Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti

Attività elettrica dei neuroni

Nel potenziale d’azione si distinguono due fasi:

-fase di DEPOLARIZZAZIONE

-fase di RIPOLARIZZAZIONE

tempo

Basi ioniche del potenziale d’azione

• conduttanze e correnti di Na voltaggio-dipendenti• conduttanze e correnti di K voltaggio-dipendenti

Qual è il ruolo dei canali del Na+ nella genesi del potenziale d’azione?

1. Osservazione di Hodgkin e Huxley (1939):– al picco di un potenziale d’azione il potenziale di membrana diventa transitoriamente positivo all’interno – overshoot.

2. Ipotesi: è coinvolto il Na – l’entrata di Na attraverso la membrana continuerà fino al raggiungimento del potenziale di equilibrio del Na (ENa).ENa = 58 log ([Na]o / [Na]i) = 58 log (460/50) = 59 mV50% [Na]o -> ENa = 38 mV33% [Na]o -> ENa = 28 nV

3. Esperimento di Hodgkin e Katz (1949):riducendo [Na]o riduzione dell’overshoot

PK : PNa : PClAl potenziale di riposo 1.0: 0.04: 0.45Al picco del PA 1.0 : 20 : 0.45

Conclusione:Il potenziale d’azione è il risultato di un grande e transitorio aumento nella permeabilità al Na della membrana.

Che dire della fase di caduta del potenziale d’azione?

- I canali del Na semplicemente si chiudono (inattivazione)

Ma se la causa fosse solo questa, la ripolarizzazione sarebbe più lenta di quanto osservato sperimentalmente

Il potenziale di membrana ritorna verso EK

Il potenziale di membrana iperpolarizza (diventa più negativo del potenziale di riposo) per un certo tempo

- Si verifica un successivo grosso aumento della permeabilità della membrana al K dovuto all’apertura di canali del K voltaggio-dipendenti.

Ipotesi: Le conduttanze del Na e K sono voltaggio-dipendenti- La probabilità che i canali si aprano aumenta con la depolarizzazione.

L’effetto della conduttanza al Na- rigenerativo.

Il processo-si autoalimenta-feedback positivo

La depolarizzazione aumenta laconduttanza al K con un certo ritardo.

-autolimitante-feedback negativo

Per spiegare l’ampiezza e l’andamento temporale del potenziale d’azione

Aumentodi gNa

Depolarizz. Corrente di Na entrante

Aumentodi gK

Depolarizz.

Corrente di K uscente

Ripolarizz.

Ipotesi di Hodgkin e Katz:La depolarizzazione della cellula al di sopra del valore di soglia causa un breve aumento della permeabilità della membrana agli ioni Na.

In che maniera la permeabilità di membrana (conduttanza) agli ioni Na varia con il potenziale di membrana?

Esperimento: Occorrerebbe misurare l’ampiezza della corrente di Na+ (INa) che fluisce attraverso la membrana a diversi livelli del potenziale di membrana (Vm)

gNa = INa / (Vm – ENa)

C’è un problema: La corrente fluisce attraverso la membrana il potenziale di membrana cambia la conduttanza della membrana si modifica sia al variare del potenziale di membrana che nel tempo

Cioè, esiste forte interdipendenza del PM e del gating dei canali del Na (e del K) sia il PM che la conduttanza dei canali cambiano costantemente.

Per risolvere questo problema,K. Cole sviluppò la tecnica del voltage-clamp.

depolarizzazione

Canali NaapronoINa entra.

Sempre aperti

extracell.

Voltaggio-dipendenti: rispondono a

variazioni di Vm

intracell.

Alcuni tipi di canali Ionici sono sempre aperti, altri no!

Il loro comportamento è ohmico: la relazione I/V è lineare g=costante

Il loro comportamento non è ohmico: la relazione I/V non è lineare perché g non è costante [g=f(Vm)]

Il modello di H&H della gate assume una reazione cinetica del 1o ordine tra gli stati aperto e chiuso della particella di gating

C

O

Quindi, la probabilità della particella di trovarsi nello stato aperto può essere descritta da:

(1-Po)

Po

Trattandosi di una cinetica del 1o ordine, sarà:

ooo

PPdt

dP )1(

Modello del gating secondo H&H

Risolvendo l’equazione differenziale del 1o ordine e applicando la condizione al contorno , si ottiene:)0(0 tPP oo

t)(oooo e)PP(P)t(P 100

Allo stato stazionario (equilibrio) sarà:

quindi,

0)1( ooo

PPdt

dP

oP

Se p particelle di gating indipendenti sono coinvolte nel gating del canale, allora il canale seguirà il seguente andamento temporale: po

channo tPtP )()(

Po(t)

Pro

b.

Di A

ttiv

az.

Tempo

[Po(t)]p

0 2 4 6 8

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1/()= rappresenta la costante di tempo dell’attivazione ed è un indice della velocità di attivazione della particella di gating.

0 10 20 30 40-70

20

(m

V)

Tempo (ms)

0 10 20 30 40-60

-40

-20

0

20

40

60C

orre

nte

ioni

ca (

nA)

Tempo (ms)

La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche

transmembranarie generate a tale potenziale di membrana

Potenziale di riposo (Vr)

Potenziale di membrana finale (Vm) costante (potenziale di comando)

Corrente transmembranaria generata dal passaggio di Vm da –70 mV a +20 mV

Vantaggi del voltage-clamp:

In genere, nel caso di canali voltaggio-dipendenti, gm = f(V,t) ma,

1. Vm è bloccato ad un valore costante gm = f(t) soltanto e può essere dedotto dall’andamento della corrente ionica Ii

2. E’ possibile separare Ii da Ic. Infatti cm è caricata istantaneamente

0 10 20 30 40-70

20

Vol

tagg

io (

mV

)

Tempo (ms)

0 10 20 30 40-60

-40

-20

0

20

40

60

Cor

rent

e io

nica

(nA

)

Tempo (ms)

INa+IK

+ TTX (IK)

+ TEA (INa)

Separazione farmacologica delle correnti IK e INa

Cor

ren

te K

+ (

nA

)

0 10 20 30 40-20

0

20

40

60

80

100

120

140

Tempo (ms)

0 10 20 30 40

-70

Vol

tagg

io (

mV

)

Tempo (ms)

-30-20-10

0102030405060

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60-20

0

20

40

60

80

100

120

140

I(K+ )

ma

x (n

A)

Voltaggio (mV)

Con

dutta

nza

(μS

)

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Voltaggio (mV)

IK=gK• (V-EK)

gK = IK/(V-EK)

EK=-80 mV

Voltaggio-dipendenza dei canali Kv

Canali voltaggio-indipendenti

Il potenziale di riposo di una cellula è determinato dalla presenza di due canali permeabili rispettivamente ai cationi A+ e B+ attraverso i quali passano le correnti ioniche IA e IB indicate in tabella.Dopo aver disegnato i rispettivi grafici I/V, determinare:1)     le conduttanze gA e gB;2)     se i due canali sono voltaggio-dipendenti o -indipendenti;3)     il potenziale di equilibrio dei due ioni A e B;4)     il potenziale di riposo Vr della cellula.

V(mV) IA (nA) V(mV) IB (nA)

-120 -1650 -20 -1320-110 -1100 -10 -1100-100 -550 0 -880-90 0 10 -660-80 550 20 -440-70 1100 30 -220-60 1650 40 0-50 2200 50 220-40 2750 60 440-30 3300 70 660

V(mV) IA=gA(V-EA) (nA) V(mV) IB=gB(V-EB) (nA)

-120 -1650 -20 -1320-110 -1100 -10 -1100-100 -550 0 -880-90 0 10 -660-80 550 20 -440-70 1100 30 -220-60 1650 40 0-50 2200 50 220-40 2750 60 440-30 3300 70 660

g1A=-1650/[-120-(-90)]= 55 S

g1B=-1320/[-20-(+40)]= 22 S

Vr =(EAgA +EBgB )/(gA +gB )= -52.9 mV

EA=-90mV

EB=+40mV

-2000

-1000

0

1000

2000

3000

4000

-150 -100 -50 0 50 100

EA EB

Quesito del giorno

 Un ricercatore, in seguito ad esperimenti condotti in voltage-clamp ha ricavato che la corrente di K+ (IK) dipende dal potenziale

di membrana (V) secondo la seguente relazione:

(pA)

 

1)    Calcolare i valori di IK nell’intervallo di potenziali tra –80 e

+80 mV ad intervalli di 10 mV e metterli in grafico in funzione di V;

2)    Dai valori di IK ricavati, e sapendo che EK= -85 mV, calcolare i

valori corrispondenti di gK e metterli in grafico in funzione di V;

3)    A quale valore di V sara’ aperta la meta’ dei canali?

9/)10(1

11)85(6.4

VK

eVI

IK = 4.6·[1-1/(1+EXP((V+10/9))]·(V+85) (pA)

Vm IK Vm-EK gK

-80 0.0 5 0.002-70 0.1 15 0.006-60 0.4 25 0.018-50 1.9 35 0.053-40 7.1 45 0.158-30 24.7 55 0.450-20 74.1 65 1.139-10 172.5 75 2.3000 294.2 85 3.46110 394.3 95 4.15020 466.4 105 4.44230 522.9 115 4.54740 572.8 125 4.58250 620.2 135 4.59460 666.7 145 4.59870 712.9 155 4.59980 759.0 165 4.600

0

200

400

600

800

-100 -50 0 50 100

mV

pA

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

-100 -50 0 50 100

mV

nS

EK = -85 mV

0 1 2 3 4

-70

Vol

tagg

io (

mV

)

Tempo (ms)

-50-40-30-20-10

010203040

60

0 1 2 3 4-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

I(N

a) (

nA)

Tempo (ms)

-5

-4

-3

-2

-1

0

I(N

a) (

nA)

0 1 2 3 4Tempo (ms)

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 60

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

I(N

a)

pic

co (

nA

)

Voltaggio (mV)

-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 400.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

Voltaggio (mV)

Con

du

ttan

za (

μS

)

INa=gNa• (V-ENa)

gNa = INa/(V-ENa)

ENa=+50 mV

Voltaggio-dipendenza dei canali Na

Separazione della fase di attivazione della corrente di Na dall’inattivazione

La pronasi rimuove l’inattivazione

-1200

-1000

-800

-600

-400

-200

0

Co

rre

nt e

(nA

)

0 10 20 30 40

tempo (ms)

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

Vo

lt ag

gio

(m

V)

0 10 20 30 40

tempo (ms)

-80 -60 -40 -20 0 20 40

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Con

dutt

anza

(S

)

Voltaggio (mV)

0

0.5

1

Pro

b. c

anal

e ap

erto

-80 -60 -40 -20 0 20 40

-800

-600

-400

-200

0

Cor

ren

t e d

i N

a (

nA)

Voltaggio (mV)

La corrente attraverso il canale dipende da

1. Permeabilità del canale: conduttanzale conduttanze del Na e K sono voltaggio-dipendenti

2. Driving force – dovuta al potenziale elettrico attraverso la membrana e al gradiente di concentrazione degli ioni.

L’ampiezza della corrente di K aumenta con la depolarizzazione.L’ampiezza della corrente di Na aumenta e poi diminuisce con la depolarizzazione.

Perchè?

Depolarizzazione: Depolarizzazione:

IK= gK (Vm–EK) INa= gNa (Vm–ENa)

Come risalire dai valori di conduttanza allo stato stazionario alla probabilità di trovare una singola gate del canale aperta

Grafico della conduttanza g(V) allo stato stazionario

Nel caso di un canale inattivante, esso è stato ottenuto rimuovendo l’inattivazione

-80 -60 -40 -20 0 20 40

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Co

nd

utt

an

za (

S)

Voltaggio (mV)

0

0.5

1

Pro

b.

ca

na

le a

pe

rto

maxo G

gP

oP)V(g

Ipotesi: l’attivazione del canale è regolata da x gates n uguali e indipendenti.

Allora, se n∞ è la probabilità di avere la singola gate n aperta allo stato stazionario, la probabilità Po di trovare il canale aperto allo stato stazionario (in assenza di inattivazione) sarà:

Probabilità composta: n·n·n…. (x volte)

Quindi, dai valori di Po si può risalire ai valori di n∞:

xo nP

xoPn

Gmax

Quesito del giorno

Un ricercatore, in seguito ad esperimenti condotti in voltage-clamp e utilizzando la tossina di scorpione per bloccare l’inattivazione, ha ricavato che la conduttanza del canale del Na+ (gNa) dipende dal potenziale di membrana (V) secondo la

seguente relazione:

  (nS)

1)    Calcolare i valori di gNa nell’intervallo di potenziali tra –

80 e +80 mV ad intervalli di 10 mV e metterli in grafico in funzione di V; a quale valore di gNa sarà aperta la metà dei canali?

2)    Dai valori di gNa ricavati, e sapendo che ENa= +55 mV,

calcolare i valori corrispondenti di INa e metterli in grafico in

funzione di V.

6/)30(1

116.5

VNa

eg

gNa=5.6(1-1/[1+EXP((V+30)/6)]) (nS)

ENa=+55 mV

Vm gNa (nS) Vm-ENa INa (pA)

-80 0.00 -135 -0.2-70 0.01 -125 -0.9-60 0.04 -115 -4.3-50 0.19 -105 -20.3-40 0.89 -95 -84.5-30 2.80 -85 -238.0-20 4.71 -75 -353.3-10 5.41 -65 -351.50 5.56 -55 -305.910 5.59 -45 -251.720 5.60 -35 -196.030 5.60 -25 -140.040 5.60 -15 -84.050 5.60 -5 -28.060 5.60 5 28.070 5.60 15 84.080 5.60 25 140.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

-100 -50 0 50 100

mV

nS

-400

-300

-200

-100

0

100

200

-100 -50 0 50 100

mV

pA

0 1 2 3 4 5 6 7-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

Vm

(mV

)

Tempo (ms)

Studio dell’inattivazione allo stato stazionario

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

I Na (

nA)

Tempo (ms)

0 1 2 3 4 5 6 7

0 mV

Se si ipotizza che il processo di inattivazione sia regolato da un’unica gate (h), i valori in grafico sono proporzionali alla probabilità di trovare tale gate aperta allo stato stazionario

-120 -100 -80 -60 -40 -20 0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Cor

rent

e di

Na

( nA

)

Potenziale di condiz. (mV)

Pro

babi

li tà

gate

h a

per ta

0

1

0.5

-60 -40 -20 0 20 40 60

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Con

dutta

nza

g

Vm (mV)

Confronto della voltaggio-dipendenza di gK e gNa

EA=+55mV EB=-80mV

Vm g (nS) Vm-EA IA (pA) Vm-EB IB (pA)

-80 0.00 -135 -0.2 5 0.0-60 0.04 -115 -4.3 25 0.9-40 0.89 -95 -84.5 45 40.0-20 4.71 -75 -353.3 65 306.20 5.56 -55 -305.9 85 472.820 5.60 -35 -196.0 105 587.940 5.60 -15 -84.0 125 700.060 5.60 5 28.0 145 812.080 5.60 25 140.0 165 924.0

Nota:A parità di conduttanza, è la driving force che determina

l'andamento della relazione I/V

-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100-400

-200

0

200

400

600

800

1000

Cor

rent

e (p

A)

Voltaggio (mV)

EA=+55mV EB=-80mV

HHsim: Graphical Hodgkin-Huxley Simulator

http://www.cs.cmu.edu/~dst/HHsim/

Esercizio

Usando il programma di simulazione H&H, progettare un esperimento di voltage-clamp per determinare:

(a) Il potenziale di inversione della corrente del Na

(b) Il potenziale di inversione della corrente del potassio

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (ms)

Vo

lta

gg

io (

mV

)

-3000

-2000

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (ms)

IK (

nA

)

-500-400-300-200-100

0100200300400500

24 25 26 27 28 29 30

Tempo (ms)

IK (

nA

)

+348 nA (-60 mV)

+60 nA (-70 mV)

-216 nA (-80 mV)

Relazione IK ist. - Voltaggio

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

-85 -80 -75 -70 -65 -60 -55

Voltaggio (mV)

IK is

tan

tan

ea

(n

A) EK

Calcolo del potenziale di inversione (equilibrio) della corrente di K+

C O

Vtail (mV) IK ist. (nA) V-EK

-60 348 -60-EK >0

-70 60 -70-EK >0

-80 -216 -80-EK <0

EK < -60 EK < -70 EK > -80