TISSUE ENGINEERINGTISSUE ENGINEERING

COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI

SU SUPPORTO DI PLASMASU SUPPORTO DI PLASMA

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PARMA

Facoltà di Scienze MM. FF. NN.

Corso di Laurea Specialistica in Biologia ed Applicazioni BiomedicheCorso di Laurea Specialistica in Biologia ed Applicazioni Biomediche

RelatoriChiar. ma Prof. ssa Renata Franchi Gazzola

CorrelatoriChiar. mo Dott. Stefano Negri

Laureanda Elena Alessi

Anno Accademico 2007/2008

TISSUE ENGINEERINGTISSUE ENGINEERING

Area multidisciplinare di ricerca che ha come scopo la

rigenerazione di tessuti ed organi danneggiati del nostro

organismo

PRINCIPIPRINCIPI

Prelevare le cellule staminali del Paziente

Far crescere e differenziare le cellule su un supporto biologico

Sottoporre il Paziente al trapianto

devono possedere le seguenti caratteristiche:

tollerabilità: devono essere immunologicamente inerti (biocompatibili)

impalcatura provvisoria: dopo integrazione il biomateriale deve essere sostituito dal tessuto originario (biodegradabili)

contenuto informativo: devono comunicare e scambiare segnali con le cellule ospite

BIOMATERIALIBIOMATERIALI

LE MATRICI PIU’ IDONEE..LE MATRICI PIU’ IDONEE..

Per la crescita e differenziazione di cheratinociti e fibroblasti

autologhi, le matrici più idonee, sono di tipo naturale e si

suddividono in:

- collagene

- agarosio

- acido ialuronico

- colla di fibrina

- cellulosa

Grande interesse è rivolto verso l’utilizzo del plasma umano

come supporto di crescita per cheratinociti e fibroblasti

Isolare cheratinociti e fibroblasti umani,

utilizzando il plasma autologo per

formare lembi di cute con caratteristiche

morfo-funzionali e immunoistochimiche

simili all’epidermide normale

SCOPO TESISCOPO TESI

CASO CLINICOCASO CLINICO

V. P. di anni 65, affetta da ulcera vascolare venosa circonferenziale alla gamba sinistra.

MATERIALI E METODIMATERIALI E METODI

Estrazione e amplificazione di cheratinociti e fibroblasti

umani autologhi, prelevati da un’unica biopsia

Preparazione del supporto di plasma

Aggiunta di fibroblasti e cheratinociti a diverse densità

PREPARAZIONE SUPPORTO DI PLASMAPREPARAZIONE SUPPORTO DI PLASMA

ACIDO TRANEXAMICO

PLASMA

SOLUZIONE FISIOLOGICA

CLORURO DI CALCIO

FIBROBLASTI+

+ CHERATINOCITI

30’, 37°C, 5% CO2

CONSISTENZA DEL SUPPORTOCONSISTENZA DEL SUPPORTO

PLASMA AC. TRANEXAMICO NaCl CaCl2

QUANTITÀ DI SOLUZIONE

PER POZZETTO

5 ml 5 mg 6,5 ml 1 ml, 1% 1 ml 2 ml

5 ml 5 mg 6,5 ml 1 ml, 1,5% 1 ml 2 ml

5 ml 6 mg 6,5 ml 1 ml, 1% 1 ml 2 ml

6 ml 5 mg 5,5 ml 1 ml, 1% 1 ml 2 ml

5 ml 6 mg 6,5 ml 1 ml, 1,5% 1 ml 2 ml

5X104/cm2

FU5X104/cm2

KE

5X104/cm2

FU10X104/cm2

KE

5X104/cm2

FU15X104/cm2

KE

10X104/cm2

FU5X104/cm2

KE

10X104/cm2

FU10X104/cm2

KE

10X104/cm2

FU15X104/cm2

KE

15X104/cm2

FU5X104/cm2

KE

15X104/cm2

FU10X104/cm2

KE

15X104/cm2

FU15X104/cm2

KE

FIBROBLASTI 5X104/cm2 10X104/cm2 15X104/cm2

CHERATINOCITI 5X104/cm2 10X104/cm2 15X104/cm2

DENSITA’ DI SEMINADENSITA’ DI SEMINA

t0 FIBROBLASTI CHERATINOCITI

t1 (dopo 1 giorno)  - CHERATINOCITI

t2 (dopo 4 giorni)  - CHERATINOCITI

t3 (dopo 8 giorni)  - CHERATINOCITI

MODALITA’ DI SEMINAMODALITA’ DI SEMINA

PRELIEVOPRELIEVO

i frammenti di cute artificiale sono stati prelevati per:

Valutazione della consistenza ottimale

Valutazione della densità cellulare ottimale

Colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche

4 giorni 8 giorni 13 giorni

COLTURA PRIMARIACOLTURA PRIMARIA

microscopio a contrasto di fase dopo 8 giorni (400X)

cheratinociti

fibroblasti 3T3

COLTURA SECONDARIACOLTURA SECONDARIA

microscopio a contrasto di fase dopo 12 giorni (400X)

cheratinociti

cheratinociti

cheratinociti

cheratinociti

cheratinociti

fibroblasti

FIBROBLASTIFIBROBLASTI

microscopio a contrasto di fase (400X)

Derma

Fibroblasti

FIBROBLASTIFIBROBLASTI

microscopio a contrasto di fase (400X)

microscopio a contrasto di fase dopo 3 giorni (200X)

FIBROBLASTI ALL’INTERNO DEL SUPPORTO DI PLASMAFIBROBLASTI ALL’INTERNO DEL SUPPORTO DI PLASMA

cheratinociti

fibroblasti

microscopio a contrasto di fase dopo 4 giorni (200X)

Ematossilina-Eosina (400X)

FRAMMENTO DI CUTE ARTIFICIALEFRAMMENTO DI CUTE ARTIFICIALE

Ematossilina-Eosina (400X)

FIBROBLASTI FIBROBLASTI

Ematossilina-Eosina (400X)

CHERATINOCITICHERATINOCITI

immunoistochimica: vimentina (400X)

FIBROBLASTIFIBROBLASTI

CHERATINOCITICHERATINOCITI

immunoistochimica: citocheratina AE1 (400X)

MEMBRANA BASALEMEMBRANA BASALE

immunoistochimica: collageno IV

immunoistochimica: Mib1

APPLICAZIONE DELLA METODICA SULLA PAZIENTEAPPLICAZIONE DELLA METODICA SULLA PAZIENTE

INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALEINNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE

prima...

INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALEINNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE

..dopo

SVANTAGGISVANTAGGI VANTAGGIVANTAGGI

 Supporto fragile e poco

maneggevole

 Permette di ottenere

innesti del tutto

autologhi

 

 Facile da preparare

 Basso costo

CONCLUSIONICONCLUSIONI