In-line Tissue

Engineeringapproach

Biella 5 giugno 2009

Fabrizio Raimondi – Stefano Pagnutti

La perdita o l’insufficienza funzionale di un tessutoo di un organo rappresentano uno dei problemi

più invalidanti, frequenti e costosi nell’ambito della sanità.

Il problema non è esclusivamente limitatoalla mancanza di organi in toto - fegato, rene, cuore, pancreas -

ma coinvolge anche deficit tissutali localizzati e limitati a parti di non vitale importanza

che comunque determinano una scarsa qualità della vita.

Mentre la perdita di un organo viene necessariamente compensata con un trapianto,

nel caso di perdite di sostanzail chirurgo deve ingegnarsi su come ricostruire,

utilizzando i tessuti residuio con ciò che viene messo a disposizione

dalle industrie dei biomateriali,la struttura e la funzione dei tessuti danneggiati.

PASSATO

Biomateriali improvvisati e tentativi di riparazionesono antichi come il desiderio e la necessità dell’uomo di sostituire parti del corpo difettose per migliorare la qualità della vita.

NASCE LA MEDICINA

Papiro di Edwin Smith (1850)48 casi clinici: 27 traumi cranici; 6 lesioni della gola e del capo; 2 della clavicola; 3 delle braccia; 8 dello sterno; 1 della spalla;1 della colonna vertebrale.

1700 a.C. The Edwin Smith Surgical PapyrusLungo 4.68 metri e largo 33 cm, fu scritto sulla base

di testi più antichi di circa 1000 anni

2600 a.C. Sacerdote, ufficiale, costruttore e architetto visse alla corte del faraone Djoser

(III Dinastia). Quasi universalmente riconosciuto come

il “Padre della Medicina”

Alluce in cuoio e legno Sacerdotessa di Tebe (1.000 a.C.)

(Museo del Cairo)

Chiodo di 23 cmin ferro inserito nel ginocchio. Mummia di Usermontu(656-525 a. C.) (Museo di San Josè, CA)

Canino legato con filo dìoro a due incisivi(Cairo)

Incisivo artificiale(tomba etrusca)

Protesi dentaria dei Fenici costituita da conchiglie legate con filo d’oro (V-VI sec. a.C.)

LE PRIME PROTESI

Mandibola trovata in Hondurasnel 1931, presenta tre frammentidi conchiglia in luogo degli incisivi inferiori.Databile intorno al 600 d.C.

MIRACOLI

“El milagro de Calanda”Atti notarili e processuali testimoniano

lo strano reimpianto di gamba di Miguel Juan Pellicer nel 1640 a Calanda (Bassa

Aragona, Spagna)

I santi Cosma e Damiano attorno al 300 avrebbero attaccato la gamba di un moro ad un cristiano.

Nel 1668 il medico olandese Job Van Meekeren esegue il primo innesto osseo eterologo innestando un frammento di cranio di cane in un difetto craniale di un soldato rimasto ferito.Il soldato venne scomunicato. Per questo chiese di farsi togliere l’innesto, ma non fu possibile perché risultò completamente integrato.(De Boer 1988)

IL PRIMO INNESTO ETEROLOGO

Antoni Van LeeuwenhoeK nel 1674 descrive per la prima volta la struttura ossea relativamente a quelli che saranno poi chiamati canali Haversiani.Si cominciano ad evidenziare concetti come “callo osseo”, “impianto” e “riassorbimento”.

Nel 1743 Duhamel pubblica i risultati dei suoi esperimenti su animale dove suggerisce il ruolo importante del periostio nella neo-osteogenesi.(De Boer 1988, Glicenstein 2000)

LA STRUTTURA DELL’OSSO

INNESTO AUTOLOGO E OMOLOGO

Leopold Ollier studia il fenomeno della

rigenerazione ossea e pubblica nel 1861 il

“traité de la régénération des os” documento in cui

compare per la prima volta il termine “greffe osseuse”:

innesto osseo

Il primo innesto autologo Germania 1820: Philips Von Walter chiude il foro a seguito della trapanazione del cranio, con la bratta precedentemente asportata.

Il chirurgo scozzese William Mac Ewen nel

1880 innesta un segmento di tibia da

donatore in un difetto omerale di un ragazzo.

PRESENTE E FUTURO… PROSSIMO

Riparazione o sostituzione di organi e di tessuti rimossi

“Riparare” “Rigenerare”

• Ripristino di strutture

• Attività biochimica

• Proprietà biomeccaniche• Funzione

L’ingegneria dei tessuti è un “campo multidisciplinare”in cui si fondono biologia cellulare, ingegneria, scienza dei materiali e chirurgia, allo scopo di costruire nuovi tessuti funzionali, mediante

la combinazione di:

TISSUE ENGINEERING

ScaffoldCellule

autologhe

Fattoridi crescita

IngegneriaTissutale

Applicazioneclinica

Solo scaffold

Scaffold + cellule

Scaffold + fattori di crescita

Scaffold + cellule + fattori di crescita

Biomaterials Research Group 2004

host tissue

scaffold

“…the science of persuading the body to regenerate or repair tissues that fail to regenerate or heal spontaneously”

C. M. Agrawal

SEMPLICEMENTE

Invasione di vasi

sanguigni

Cellule aderiscono,proliferano edifferenziano

Richiamoe penetrazione

cellulare

Cellule sintetizzanoe depositano matriceextracellulare (ECM)

Coaguloematico

Adesione diproteine, GFs,…

Cellule al centroMUOIONO

Fallimentodello scaffold

Poririempitidi ECM

Nutrienti bloccati, cataboliti intrappolati

Scaffoldimpiantato

osso

?

BASTA IL SOLO SCAFFOLD?

SOLOpiccoli difetti

< 2-3mm

Tessuto osseodanneggiato

Scaffold

Cellule

Fattoridi crescita TissueTissue

EngineeringEngineering

alternativa

In-line TISSUE ENGINEERING

TissueTissueEngineeringEngineering

Utilizzare i requisiti e i principi dell’ingegneria tissutale, direttamente in sala operatoria

Necessità di un Necessità di un BIOMATERIALEBIOMATERIALE

• Fornisce un’impalcatura tri-dimensionale per lo sviluppo delle linee Fornisce un’impalcatura tri-dimensionale per lo sviluppo delle linee cellulari cellulari e la deposizione di matrice extracellularee la deposizione di matrice extracellulare

• Svolge un’importante funzione di interazione biologica: comunicazione e Svolge un’importante funzione di interazione biologica: comunicazione e scambio di segnali con il tessuto circostantescambio di segnali con il tessuto circostante

Controllo della Controllo della strutturastruttura e della e della funzionefunzione

del tessuto ingegnerizzatodel tessuto ingegnerizzato

1. LO SCAFFOLD

• biocompatibile• favorire

- adesione - migrazione - proliferazione - differenziamento cellulare - sintesi di matrice extracellulare (ECM)

- invasione vascolare• biodegradabile

BIOMATERIALE IDEALE

La capacità di una cellula di riconoscere ed interagire con il substrato rappresenta il primo indispensabile passo, senza il

quale processi come proliferazione, migrazione e differenziamento cellulare non sarebbero possibili.

Nella progettazione di materiali per l’ingegneria dei tessuti, la comprensione dei meccanismi che regolano tale

interazione sono di fondamentale importanza.

INTERAZIONE CELLULA-BIOMATERIALE

Uno dei requisiti fondamentali di un biomateriale per l’ingegneria dei tessuti è la capacità di

promuovere efficientemente l’adesione delle cellule da cui verrà colonizzato.

Tale adesione prevede una fase precoce in cui la cellula riconosce il substrato.

L’adesione cellulare ad un biomateriale avviene tramite un meccanismo specifico, mediato da proteine di membrana dette integrine.

RICONOSCIMENTO E ADESIONE

Le integrine trasmettono il segnale dalla superficie cellulare alla fitta rete di filamenti citoscheletrici che costituiscono

l’impalcatura della cellula. Dall’interazione delle integrine con la matrice si originano cascate di segnali che determinano

la riorganizzazione del citoscheletro di actina ed il cambiamento della morfologia cellulare.

La cellula, all’inizio tondeggiante (a), assume una forma distesa (b).

Innesto omologo

Innesto eterologo

Innesto di sintesi

SicurezzaAspetti medico-legali

BiocompatibilitàImmunogenicitàQualità

PorositàDegradabilità

QUALE SCAFFOLD SCEGLIERE

Gli innesti eterologhi prodotti da Bioteck con un sistema esclusivo di deantigenazione enzimatica a 37° C sono sicuri, totalmente biocompatibili e con la componente collagenica preservata

PURA MATRICE BIOLOGICA

Un sistema di demineralizzazione parziale, consente inoltre di avere innesti dalle caratteristiche di

flessibilità e plasticità uniche.La demineralizzazione espone maggiormente la

matrice collagene esaltandone così le caratteristiche biologiche.

INNESTI FLEX

Fattori di crescita Fattori di crescita (growth factors, GFs):(growth factors, GFs):

sono polipeptidi che agiscono legandosi generalmente a recettori ad attività tirosina-chinasica, inducendo una gamma complessa

di risposte che influenzano il destino della cellula bersaglio. Possono avere un ruolo mitogenico (ad es. bFGF sui condrociti)

oppure trofico-differenziativo (ad es. BMP-1 sulle cellule mesenchimali e pre-osteoblasti).

2. I FATTORI DI CRESCITA

• Autologhi Piastrinici PDGF; TGF-ß1, ß2; IGF I-II; EGF; FGF; VEGF

• Omologhi innesti a base di DBM/BMP

• Eterologhi E.M.D – Emdogain® Gel BIORA

Colloss®; Targobone® Biomet Biologics.

• Ricombinanti rhPDGF Regranex® J&J

rhBMP7 Osigraft® Stryker Biotech

rhBMP2 InductOs® Medtronic

COSA OFFRE IL MERCATO

Staminali (nell’embrione e tessuti adulti)

Differenziate (nei tessuti adulti)

3. LA COMPONENTE CELLULARE

Le cellule staminali (stem cells, SC) sono cellule non specializzate a uno stadio precoce di sviluppo.

Hanno la caratteristica di riprodursi a lungo senza differenziarsi (auto-rinnovamento) e di dare origine a cellule progenitrici

dalle quali derivano linee cellulari differenziate (muscolari, ematiche, nervose, ecc...).

Possono dividersi e differenziarsi in un largo numero di tipi cellulari che producono i tessuti e gli organi del corpo.

CELLULE STAMINALI

Le prospettive terapeutiche aperte dalle SC risultano straordinarie: un primo campo d’applicazione riguarderà la cura di molte patologie gravi (tumori,

malattie ereditarie, malattie neuro-degenerative), un secondo campo d’applicazione riguarderà l’impianto di SC per rigenerare cellule e tessuti

evitando così i trapianti di organi e i problemi connessi di scarsità dei donatori e di rischio di rigetto per incompatibilità donatore/ricevente

Le cellule staminali sono cellule non specializzate in grado di dividersi dando origine contemporaneamente • ad una cellula staminale (uguale alla cellula madre)• ad una cellula precursore di una progenie cellulare

che alla fine darà a sua volta origine a cellule terminalmente differenziate (mature).

Tipi di CS Dove si trovano Potenzialità

Cellule costituenti la morula

Possono originare tutti i tessuti (formazione di un intero

organismo):hanno la capacità di differenziarsi in tutte le linee cellulari necessarie a formare

l’embrione

Nella massa cellulare contenuta all’interno della blastocisti

Hanno la potenzialità differenziarsi in qualsivoglia cellula di un animale

adulto, ma non di dare origine ad un embrione

All’interno di tessuti fetali e adulti differenziati (es. cordone

ombelicale, midollo osseo, sangue, fegato, sistema nervoso)

Si differenziano in specifici tipi cellulari (ad es. cellule

mesenchimali). Hanno la proprietà di moltiplicarsi e mantenersi in

coltura, ma sono prive della capacità di rinnovarsi in modo

illimitato

All’interno di tessuti adulti differenziati – cellule tessuto-specifiche (es. nell’intestino)

Possono dar luogo soltanto ad un tipo cellulare

StaminaliStaminali embrionaliembrionali

TotipotentiTotipotenti

StaminaliStaminalifetali / adultefetali / adulte

UnipotentiUnipotenti

PluripotentiPluripotenti

MultipotentiMultipotenti

StaminaliStaminaliadulteadulte

• Presenti nei tessuti adulti• Cellule multipotenti che possono essere influenzate dai

fattori di crescita (GFs) per differenziare in varie tipologie cellulari mature

• Ad es. cellule staminali mesenchimali (MSCs) presenti nello stroma del midollo osseo

CELLULE STAMINALI ADULTE

Il midollo osseo è attualmente considerato la fonte più abbondante e facilmente disponibile di cellule progenitrici staminalicellule progenitrici staminali aventi la capacità di auto-rinnovarsi,

proliferare, migrare e differenziare in varie tipologie cellulari mature.In aggiunta alle cellule staminali ematopoietiche, il midollo osseo contiene cellule

staminali non-emopoietiche mesenchimali e endoteliali, che costituiscono tre “compartimenti staminali” altamente integrati tra loro.

CELLULE STAMINALI NEL MIDOLLO OSSEO

MSCs:CONCENTRAZIONE MIDOLLARE FISIOLOGICA

In condizioni fisiologiche, il midollo osseo di un uomo adultocontiene mediamente 1 MSC / 250.000 cellule midollari.Questo numero è strettamente correlato all’età:

Caplan AI. Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics. Tissue Eng. 2005 Jul-Aug;11(7-8):1198-211. Review

MSCs:CONCENTRAZIONE EFFICACE MINIMA

• Muschler GF, Matsukura Y, Nitto H, Boehm CA, Valdevit AD, Kambic HE, Davrs WJ, Easley KA, Powell KA. Selective retention of bone marrow-derived cells to enhance spinal fusion.Clin Orthop Relat Res. 2005 Mar;(432):242-51.• Ph. Hernigou, MD, A. Poignard, MD, F. Beaujean, MD and H. Rouard, MD . Percutaneous Autologous Bone-Marrow Grafting for Nonunions. Influence of the Number and Concentration of Progenitor Cells. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 2005;87:1430-1437.

E’ stato dimostrato da vari autori che il midollo osseo in toto contiene una quantità di cellule osteoprogenitrici non sufficiente per garantire una rigenerazione ossea efficace. Per avere un adeguato stimolo osteogenico occorre concentrare il midollo 3-4X.

OK3-4X

AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DI MSCs

Il sistema più efficace per concentrare e quindi aumentare il rapporto volume/quantità di MSCs

dell’aspirato midollare:

CENTRIFUGAZIONE

SISTEMA DI CONCENTRAZIONE

Porta ad una elevataconcentrazione di cellule midollari in sospensione, quindi iniettabili

IL SISTEMA MARROW STIM

Prima Dopo

Studi hanno dimostrato che la maggior concentrazione di cellule si ottiene aspirando 2 ml di midollo per sito di prelievo.

Aspiration to obtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: the influence of aspiration volume. (Muschler GF, Boem C, Easley K. 1997 - J. Bone Joint Surg. Am. 79:1699-1709)

VALORI DI CONCENTRAZIONE

• 80% - Recupero della frazione totale di Cellule Nucleate (TNC)

• 6,7x - Concentrazione di TNC rispetto a quella fisiologica

• 66% - Recupero della frazione totale di Cellule Mononucleate (MNC)

• 6,1x - Concentrazione di MNC

GRAZIE