Spettroscopia Raman e microscopia AFM di...

Spettroscopia Spettroscopia RamanRaman e microscopia AFM e microscopia AFM

di di cheratinociticheratinociti umani: umani:

modificazioni cellulari dopo esposizione a modificazioni cellulari dopo esposizione a

basse dosi di agenti basse dosi di agenti xenobioticixenobiotici

G. Perna, M. Lasalvia, V. Capozzi

Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale,

Università degli Studi di Foggia, Viale L. Pinto - 71122 Foggia

XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012

Applied Physics Laboratory

University of Foggia

OutlineOutline


• Sostanze xenobiotiche: HgCl2 e pesticidi

• Modello cellulare: cheratinociti

• Metodi di indagine: microspettroscopia Raman e

microscopia AFM

• Risultati su cellule fissate e viventi esposte a HgCl2

• Risultati su cellule fissate esposte a Chlorphyriphos e

Deltametrina

• Risultati preliminari curve forza-distanza su cellule esposte

a prodotto commerciale

• Conclusioni

Sostanze xenobioticheSostanze xenobiotiche

composti che non vengono prodotti dal metabolismo degli

organismi viventi

Sono sintetizzati dall’industria chimica:

• per la loro utilità nei processi produttivi industriali (catalizzatori,

coloranti, polimeri, etc.)

• per incrementare la produzione agricola (pesticidi, fitofarmaci,

concimi)

• per attività domestiche


Composti a base di mercurio (es. HgClComposti a base di mercurio (es. HgCl22))


HgCl2: presente in insetticidi, antisettici e disinfettanti

PesticidiPesticidi

Prodotti chimici in grado di controllare, limitare, respingere o

distruggere microrganismi considerati come nocivi

Organofosfati: neutralizzano un enzima (acetilcolinaesterasi)

fondamentale per il corretto funzionamento degli stimoli nervosi.

Piretroidi: agiscono sui canali del sodio delle membrane nervose.


Esposizione a sostanze xenobiotiche: inalazioneEsposizione a sostanze xenobiotiche: inalazione


Insediamento urbano e industriale Campi coltivati

Atmosfera Atmosfera

Insediamento urbano e industriale

Atmosfera

Emissione Ricaduta con la pioggia

Acque dolci e salate

Suolo

Campi coltivati

Trasformazione

Animali d’allevamento

Distribuzione e

vendita

Acq

ua

Consumatore


Esposizione a sostanze xenobiotiche: ingestioneEsposizione a sostanze xenobiotiche: ingestione

Esposizione a sostanze xenobiotiche: contattoEsposizione a sostanze xenobiotiche: contatto


Insediamento urbano e industriale Campi coltivati

Atmosfera Atmosfera

Esposizione a sostanze xenobiotiche: limitiEsposizione a sostanze xenobiotiche: limiti

Per ciascuna sostanza esistono limiti di esposizione (dose

giornaliera accettabile: 0.01 mgKgpeso corporeo -1giorno-1)

Esposizione a basse concentrazioni (≤ 1 ordine di grandezza

rispetto alla concentrazione citotossica)


Effetti tossici hanno origine da alterazioni a livello cellulare →

strutture e funzioni cellulari possono essere alterate da

modificazioni chimiche e morfologiche di componenti cellulari →

analisi su cellule in vitro

Modello cellulare: Modello cellulare: cheratinociticheratinociti

Cheratinociti umani normali (linea primaria HUKE)


• Cellule in coltura in EpiLife

medium a 37 C e 5% di CO2

• Esposizione per 24 h a diverse

concentrazioni di xenobiotico

Test colorimetrici Trypan blue MTT

Concentrazione citotossica: provoca la morte di più del 50% del

campione cellulare


Cellule viventi o cellule fissate?Cellule viventi o cellule fissate?

Fissazione

Immersione in soluzione di paraformaldeide

Formazione legami con proteine sulla membrana

Cellula e componenti cellulari mantengono la loro morfologia

anche in assenza delle condizioni chimico fisiche vitali

Effetti fissazione:

• arresto dei processi vitali cellulari

• preservazione dei componenti cellulari contro processi di

disgregazione.


Metodi di indagine: microMetodi di indagine: micro--spettroscopia Ramanspettroscopia Raman

ground state

excited state

virtual state

ƒpump

Raman

Stokes

Q.Matthews et al., Physics in Medicine

and Biology 56, 19-38 (2011)


Metodi di indagine: microscopia AFMMetodi di indagine: microscopia AFM

T. Puntheeranurak et al., Nature Protocols

6, 1443-1452 (2011)


Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: Raman cellule fissate: Raman cellule fissate ~10-4M concentrazione citotossica

1206 cm-1: C-C6H5 Tyr, Phe, Trp;

1232 cm-1: amide III ( sheet);

1262 cm-1: amide III ( helix);

1287 cm-1 T, A (n.a.);

1302 cm-1: CH2 twisting (l);

1338 cm-1: CH2 twisting (p) + A, G (n.a.);

1379 cm-1: A, G, T (n.a.).

G. Perna et al., Journal Molecular

Structure 834, 182-187 (2007)

Raman shift (cm-1)

1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

Inte

nsity (

a.u

.)

control

treated with 10-6

M HgCl2

treated with 10-4

M HgCl2


Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule fissate: AFM cellule fissate

controllo 10-4 M HgCl2 10-6 M HgCl2

G. Perna et al., Journal Molecular

Structure 834, 182-187 (2007)


Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule viventi: AFM cellule viventi

Cellula prima dell’esposizione a 10-7 M HgCl2

x(m)0 5 10 15 20 25 30 35

y(

m)

0

1

2

3

4

line 1


Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule viventi: AFM cellule viventi Cellula 15 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl2

x(m)0 5 10 15 20 25 30

y(

m)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

line 1

line 2



x(m)0 10 20 30 40

y(

m)

0.0

0.6

1.2

1.8

line 1



M. Lasalvia et al., Journal of

Microscopy 243, 40-46 (2011)

(a)

(b)

x(m)0 10 20 30 40 50

y(

m)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

line 1


Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule viventi: AFM cellule viventi

Relazione diretta tra morfologia cellulare ed HgCl2 sui cheratinociti ad una concentrazione di 100 nM

100 nM 1 μM 10 μM 100 μM 1 mM

citotossica

non citotossica

ALTERAZIONE

MORFOLOGIA

CELLULARE


Esposizione a pesticidi: vitalità cellulareEsposizione a pesticidi: vitalità cellulare

Chlorphyriphos

(organofosfato)

Deltametrina

(piretroide)

deltamethrin concentration (M)

HU

KE

ce

lls (

%)

0

20

40

60

80

100alive cells

dead cells

control 10-6 10-5 10-4 2.5x10-4

chlorpyriphos concentration (M)

HU

KE

ce

lls (

%)

0

20

40

60

80

100alive cells

dead cells

control 10-6 10-5 10-4 10-3

Concentrazione citotossica (24h)

~10-3M (Chlorphyriphos)

~2.5x10-4 M (Deltametrina)


Esposizione a pesticidi: microspettroscopia RamanEsposizione a pesticidi: microspettroscopia Raman

Cellule esposte a Chlorphyriphos

G. Perna et al., Applied Physics

Letters 95 (8), 083701 (2009)

Raman shift (cm-1)

1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

inte

nsity (

a.u

.)

0.0

0.4

0.8

1.2

control

10-6

M

10-5

M

pro

tein

pro

tein

lipid

+ p

rote

in

pro

tein

+ D

NA

DN

A

pro

tein


Esposizione a pesticidi: microspettroscopia RamanEsposizione a pesticidi: microspettroscopia Raman

Cellule esposte a Deltametrina

Raman wavenumber (cm-1

)

1000 1200 1400 1600 1800

Ram

an Inte

nsity (

a.u

.)

0.0

0.4

0.8

1.2

control

10-6 M

10-5 Mp

rote

in

pro

tein pro

tein

+D

NA

pro

tein

DN

A

lip

id+

pro

tein

G. Perna et al., Vibrational

Spectroscopy 57, 55-60 (2011)


Deconvoluzione con funzioni Gaussiane

Raman shift (cm-1

)1550 1600 1650 1700

0.0

0.4

0.8

1.2

1200 1300 1400 15000.0

0.4

0.8

1.2

1000 1040 1080 1120

Inte

nsity (

a.u

.)

0.0

0.2

0.4

10

00

10

32

10

88

11

23

11

77

12

06

12

32

12

62

13

02

13

37

13

79

14

12

14

50

14

80

15

52 15

81

16

15

16

55

16

80

(a)

(b)

(c)

1000 cm-1: symmetric ring breathing Phe;

1032 cm-1: CH in-plane bending Phe;

1088 cm-1: PO2- stretching (n.a.) + C-O, C-C

stretching (p) + C-C stretching (l);

1123 cm-1: C-N stretching (p);

1177 cm-1: C-H bending Tyr;

1206 cm-1: C-C6H5 Tyr, Phe, Trp;

1232 cm-1: amide III ( sheet);

1262 cm-1: amide III ( helix);

1302 cm-1: CH2 twisting (l);

1337 cm-1: CH2,, CH3 wagging (p) + A, G (n.a.);

1379 cm-1: A, G, T (n.a.);

1450 cm-1: CH2/CH3 scissoring (l.) + CH2 bending (p.);

1480 cm-1: A, G (n.a.);

1552 cm-1: Trp;

1581 cm-1: A, G (n.a.);

1615 cm-1: C=C, Tyr. Trp;

1655 cm-1: amide I ( helix);

1680 cm-1: amide I ( sheet)

Esposizione a pesticidi: analisi spettri RamanEsposizione a pesticidi: analisi spettri Raman


Esposizione a pesticidi: analisi spettri RamanEsposizione a pesticidi: analisi spettri Raman Chlorphyriphos

0.8

1.2

1.6

2.0

(1655-1680 cm-1)

(1220-1280 cm-1)

0 (control) 10-6 10-5

inte

ns

ity (

a.u

.)

0.2

0.3

0.4

(1379 cm-1

)

(1581 cm-1

)

(1480 cm-1

)

Chlorphyriphos concentration (M)0 (control) 10-6 10

-5

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

(1615 cm-1)

(1206 cm-1)

(1000 cm-1)

0 (control) 10-6 10-5

Singoli amminoacidi 1000 cm-1: symmetric ring breathing Phe

1206 cm-1: C-C6H5 Tyr, Phe, Trp

1615 cm-1: C=C, Tyr. Trp

Legami fra amminoacidi 1655-1680 cm-1: amide I

1220-1280 cm-1: amide III

Acidi nucleici 1379 cm-1: A, G, T

1581 cm-1: A, G 1480 cm-1: A, G

L’intensità di ciascun

picco è normalizzata

rispetto a quella del

picco a 1450 cm-1


Esposizione a pesticidi: analisi spettri RamanEsposizione a pesticidi: analisi spettri Raman Deltametrina

Singoli amminoacidi

1000 cm-1: symmetric ring breathing Phe

1204 cm-1: C-C6H5 Tyr, Phe, Trp

1615 cm-1: C=C, Tyr. Trp

Legami fra amminoacidi

1655-1680 cm-1: amide I

1220-1280 cm-1: amide III

Carboidrati

1056 cm-1: C-C

L’intensità di ciascun

picco è normalizzata

rispetto a quella del

picco a 1450 cm-1

1.0

1.5

2.0

(1655-1680 cm-1)

(1220-1280 cm-1)

0 (control) 10-6 10-5

inte

ns

ity (

a.u

.)

0.0

0.1

0.2

(1056 cm-1

)

Deltamethrin concentration (M)0 (control) 10-6 10

-5

0.0

0.1

0.2

0.3

(1615 cm-1 )

(1204 cm-1)

(1000 cm-1)

0 (control) 10-6 10-5


Esposizione a pesticidi: misure AFMEsposizione a pesticidi: misure AFM Chlorphyriphos

Controllo: nucleo compatto, superficie liscia, assenza di rugosità e fori.

10-6 M and 10-5 M: forma regolare, nucleo compatto, superficie con lievi

increspature rispetto al controllo G. Perna et al., J. Raman

Spectroscopy 42, 603-611 (2011)


Esposizione a pesticidi: misure AFMEsposizione a pesticidi: misure AFM Deltametrina

Controllo:: nucleo compatto, superficie liscia, assenza di rugosità e fori.

10-6 M e 10-5 M: forma irregolare, membrana plasmatica danneggiata. G. Perna et al., Vibrational

Spectroscopy 57, 55-60 (2011)


Curve forzaCurve forza--distanzadistanza

modulo di Young sforzo, deformazioneE

La forza di interazione è descritta da relazioni analitiche

dipendenti dalla forma della punta e dalle caratteristiche dei due

materiali a contatto

F>0: repulsiva

F<0: attrattiva



Dimensioni sonda ~nm => proprietà elastiche locali

Dimensioni sonda ~µm =>

=> proprietà elastiche globali

Stima di E: modello di HertzStima di E: modello di Hertz

Forza di indentazione su un materiale elastico ed omogeneo:

3/ 2

2

4

3 1

CR EF

δ: profondità di indentazione

ν: coefficiente di Poisson

RC: raggio della sonda

E: modulo di Young


Esposizione a pesticidi: curve forzaEsposizione a pesticidi: curve forza--distanzadistanza

Prodotto commerciale: Deltametrina + coformulanti + solvente

Vitalità cellulareVitalità cellulare

Concentrazione citotossica (per 24 h):

> 2.5·10-6 M

L’aggiunta di coformulanti diminuisce la

concentrazione citotossica (~2 ordini di

grandezza)


spostamento piezoelettrico (nm)

-300 -200 -100 0 100 200

Deflessio

ne m

icro

leva (

nm

)

0

50

100

150

200

controllo

5X10-8M

5X10-7M 5x10-7 M diminuisce deflessione

aumenta indentazione

indentazione = spostamento - deflessione


Esposizione a pesticidi: calcolo modulo di YoungEsposizione a pesticidi: calcolo modulo di Young

3/ 2

2

3/ 2

2

2

4

3 1

4, con

3 1

3 1

4

C

C

C

R EF

R EF K K

E KR

2 valori di K => 2 valori di E

E1: indentazione minore di ~20 nm : regione membrana

E2: indentazione maggiore di ~20 nm: regione citosol


Esposizione a concentrazioni di 1 o 2 ordini di grandezza inferiori

alla citotossica causa alterazioni biochimiche nelle cellule

ConclusioniConclusioni

CHLORPHYRIPHOS

basi del DNA, singoli

aminoacidi, legami peptidici,

legami lipidici di membrana

DELTAMETRINA

legami -CH2 dei lipidi delle

citomembrane HgCl2

legami lipidici di membrana e

acidi nucleici


ConclusioniConclusioni

DELTAMETRINA

Forma irregolare, formazione di

fori e rigonfiamenti sulla

membrana, riduzione del modulo

di elasticità di membrana

Esposizione a concentrazioni di 1 o 2 ordini di grandezza inferiori

alla citotossica causa alterazioni morfologiche e meccaniche

nelle cellule

HgCl2

Superficie irregolare, formazione

di fori e rigonfiamenti sulla

membrana

HgCl2

Azione immediata dell’HgCl2

provoca modificazioni della

membrana plasmatica


CollaborazioniCollaborazioni

Vito Capozzi

Maria Lasalvia

Palma D’Antonio

Giuseppe Quartucci

Emilio Mezzenga

Marco Lazzarino

Elisa Migliorini

Antonio Cricenti

Marco Luce

Spettroscopia Raman e microscopia AFM di...

Documents

Transcript of Spettroscopia Raman e microscopia AFM di...