolds adeguati, , potrebbe condurre a risultati positivi nella riparazione del tessuto potrebbe condurre a risultati positivi nella riparazione del tessuto articolare, consentendo un miglioramento della tecnica chirurgica. articolare, consentendo un miglioramento della tecnica chirurgica.

L’impiego di scaffolds consente infatti:L’impiego di scaffolds consente infatti:

di migliorare l’attecchimento, la riproduzione e la differenziazione di migliorare l’attecchimento, la riproduzione e la differenziazione cellulare, cellulare,

di trattenere “fisicamente” le cellule nella zona da riparare. di trattenere “fisicamente” le cellule nella zona da riparare.

devono possedere le seguenti caratteristiche:

tollerabilità: devono essere immunologicamente inerti,

impalcatura provvisoria: dopo integrazione il biomateriale deve essere sostituito dal tessuto originario,

contenuto informativo: devono comunicare e scambiare segnali con le cellule ospite.

Le matrici più idonee per la crescita di condrociti e di cheratinociti

autologhi, sono di tipo naturale e sono

collagene e derivati

fibrina anche autologa

acido ialuronico

cellulosa

Grande interesse viene rivolto al collagene; questa molecola si è dimostrata in grado di ricostruire un epitelio con caratteristiche morfo-funzionali nettamente superiori rispetto alle altre matrici.

Isolare i condrociti umani Isolare i condrociti umani autologhi per la ricostruzione della autologhi per la ricostruzione della cartilagine articolarecartilagine articolare su supporto su supporto di collagenedi collagene

Isolamento dei condrocitiIsolamento dei condrociti

Asportazione di cartilagine dal condilo Asportazione di cartilagine dal condilo femorale di un Paziente di sesso maschile femorale di un Paziente di sesso maschile di anni 63 di anni 63

Frammenti di cartilagine trattati con tre Frammenti di cartilagine trattati con tre enzimi ( ialuronidasi, pronasi, collagenasi) enzimi ( ialuronidasi, pronasi, collagenasi) per togliere la matrice extracellulareper togliere la matrice extracellulare

RisultatiRisultati

L’estrazione dei con-L’estrazione dei con-drociti ottenuta nel drociti ottenuta nel nostro esperimento nostro esperimento da frammenti di da frammenti di cartilagine ha per-cartilagine ha per-messo di ottenere 2 messo di ottenere 2 milioni di cellule, milioni di cellule, seminate in seguito in seminate in seguito in fiasca F 75fiasca F 75

Microscopio a contrasto di Microscopio a contrasto di fasefase

Condrociti dopo 48 ore - 20 xCondrociti dopo 48 ore - 20 x

40 x40 x

40 x40 x

Coltura primaria di condrociti prima Coltura primaria di condrociti prima settimana - 10 xsettimana - 10 x

Coltura primaria di condrociti prima Coltura primaria di condrociti prima settimana - 20 xsettimana - 20 x

Coltura primaria in subconfluenza inizio Coltura primaria in subconfluenza inizio della seconda settimana - 20 xdella seconda settimana - 20 x

Coltura primaria in subconfluenza inizio Coltura primaria in subconfluenza inizio della seconda settimana - 40 xdella seconda settimana - 40 x

Coltura primaria in confluenza alla fine Coltura primaria in confluenza alla fine della seconda settimanadella seconda settimana

Tripsinizzazione dalla fiasca e Tripsinizzazione dalla fiasca e risemina su supportorisemina su supporto

III settimana - inizioIII settimana - inizioEmatossilina - eosina - 10 xEmatossilina - eosina - 10 x

ICH - vimentinaICH - vimentina

ICH - vimentinaICH - vimentina

III settimanaIII settimana - inizio- inizio Ematossilina - eosina - 20 xEmatossilina - eosina - 20 x

III settimanaIII settimana - inizio- inizio Ematossilina - eosina Ematossilina - eosina - 40 x- 40 x

III settimanaIII settimana - fine- fineEmatossilina - eosina Ematossilina - eosina - 20 x- 20 x

IV settimanaIV settimana - inizio- inizioEmatossilina eosina - 10 xEmatossilina eosina - 10 x

IV settimanaIV settimana - inizio- inizioEmatossilina eosina - 20 xEmatossilina eosina - 20 x

IV settimanaIV settimana - fine- fineEmatossilina eosina - 20 xEmatossilina eosina - 20 x

IV settimanaIV settimana - inizio- inizioEmatossilina eosina - 40 xEmatossilina eosina - 40 x

IV settimanaIV settimana -- istochimicaistochimica Alcian PASAlcian PAS - 40 x- 40 x

IV settimanaIV settimana -- istochimicaistochimica Alcian PASAlcian PAS - 40 x- 40 x

ICH: collagene IIICH: collagene II

Marker caratteristico Marker caratteristico della cartilagine ialinadella cartilagine ialina

Abbiamo verificato la possibilità di crescita con Abbiamo verificato la possibilità di crescita con corretta differenziazione dei condrociti su corretta differenziazione dei condrociti su biomateriali (spugnette di collagene di tipo I) biomateriali (spugnette di collagene di tipo I) questi possono essere utilizzati per reimpianto questi possono essere utilizzati per reimpianto nella sede lesionatanella sede lesionata