Tossico

Presenza

nell’organismo

Interazione con

Molecole bersaglio

Disfunzione

cellulare, danno

Riparazione

insufficiente o errata

TO

SS

IC

ITÀ

A

B

C

A: la sola presenza provoca

tossicità senza specifiche

interazioni con molecole

bersaglio;

B: l’effetto deriva da

interazione con specifiche

molecole bersaglio;

C: il danno e correlato a

meccanismi di riparazione

Tipologia dei meccanismi di danno cellulare

Descrizione e terminologia degli effetti tossici

Gli effetti tossici sono estremamente variabili per natura,

meccanismo d’azione, organismo e struttura bersaglio

In base al luogo d’azione si distinguono :

Effetti locali,

Effetti sistemici.

In base alla latenza di comparsa si distinguono:

Effetti immediati,

Effetti ritardati.

In base alla persistenza si distinguono:

Effetti reversibili,

Effetti irreversibili.

Effetti locali: sono quelli prodotti nel sito primario di contatto

tra agente tossico e organismo ( es: lesioni gastrointestinale da

sostanze caustiche ingerite, effetti polmonari di gas e vapori

irritanti)

Effetti sistemici: sono quelli prodotti in organi, cellule, tessuti

lontani dal luogo di assorbimento (necessitano di processi di

distribuzione operato dal sistema circolatorio)

Effetti immediati: si sviluppano in tempi brevissimi in seguito a

una singola esposizione/dose ( da non confondere con effetto

acuto, che denota una singola esposizione, ma non

necessariamente un effetto immediato)

Effetti ritardati: si sviluppano in seguito a una singola

esposizione/dose o ad un accumulo di più di esse e si

manifestano comunque a distanza temporale (latenza) dalla

prima esposizione. (da non confondere col termine Effetto

cronico)

EFFETTO ACUTO = conseguente ad una unica

esposizione a relativamente elevate concentrazioni o

ad esposizioni di breve durata (poche ore).

EFFETTO CRONICO = conseguente all’esposizione

prolungata o ripetuta nel tempo per più giorni

Effetti reversibili: sono quelli che scompaiono in tempi più o

meno brevi cessata l’esposizione.

Effetti irreversibili: sono quelli che permangono anche cessata

l’esposizione. La reversibilità può essere anche correlata alla

capacità di riparazione del tessuto leso.

Un tipo particolare di effetto sono l’Allergia e

l’IdiosincrasiaL’allergia è una risposta indesiderata su base

immunologica ed è il risultato di una percedente

esposizione alla medesima sostanza o a sostanze

analoghe.

L’idiosincrasia è una risposta anomala agli agenti

chimici su base genetica. Un esempio è, in soggetti

geneticamente carenti dell’enzima glucosio-6-fosfato-

deidrogenasi, l’ipersensibilità a sostanze ossidanti come

I nitroaromatici, i clorati e gli anti malarici con

conseguente manifestazione di anemia emolitica .

La natura e la gravità degli effetti tossici

prodotti da un agente tossico dipende da molti

fattori:

1. La sua proprietà chimico fisica

2. La sua bio-attivazione

3. Le condizioni di esposizione

4. La presenza di meccanismi di bio-protezione

Le sostanze tossiche possono avere struttura

chimico-fisica tale da poter reagire con le

strutture biologiche bersaglio o possono

acquisire tale capacità solo dopo un processo di

bio-attivazione

Reazioni enzimatiche di Attivazione

1. Formazione di elettroflili

2. Formazione di Nucleofili

3. Formazione di Radicali

4. Formazione di sostanze red-ox-attive

Gli elettrofili sono molecole povere di elettroni che

tendono a combinarsi con macromolecole

nucleofile (es. DNA, emoglobina ecc.). La

Formazione di elettrofili avviene spesso in reazioni

catalizzate da monoossigenasi (es. P450), reazioni di

ossidazione e riduzione di metalli, ri-arrangiamenti

spontanei, ma posso essere assunti anche come tali.

I nucleofili: Sono prodotti più raramente e sono molecole

ricche di elettroni. Esempi: il CO formato nel processo di

dealogenazione ossidativa del di cloro metano; il CN formato

da batteri intestinali. Poiché la cellula è povera di siti elettrofili

i nucleofili formatisi nel metabolismo sono molto meno

pericolosi per la cellula degli elettrofili o dei radicali liberi.

I radicali liberi sono molecole o frammenti di esse che

hanno uno o più elettroni spaiati nell’orbitale esterno.

Poiché sono instabili ed altamente reattivi tendono a

reagire con altre molecole per accoppiare l’elettrone

spaiato e raggiungere la stabilità. Si formano in seguito

all’acquisizione o perdita di un elettrone o in seguito alla

scissione di un legame covalente con suddivisione simmetrica

degli elettroni (questa reazione può essere innescata da

radiazioni, particolari condizioni di temperatura, reazioni

redox in presenza di metalli di transizione: Cu, Fe ecc…)

I radicali liberi possono essere cationici ( es . L’anione superossido) o neutri

(es.l’ossido nitrico , NO ) e possono essere generati dagli xenobiotici con

meccanismi diversi:

a) Per accettazione di elettroni da una riduttasi ( es. L’ebicida Paraquat)

PQ++

PQ+

O2

O2

b) Per dealogenazione riduttiva ( es. Il tetracloruro di carbonio)

CCl4 Cl3C Cl3COO (triclorometilperossido)

c) Composti nucleofili come fenoli, idrochinoni, idrazine, tioli

possono cedere elettroni in reazioni catalizzate dalle perossidasi,

generando radicali

d) Durante la reazione di Fenton catalizzata da metalli di transizione

come: Fe(II), Cu(II), Cr(V), Ni(II), Mn(II)

O2

O2SOD

HOOH

HO OH-

2H+ Fe(II), Cu(II), Cr(V), Ni(II), Mn(II)

Fe(III), Cu(III), Cr(VI), Ni(III), Mn(III)

Reazione di Fenton

I radicali dell’ossigeno possono innescare a cascata

numerosi eventi tossici che prendono genericamente

il nome di Stess Ossidativo e che avvengono in

sequenza nella cellula (vedi più oltre)

La formazione dei radicali liberi dall’ossigeno (ROS) nella

cellula avviene :

•Nei mitocondri (durante al fosforilazione ossidativa il 2-3%

dell’ossigeno accettore finale d’elettroni viene convertito in

radicali)

•Nei perossisomi ( durante la beta-ossidazione degli acidi

grassi si forma H2O2 che origina radicali dell’ossigeno. I

proliferatori dei perossisomi aumentano enormemente il

fenomeno)

•Nel REM (P450)

•Nel citosol (Xantina ossidasi)

•Nella membrana ( ad opera della Ciclossigenasi che

sintetizza prostaglandine a partire dall’acido arachidonico nel

passaggio da PGG a PGH si producono ingenti quantità di

ROS) .

Formazione di sostanze che attivano cicli red-ox:

a) i nitriti formati dai Nitrati nell’intestino ad opera di batteri portano alla

fomazione di metemoglobina (emoglobina ossidata);

b) Cr(VI) può essere ridotto a Cr(V) da Acido ascorbico e flavine NADPH

dipendenti con conseguente formazione di OH .

Formazione di metemoglobina

Interazione con molecola bersaglio ( meccanismo B)La tossicità è determinata dall’interazione dello xenobiotico con una molecola

bersaglio, segue una reazione che determina alterazioni della molecola bersaglio

queste si manifestano poi a diversi livelli (Molecola, organulo cellulare, cellula,

tessuto, organo, organismo)

Tossico Bersaglio

Effetti sulla molecola

bersaglio:

•Disfunzione

•Distruzione

•Formazione di Antigeni

Tipi di reazione: 1-Legame non covalente;

2-Legame covalente; 3-Estrazione di H; 4-

Trasferimento di e-; 5-Reazioni enzimatiche

Attributi: accessibilità,

reattività, funzione

critica

Per conoscere gli effetti tossici di uno xenobiotico bisogna

conoscere: la sua reattività con molecole bersaglio, l’effetto che

ne consegue e gli attributi del bersaglio.

TIPI DI REAZIONE

A-Legami non covalenti: -Legami elettrostatici; -ponti idrogeno;

-ponti ionici; -forze deboli di van der Waals

T +B TB EFFETTO

Questi legami possono generalmente essere reversibili e

avvengono con recettori di membrana o intracellulari per

sostanze endogene mimando o antagonizzando gli effetti degli

agonisti naturali (ormoni, neurotrasmettitori) Esempio particolare

il legame delle TCDD, IPA ecc col il recettore citosolico Ahr.

Molto spesso l’azione tossica che consegue è stimolazione o

inibizione di una funzione fisiologica in tempi e modi

inappropriati. Esempi: La stricnina occupa il recettore per la

glicina e produce tetania; DDT agisce sui canali del Na

prolungandone l’apertura , riduce il trasporto nei canali del K,

ecc…)

B-Legami Covalenti:

Questi coinvolgono:

1. Sostanze elettrofile o cationi radicalici con macromolecole

nucleofile (proteine, enzimi, acidi nucleici);

2. Radicali neutri come OH e Cl3COO con atomi di C dei

lipidi e delle basi del DNA;

3. nucleofili come CN, CO, H2S con le emoproteine.

T +B TB EFFETTO

Generalmente sono irreversibili e portano ad

inattivazione permanente o distruzione della

molecola bersaglio

La formazione di un legame covalente a macromolecole dipende

dalla reattività dei metaboliti elettrofili ma anche dalla loro

lipofilia o idrofilia. Si legano a gruppi sulfidrici o aminici delle

proteine e a gruppi con azoto e ossigeno degli acidi nucleici.

ESEMPI DI ALCUNI LEGAMI COVALENTI DI

XENOBIOTICI ATTIVATI DA BIOTRASFORMAZIONI

1-Gli epossidi di eteni alogenati (cloruro di vinile) ai gruppi SH di

apoproteine e alla guanina, adenina e citosina del DNA.

2-L’ossido di etilene ai gruppi istidinici delle proteine (emoglobina) e al

DNA.

3-I metaboliti chinonici di benzene e bromobenzene, naftalina ai gruppi

SH delle proteine in addizione 1,4.

4-Le amine aromatiche al residuo cisteinico di sieroproteine e al C8 della

guanina nel DNA.

5-Il radicale triclorometilico degli idrocarburi tetraclorurati al P450

C-Estrazione di H:

1- I radicali neutri estraggono H da tioli (R-SH )

producendo R-S che possono essere ossidati a

R-SOH o a disolfuri (RS-SR);

2- L’OH rimuove H da i gruppi –CH2 di

aminoacidi e proteine trasformandoli in gruppi

carbonilici che possono interagire con le ammine

(alterazione per cross-linking di DNA e

proteine);

3- Estrazione di H da acidi grassi determina la

perossidazione lipidica

Perossidazione dei lipidi da radicali o radiazioni

D-Trasferimento di e-:

ES: Nitriti, fenoli, idrossilammina 5-

idrossiprimachina, fenilidrazina ossidano (FeII )a

(FeIII) nell’emoglobina;

E-Reazioni enzimatiche: tossine di origine animale,

vegetale, micotica o batterica possono produrre

reazioni enzimatiche specifiche:

1. Frammentazione dei ribosomi;

2. Frammentazione di proteine strutturali;

3. Attivazione di G-protein;

4. Fosforilazione o defosforilazione di proteine e

altre macromolecole.

Trasferimento di elettroni

Effetti sulla molecola bersaglio:

1-Distruzione o frammentazione della molecola per:

a-Formazione di radicali liberi; b-Perossidazione; c-Idrolisi.

2-Disfunzione per: a-Attivazione della molecola bersaglio

mimando il ligando endogeno (es: gli xenormoni); b-Inibi-

zione della funzione ( es chiusura / apertura di canali ionici ad

opera di veleni animali e insetticidi clororganici); c-Inibizione

enzimatica ( es insetticidi organo fosforici); d-Formazione di

addotti che distorcono la struttura; e-Alterazione dello stato di

polimerizzazione di proteine citoscheletriche; f-Blocco del

trasporto di elettroni nella catena ossidativa mitocondriale .

3-Formazione di neoantigeni: alterazioni proteiche spesso indotte

da nucleofili ( ammine aromatiche, idrazine, tioli) possono

evocare risposte immunitarie.

Struttura bersaglio

bersaglio molecolare. proteine, (coenzimi), acidi nucleici,

lipidi

bersaglio cellulare: nucleo, mitocondri, RER, membrana

plasmatica

Attributi della Molecola bersaglio

Tutte le molecole endogene potenzialmente possono essere il bersaglio,

però generalmente lo sono macromolecole come proteine e acidi

nucleici . L’interazione diretta con ATP e cofattori è rara. Per esser

bersaglio di xenobiotici la molecola endogena deve:

1. Possedere reattività e conformazione sterica che consentano

l’interazione;

2. Essere in un sito accessibile;

3. Avere una funzione critica.

Il danno o la disfunzione a livello molecolare

origina danno o disfunzione della struttura o

funzione cellulare (bersaglio cellulare)

La mancanza o l’insufficienza di riparazione o

compensazione determina danno a livello di

tessuto/organo o di funzione fisiologica.

Ciò determina la patologia più o meno grave

in funzione dell’entità/ estensione del danno

e della sua eventuale reversibilità

Un esempio della sequenza di danni generati a

cascata da interazione tossico molecola bersaglio e lo

stress ossidativo innescato dai radicali dell’ossigeno,

messi in sequenza temporale:

1. Perossidazione lipidica delle membrane

2. Ossidazione e deplezione del Glutatione ridotto

3. Ossidazione dei tioli proteici

4. Alterazione dell’omeostasi ionica (pompe di

membrana)

5. Danno al DNA

6. Alterazioni citoscheletriche

7. Danni mitocondriali e deplezione ATP

8. Aumento della fragilità di membrana

9. Morte cellulare

Ruolo della molecola bersaglio 1La attività coordinata di un sistema biologico

multicellulare sussiste in quanto ciascuna cellula porta

a termine un programma ben definito.

I programmi a lungo termine determinano il destino

delle cellule cioè se esse devono procedere verso la

divisione cellulare piuttosto che verso la

differenziazione o la apoptosi

I programmi invece a breve termine controllano le

attività di cellule differenziate specializzate

determinando cioè la maggior o minor attività

secretore, la contrazione o il rilassamento, la maggior o

minor velocità di trasporto o di metabolismo.

Per la coordinazione di questi programmi cellulari le

cellule posseggono una rete di regolazione che può

essere attivata o inattivata da molecole segnale esterne.

Per eseguire i programmi le cellule sono dotate di

sistemi organizzati in complessi macromolecolari,

membrane cellulari e organelli che si occupano di sintesi,

cinetica, trasporto, metabolismo, produzione energetica.

Tutti questi processi servono a mantenere l’integrità

cellulare (funzioni interne) o a supportare e mantenere

l’attività di altre cellule ( funzioni esterne)

Ruolo della molecola bersaglio 2

Ruolo della molecola bersaglio 3

Il tipo di disfunzione causata dal tossico dipende dal ruolo che

ha nel sistema multicellulare la macromolecola bersaglio:

1. Se è una molecola coinvolta nella regolazione cellulare,

primariamente si verifica una sregolazione dell’espressione

genica, e/o la sregolazione di una attività temporanea

cellulare

2. Se la molecola bersaglio è coinvolta principalmente nel

mantenimento delle funzioni interne l’effetto risultante è una

disfunzione che può compromettere la sopravvivenza della

cellula stessa

Quando comunque la molecola bersaglio cellulare è importante

per regolare funzioni esterne si verifica una influenza

sull’attività di altre cellule dell’organo o di un sistema di

organi integrati tra loro nelle funzioni vitali per l’organismo.

SREGOLAZIONE CELLULARE

Le cellule sono regolate da segnali molecolari che attivano

specifici recettori di membrana o intracellulari che sono

collegati a un rete di trasduzione del segnale che trasmette il

segnale a precise regioni regolatorie dei geni e/o di proteine

funzionali

La attivazione del recettore può comportare da parte di una

xenobiotico:

1. Una alterata espressione genica

2. Una modificazione di una specifica proteina (tipica la

fosforilazione che può attivare/ disattivare una proteina)

I programmi che controllano il destino cellulare primariamente

influiscono sull’espressione genica .

Quelli che regolano le attività cellulari specifiche influenzano

principalmente le proteine funzionali

Sregolazione dell’espressione genica

Deriva da azione degli xenobiotici:

•Su elementi direttamente responsabili della trascrizione

•Su componenti delle vie di trasduzione del segnale

•Su sintesi conservazione e rilascio di molecole segnale

Sregolazione delle trascrizione:

La trascrizione dell’informazione genetica dal DNA al mRNA

è controllata da una interazione tra fattori di trascrizione (TFs)

e le regioni regolatorie o promoter dei geni. Legandosi alla

sequenza nucleotidica in questa regione i TFs attivati facilitano

la formazione di complessi di preinizizione, promovendo la

trascrizione del gene adiacente. Uno xenobiotico può interagire

direttamente con la regione promoter del gene o con il TFs o

con altri componenti del complesso di preiniziazione. Il più

comune modo di interazione è una alterata attivazione dei

TFs.

Funzionalmente Sono conosciuti due tipi si TFs : quelli attivati

da ligando e quelli attivati da segnale

Gli Ormoni come gli steroidei e i tiroidei e delle Vitamine

(retinoidi e vitamina D) influenzano l’espressione genica

legandosi ad un attivatore di TFs ( recettore a ligando).

Vari xenobiotici possono mimare il ligando naturale:

DDT

TCDD

PCB

PAH

Esteri degli Ftalati

Cd2+

ecc….

Principali meccanismi dei segnali di trasduzione iniziati nel citosol o

sulla membrana cellulare Da Mayer,1994

I 4 principali tipi di recettori e trasduzione del segnale

1 canali ionici attivati da ligando (recettori ionotropici)

2 recettori accoppiati a proteina G (recettori metabotropici)

3 recettori ad attività chinasica

4 recettori nucleari

da Annunziato L. e Di Renzo G. “Trattato di Farmacologia capitolo 2 , Idelson-Gnocchi 2010

Da Casaret and Doull’s “Toxicology” Va edizione

Sregolazione della trasduzione del segnale

Le molecole segnale extracellulari come citochine,

ormoni e fattori di crescita attivano dei TFs La

fosforilazione è un comune meccanismo di

attivazione per i TFs che stimolano poi la

trascrizione genica. La fosforilazione di un TFs

attivato da segnale è controllato da protein-chinasi e

fosfatasi. Una qualunque perturbazione del segnale

di trasduzione sul TFs, come per esempio un effetto

sulla fosforilazione/defosforilazione proteica, è in

grado di alterare l’espressione genica regolata dai

TFs.

Tossici che inducono perturbazione dei segnali di

trasduzione sono responsabili probabilmente delle

alterate espressioni geniche dopo esposizioni di cellule a

elevate temperature, metalli pesanti, stress ossidativo e a

sostanze chimiche che formano legami covalenti.

Sostanze ossidanti possono attivare la protein-chinasi C

(PKC)) e alcuni TFs, come AP-1 e NFκB. Geni con

elementi responsivi per questi TFs come le metallotioneine

e le emo-ossigenasi possono essere attivate dai

sopramenzionati stress.

Perturbazioni delle vie di segnale e alterata regolazione

della espressione genica sono pure coinvolte nel

meccanismo di induzione della apoptosi prodotta di alcuni

tossici (es. vari agenti anti tumorali, epatotossine e

derivati alchilici dello stagno)

Sregolazione della produzione del segnale

Per esempio ormoni della parte anteriore dell’ipofisi

hanno effetto mitogeno su ghiandole endocrine

periferiche agendo su recettori superficiali di

membrana. La produzione degli ormoni ipofisari è

controllata da un meccanismo di feedback negativo:

xenobiotici che inibiscono la produzione di ormoni

tiroidei (Es. l’ebicida amitrolo e il metabolita di

fungicidi carbamati, l’etilentiourea) o aumentano

l’eliminazione degli ormoni tiroidei (es. il fenobarbital)

aumentano la secrezione di TSH con conseguente

stimolo mitototico sulla tiroide (gozzo o tumore)

Sregolazione dell’attività specifica in cellule differenziate

Si riferisce principalmente ad interferenze degli xenobiotici

nelle attività cellulari di trasmissione dei segnali .

Il controllo del funzionamento di cellule specializzate, come

muscoli, neuroni, ghiandole, è esercitato da molecole segnale che

agiscono su recettori di membrana che trasducono il segnale

regolando l’entrata del calcio nel citoplasma o stimolando la

formazione enzimatica intracellulare di secondi messaggeri. Il

Calcio o il secondo messaggero altera quindi la fosforilazione di

proteine funzionali, producendo quasi istantaneamente una

modificazione della loro attività e perciò della funzione cellulare

(attività) specifica.

Gli xenobiotici possono produrre effetti contrastanti l’attivita

fisiologica specifica di cellule specializzate disgregando una più

tappe accoppiate alla trasmissione dei segnali. Tipici sono gli

effetti tossici su cellule elettricamente eccitabili.

.

Da Casaret and Doull’s “Toxicology” Va edizione

Alterazione dell’attività di cellule eccitabili (nervose, muscolari, cardiache)

La perturbazione può essere dovuta ad alterazioni in:• Funzionalità del recettore

• Propagazione del segnale

• Processi che terminano il segnale

• Concentrazione del Neurotrasmettitore( NT)

Esempi più comuni:

a) alterazioni del trasporto o della conservazione delle vescicole (es. il veleno della

vedova nera e quello di alcuni serpenti distruggono il pool di vescicole causandone

un rilascio lento e scoordinato)

b) alterazione del rilascio del NT nello spazio intersinaptico (tossina tetanica e

botulinica)

c) alterazione del re-uptake del NT dopo il rilascio (veleno di alcuni serpenti)

d) alterazione del catabolismo del NT dopo il rilascio (es. inibizione dell'Ach­-

esterasi da insetticidi organofosforíci e carbammati)

e) legame col recettore sulla membrana postsinaptica (es. atropina e muscarina)

h) interferenza nella conduzione dell'impulso nervoso lungo l’assone (tossine degli

Artropodi, TTX, DDT, insetticidi clororganici, batracotossina

Più rare sono le alterazione nel processo di sintesi del NT o di uptake dei

precursori del NT nel neurone o nelle vescicole

Ruolo della molecola bersaglio ed effetti (mantenimento delle

strutture e funzioni)

Omeostasi cellulare

Alterazione di meccanismi

interniAlterazone di meccanismi

esterni

Sin

tesi di

AT

P

Reg

olazio

ne

livelli C

a+

+

Sin

tesi

pro

teica

Fu

nzio

ni

micro

tub

ulari

Fu

nzio

ni d

i

mem

bran

a

DANNO

MORTE CELLULARE

Difetti della funzionalità

di sistemi integrati come

sanguinamento/coagulazi-

one o trasporto O2

Alterazioni della permeabilità di membrana

a) alterazioni della struttura di membrana operato da

solventi e tensioattivi

b) blocco o apertura dei canali ionici generalmente

operata da tossine animali e vegetali (tetrodotossina

(TTX), conotossina, batracotossina, piretro,

valinomicina)

c) perossidazione dei lipidi di membrana provocata

da radiazioni, radicali liberi o sostanze che

promuovono la formazione di radicali liberi (es.

paraquat e diquat)

Alterazione della sintesi di ATP

Gli xenobiotici che ne alterano la sintesi possono essere

suddivisi in 4 classi:

1. Inibitori della disponibilità di H+ per la catena ossidativa

mitocondriale (es: gli inibitori della glicolisi o gli inibitori

dell’ossidazione di acidi grassi o del piruvato o del succinato);

2. Inibitori del trasporto di elettroni nella catena ossidativa

mitocondriale (es: bloccanti complesso I, III, o IV come il CN);

3. Sostanze che riducono la disponibilità del O2 come CO o

nitriti;

4. Inibitori della fosforilazione dell’ADP per:

• Blocco dell’ATP sintetasi (es.: il DDT);

• Disaccopiamento della fosforilazione ossidativa per dissipazione del

gradiante H+ (es dinitrofenoli , dinitrocresoli)

Alterazione dell’omeostasi CALCICA

Basse concentrazioni di CA++ intracellulari sono mantenute meccanismi attivi

che pompano il Ca ++ fuori dalla cellula (1) o nel reticolo endoplamatico (2)

oppure con altri trasporti verso lo spazio extracellulare (3) o i mitocondri (4).

Ca++ 1ATP

ADP

ATP

ADP

2REL

4+ + + + + +

+ + + + + +

_ _ _

_ _ __ _ _

_ _ _

MITOCONDRIO

3Na+

3

Ca++= 1000μM

Ca++= 0,1μM

I tossici che aumentano il calcio intracellulare possono agire con tre meccanismi

differenti:

a-Aumento dell’influsso nel citoplasma;

b-Inibizione dell’esporto dal citoplasma;

c-Alterazione dei processi mitocondriali

A-AUMENTO DELL’INFLUSSO NEL CITOPLASMA per:

1. Azione sui canali ad apertura a ligando:

2. Apertura di canali regolata dalpotenziale HO

3. Apertura di pori nella membrana ( es.: Metilmercurio)

4. Lesioni nella membrana (es.: detergenti, enzimi idrolitici, perossidanti

lipidici, tossine citoscheletriche

B-INIBIZIONE DELL’ESPORTO DAL CITOPLASMA per:

1. Legame covalente con proteine o enzimi di membrana (es. CCl4 e CHCl3)

2. Ossidanti dei tioli ( es: l’ebicida DIQUAT)

C-ALTERAZIONE DI PROCESSI MITOCONDRIALI per:

1. Blocco della sintesi di ATP

2. Ossidazione del NAD(P)H (es.: NO )

OMEOSTASI CALCICA

TOSSICO

Alterazione

omeostasi dei tioli

Ossidazione nucleotidi

piridinici

Disturbo sistemi

energetici

AUMENTO Ca++ CITOSOLICO

Attivazione di:

FOSFOLIPASI PROTEASI ENDONUCLEASI

DANNO ALLE

MEMBRANE PROTEOLISIFRAMMENTAZIONE DEL

DNA

MORTE CELLULARE

L’interazione di uno xenobiotico con un enzima può causare

inibizione enzimatica:. questa può essere reversibile o irreversibile

e può portare e sintesi letale. L'inibizione enzimatica irreversibile

generalmente avviene per legame covalente (es. il legame dei

metalli con i gruppi --SH). L'inibizione enzimatica reversibile è

operata da sostanze chimicamente simili al substrato naturale.

Es. di sintesi letale: nel ciclo di Krebs l’acido fluoroacetico si

sostituisce all'acido acetico, dando origine all'acido fluorocitrico

che blocca l'enzima aconitasi responsabile della conversione

dell'ac. citrico in isocitrico.

Es di inibizione reversibile di insetticidi Carbamati su l’enzima

acetilcolinesterasi e irreversibile di insetticid organofosforici

Sono identificabili comunque numerose alttre attività tossiche degli

xenobiotici soprattutto su sistemi enzimatici e sui pigmenti respiratori

Sistemi enzimatici

Interferenza con acidi nucleici.

a) intercalazione o alchilazione con omologhi delle basi e

conseguente interferenza nella duplicazione dei DNA

b) interferenza con la trascrizione (antibiotici o sostanze

prodotte dei piante e funghi che agiscono da inibitori della

RNA polimerasi)

c) fenomeno di misreading ovvero interferenza nella lettura

dell'informazione contenuta nell'RNAm (es. antibiotici

come la streptomicina)

d) interferenza nella sintesi degli acidi nucleici o nella sintesi

delle proteine

Le sostanze che agiscono con gli acidi nucleici sono quasi

sempre mutagene e possono portare anche a carcinogenesi,

teratogenesi e immunosoppressione

Pigmenti respiratori

•Il legame di alcune sostanze (es. CO) all'Hb

impedisce il trasporto di O2.

•L’ossidazione del ferro dell’emoglobina (es,

anilina, fenazone, sulfonamidi) che perde l'affinità

per O2

•La lisi: (es. tensioattivi, Arsina) dei globuli rossi

provoca fuoruscita delI'Hb nel plasma

inattivandola.

Tossicologia molecolare connessa ai metalli

•Gli agenti chelanti, impiegati nel contrastare

l’intossicazione da Hg, As, Pb possono essere

tossici per sequestro di metalli essenziali

• Metalli non essenziali come Pb, Hg, Cd possono

sostituire metalli essenziali nelle proteine di

trasporto, oppure possono alterarne lo stato

ossidativo in molti sistemi enzimatici dove

agiscono da cofattori (es. il Fe è essenziale per i

citocromi)

•Possono interferire in processi immunomediati

• possono associarsi a proteine diventando

determinanti antigenici.

Reazioni su sistemi complessi:•Sistema Immunitario: inibizione o iperattività,

connesso anche con reazioni allergiche e

fotoallergiche

•Sistemi ormonali: molte sostanze chimiche

provocano lesioni ad organi endocrini o inducono

formazioni di tumori. Anche i Distruttori Endocrini

sono molecole che agiscono sui sistemi ormonali

•Apparati e processi riproduttivi : diminuzione

della fertilità da clororganici, diossine, estrogeni,

tensioattivi; effetti letali sugli embrioni; effetti

teratogeni; induzione di malattie genetiche

•CARCINOGENESI CHIMICA

RISPOSTE TOSSICHE DEL SISTEMA IMMUNITARIO

Azione TOSSICI

IMMUNODEPRESSIONE

Idrocarburi aromatici alogenati,

PCB, PBB, TCDD, TCDF, PAH,

Metalli (Pb, As, Hg, Cd, Be, Pt),

Pesticidi (Organofosforici, DDT,

organostannici, Carbammati)

Uretano, Fumo di tabacco, Asbesti,

Irritanti polmonari (Formaldeide, Silicati,

Etilendiammina), Gas ossidanti( O3, SO2,

NO2), Solventi organici ( CCl4),

Immunodepressori, anti-AIDS, citochine

ricombinanti, Cannabinoidi, Cocaina,

Oppioidi,

Etanolo, Siliconi

RISPOSTE TOSSICHE DEL SISTEMA IMMUNITARIO

Azione TOSSICI

Ipersensibilità

Antibiotici, Poliisocianati, Anidridi acide,

Metalli( Pt, Co, Ni, Cr, Be)

Pesticidi, Cosmetici, Enzimi, Formaldeide

Tossicità Immunomediata

HgCl2, Acetato di Pb,SiO2, TCDD,

Trinitroclorobenzene, Ciclofosfamide,

Bleomicina,

Olio di paraffina

Malattie Autoimmuni

Metil dopa (anemia emolitica) Idralazina,

Isoniazide, Procainamide, Alotano (Lupus

eritematoso)

Cloruro di vinile, Cristalli di Si

(scleroderma)

Hg (nefropatia glomerulare)

Effetti tossici sul sistema endocrino

Molti organi del sistema endocrino sono vulnerabili ai tossici

particolarmente la tiroide, il pancreas, l’ipofisi, le paratiroidi

ma anche il timo, le surrenali, l’ovaio e i testicoli. Vari tumori,

lesioni e disfunzioni di questi organi sono associate all’uso di

farmaci o all’esposizione a contaminanti, quali Al, idrocarburi

clorurati, bifenili polialogenati, diossine, radiazioni ecc..

Gli “Endocrine Disruptors” sono sostanze presenti

nell’ambiente in grado di alterare la funzione riproduttiva.

Tra questi sono classificate sostanze che producono disfunzioni

gonadiche sia maschili che femminili.

•Gravi alterazioni anche letali sulle cellule (Chemioterapici e

radiazioni)

•Alterata produzione di ormoni.

• Attivazione metabolica (IPA ,Diossine e PCB)

•Agonismo a livello recettoriale (DDT,p-clorofenil-etano)

Alterazioni di sviluppo delle gonadi.

Alterazioni nel comportamento sessuale e nella

Libido.

Alterazioni di processi di Spermatogenesi e/o

Oogenesi.

Alterazione del processo di fertilizzazione.

Alterazione del processo di impianto.

Alterazione di sviluppo embrionale e fetale

(Teratogenesi)

Tossicologia del Sistema riproduttivo

Alterazioni della capacità riproduttiva possono derivare

da:

Effetti specifici sulla capacità riproduttiva degli individui

può spesso avvenire a concentrazioni di xenobiotico

sensibilmente al di sotto della soglia di azione per sintomi

tossici sugli altri organi e sistemi.

Molti xenobiotici possono agire sulla capacità riproduttiva a

causa dei loro effetti come ormono-mimetici o ormono-

inibitori, intervenendo nelle fasi di differenziamento,

maturazione e/o comportamento sessuale.

Altri possono intervenire per tossicità diretta sul prodotto del

concepimento, sull’embrione o sul feto durante le fasi di

differenziamento e sviluppo o dopo la nascita, nel caso del

mammifero, durante il periodo della lattazione.

Maturità sessuale

Liberazione di

gameti

Fecondazione

Trasporto dello

zigote

ImpiantoFetogenesi

Nascita

Sviluppo postnatale

Crescita e

sviluppo

Embriogenesi

Maturazione

dei gameti

Periodo di gestazione umana =267 giorni Periodo di gestazione del ratto =22

giornipre-impianto: 0-6° giorno

Impianto: 6°-7°

Embriogenesi : 7°-56°

Organogenesi: 21°-56°

Fetogenesi: 57°-267°

pre-impianto: 0-5° giorno

Impianto: 4°-5°

Embriogenesi : 7°-17°

Organogenesi: 8°-17°

Fetogenesi: 17°-22°

Differenziazione sessuale

1. Sesso gonadale : determinato dal cromosoma Y che

converte gonadi indifferenziate in testicoli

2. Sesso genotipico : è necessaria la presenza di due

cromosomi X nelle cellule germinali per lo sviluppo delle

ovaia.

3. Sesso fenotipico (genitale) : lo sviluppo dei dotti

genitali e dei genitali esterni è determinato dalle

secrezioni ormonali. La presenza di testosterone secreto

dai testicoli embrionali determina lo sviluppo dei genitali

maschili. Lo sviluppo di quelli femminili dipende

dall’assenza di testosterone.

Lo stadio di sviluppo delle gonadi è estremamente

sensibile a insulti chimici

Esempi di Xenobiotici embrio e feto-tossici nell’uomo

Alcol Sindrome embriofetale da alcol

Iodio in eccesso Disturbi nella maturazione del sistema nervoso

centrale

Metil-Hg Difetti del sistema nervoso centrale

Pb Ritardo mentale

Litio Malformazione di cuore e vasi

CO Ritardo mentale

Radiazioni Acefalia , malformazioni multiple, leucemie

Retinoidi Malformazione dello scheletro, orecchio e del

sistema nervoso centrale

PCB Ritardo mentale e stranezze

TOSSICITÀ DA FALLIMENTO DI

MECCANISMI RIPARATIVI

L’ultima tappa nello sviluppo della tossicità è

l’inadeguato capacità omeostatica/riparativa

Come i danni sono concatenati a cascata dalla molecola

all’organismo anche le funzioni riparative hanno una

gerarchia.

La riparazione influisce in maniera determinante sulla

progressione del danno

Rodanasi (Transulfurasi): enzima mitocondriale

CN- + SO32- SCN- + SO3

2-

Cianuro Tiosolfato Tiocianato Solfito

Reazioni enzimatiche detossificanti

1. Per i nucleofili

a. Coniugazioni con solfati, glucosio, acido glicuronico

b. Ossidazioni catalizzate da monoossigenasicontenenti flavine o da alcol e aldeidi deidrogenasi

c. Specifico meccanismo è la conversione del Cianuro in Tiocianato ad opera della Rodanasi

Il primo meccanismo d’arresto della progressione tossica è

dato dai meccanismi enzimatici di detossificazione cui, in

caso di fallimento, seguono i meccanismi di riparazione del

danno propriamente detti

Questi meccanismi detossificanti enzimatici

possono fallire per :

•Sovraccarico del sistema con esaurimento degli

enzimi o dei cofattori

•Reversibilità di alcune coniugazioni (in particolare

a livello intestinale)

•Generazione di altri intermedi tossici in processi di

coniugazione

Apoptosi a destra (1, 2, 3, 4) e Necrosi a sinistra (5, 6)

1.cellula normale; 2.addensamento cromatina; 3.frammentazione

nucleare e sviluppo di protuberanze; 4.fagocitosi

5.addensamento cromatina e rigonfiamento di organelli; 6.rottura delle

membrane e disgregamento

Da JFR Kerr e BV Harmon, 1991

G0

G2

G1

SM

p53

c Myc

A

Eccessi di APOPTOSI portano alla atrofia degli organi

Eccessi di PROLIFERAZIONE RIPAR ATIVA o errata riparazione producono

fibrosi dei tessuti

Errati rapporti PROLIFERAZIONE/APOPTOSI comportano neoplasia o atrofia

dei tessuti

DEFINIZIONE DI CARCINOGENO

CHIMICO

SOSTANZA CHE INDUCE NEOPLASIA

L’induzione è accertata quando:

1. Si verifica un aumento di incidenza di tumori endemici

2. Si verifica una comparsa precoce di tali tumori

3. Si verifica la comparsa di tumori normalmente non presenti nella specie

4. Si verifica la comparsa di più tipi di tumori nello stesso individuo

L’EFFETTO CARCINOGENO È

PECULIARE RISPETTO AGLI ALTRI

EFFETTI TOSSICI

• È cellularmente ereditabile

• È cumulativo e dilazionato nel tempo

• Una sola grande dose in una sola esposizione è

spesso meno efficace di quando è frazionata in più

esposizioni dilazionate nel tempo

• Il meccanismo d’azione è centrato sulle alterazioni

genetiche

• In molti casi non è identificabile la soglia di non

effetto

Da Casarett and Doull’s “Toxicology” Va edizione

Da A.Gasperi-Campani: “Carcinogenesi in Tossicologia Molecolare e Cellulare”,UTET, 2000

Classificazione di carcinogeni chimici in relazione al loro

meccanismo d’azione negli stadi di sviluppo della

carcinogenesi

• Agente iniziatore: carcinogeno incompleto capace

solo di iniziare cellule normali

• Agente promotore: capace di causare l’espansione

di cloni di cellule iniziate (co-carcinogeno)

• Agente progressore: capace di trasformare cellule

iniziate o quelle nello stadio di promozione in

cellule potenzialmente maligne

• Carcinogeno completo: agente capace di indurre

cancro partendo da cellule normali, che possiede

proprietà di agente iniziatore, promotore e

progressore

Carcinogeno genotossico

Danno al DNA

Replicazione DNA

Mutazione

riparazione

riparazione

silente

Attivazione di

proteine oncogene

TrasformazioneNeoplastica

ESPANSIONE CLONALE

TUMORE

s

o

p

r

a

v

vi

v

e

n

z

a

m

o

r

t

e

Inattivazione di

proteine onco-

soppressori

Carcinogeno non genotossico

+-

+

AGENTI GENOTOSSICI

Carcinogeni inorganici diretti (primari) Nikel, Cromo

Carcinogeni organici diretti (primari) Agenti alchilanti, Sostanze

elettrofile

Carcinogeni indiretti IPA, Nitrosamine

AGENTI EPIGENETICI

Materiali solidi Asbesto, Polimeri

Modificatori ormonali Xenoestrogeni, PCB

Immunosopressori Farmaci antirigetto

Citotossici Acido Nitrilotriacetico

Promotori Esteri del Forbolo, DTT, CHCl3, Saccarina,

Inibitori di Apoptosi o riparazione DNA

Proliferatori dei

perossisomi

Esteri degli acidi Ftalici, Erbicidi

Fenossiacetici

Da Casarett and Doull’s “Toxicology” Va edizione

MODIFICAZIONI AL DNA DA SOSTANZE CHIMICHE O

RADIAZIONI

SISTEMA Meccanismo

Riparo

per

escissione

La riparazione per escissione si avvale dell'azione coordinata di alcuni enzimi costitutivi sempre presenti nella cellula, quali una endonucleasi che incide l’elica del DNA in prossimità delle lesioni prodotte da un agente mutageno, una un esonucleasi che degrada un tratto dei filamento del DNA inciso, una DNA-polimerasi che risin-tetizza il frammento degradato utilizzando come stampo il filamento opposto integro, ed infine una DNA-ligasi che, ristabilisce !a continuità fra il segmento neosintetizzato e quello originale. E’ un sistema di riparo altamente fedele !!

SOS-Repair

Questo sistema opera in condizioni d'emergenza ma conminor precisione, introducendo un gran di mutazioni ; vienedenominato appunto S.O.S per l'eccezionalità dei casi in cui èchiamato ad operare, quando cioè venga postal'alternativa di morire oppure di sopravvivere anche a costo dìmutare.

Fotoriatti-

vazione

Si basa sull'azione della foto-liasi, un enzima che utilizza la

luce visibile. come fonte di energia per scindere i fotodimerigenerati dalle radiazioni UV.

Riparo post

replicativo

E’ una polimerasi di controlio e correzione della replicazione (Proof-reading) che provvede ad eliminare la sequenza di basi scorrette basandosi sulla sucessione del filamento parentale, tramite la semplice risintesi dei tratti di DNA eliminati.

Probabili agenti progressori

Agente Attività

iniziante

Attività

Clastogenica

Attività

Carcinogena

Sali di As - + +

Asbesto ? + +

Benzene - + +

Idrossiurea - + +

Fumo + + +

La progressione è un processo irreversibile denotato da

instabilità cariotipica

Da Casarett and Doull’s “Toxicology” Va edizione

Classificazione di sostanze carcinogene

A- sufficiente evidenza nell’uomo;

B1- limitata evidenze nell’uomo, ma sufficiente nell’animale;

B2- limitata evidenza nell’animale e molto limitata o nulla nell’uomo;

C- limitata evidenza nell’animale;

D- potrebbero aver effetti carcinogeni nell’uomo ma non hanno sufficienti o non hanno per nulla studi adeguati.