LEZIONE DI FARMACOLOGIA

➢BIOTRASFORMAZIONE

➢INTERAZIONE CON I BERSAGLI

➢RECETTORI PER I LIGANDI ENDOGENI

➢TEST IN ITINERE

Miriam Melis, PhD

BIOTRASFORMAZIONEIl processo di biotrasformazione delle sostanze e in particolare dei farmaci è detto metabolismo dei farmaci.

Il metabolismo ha lo scopo di modificare la struttura molecolare delle sostanze estranee in composti più polari e più idrosolubili, aumentandone l’escrezione.

I tre processi metabolici principali sono:

o Attivazione → attivazione metabolica (profarmaci)

o Inattivazione → disattivazione metabolica

o Induzione enzimatica → cambio di attività farmacologica

SISTEMI METABOLICI COINVOLTI NEL METABOLISMO DEI FARMACI

➢Enzimi microsomiali* epatici (ossidazione, coniugazione)

➢Enzimi microsomiali* ubiquitari (cervello, polmoni, rene, muscolo, tenue, retto, placenta, cute)

➢Enzimi non-microsomiali epatici (proteasi, lipasi, MAO, es. acetilazione, solfatazione, idrolisi, ossido-riduzione)

❑ Tali sistemi sono dotati di scarsa selettività e attività catalitica, compensati però da un’elevata quantità e distribuzione

*sistema ossidasico a funzione mista

REAZIONI DI BIOTRASFORMAZIONEIl metabolismo dei farmaci si attua attraverso due fasi

Farmaco Metabolita(attivo/inattivo)

Coniugato

Assorbimento Metabolismo Eliminazione

Fase I Fase II

ConiugatoFarmaco

Farmaco

lipofilo idrofilo

BIOTRASFORMAZIONELe reazioni di fase I o di FUNZIONALIZZAZIONE hanno la finalità di inserire o di mettere in evidenza nella molecola gruppi funzionali come –OH, -NH2, -SH, -COOH.

Sono reazioni di fase I: ossidazione, riduzione, idrolisi, idratazione.

Le reazioni di fase II o di CONIUGAZIONE usano i gruppi funzionali inseriti nelle reazioni di fase I come un “terminale” per la coniugazione con molecole endogene.

Sono reazioni di fase II: la coniugazione con l’acido glucuronico, l’acetilazione, la coniugazione con il glutatione.

REAZIONI DI BIOTRASFORMAZIONE

L’equilibrio tra le reazioni di Fase I e Fase II definisce l’intervallo di tempo durante il quale le sostanze intermedie biotrasformatepersistono nell’organismo.

REAZIONI DI BIOTRASFORMAZIONE

REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONELe reazioni di ossidazione a sede microsomiale non sono selettive nei confronti del substrato.

Sono tutte reazioni dipendenti da una catena enzimatica di trasporto elettronico che ha come terminale il citocromo P450

L’uomo ha 18 famiglie di geni del CYP450 e 43 sottofamiglie

➢Gli enzimi CYP sono prevalentemente localizzati nel fegato: metabolizzano farmaci e altri xenobiotici.

➢Tre famiglie sono dedicate al metabolismo dei farmaci:CYP 1,2 e 3

Le altre 14 famiglie sono coinvolte nelle normali funzionicellulari, incluse la biosintesi o degradazione di:

• Colesterolo

• acidi biliari

• ormoni steroidei

• vitamina D3

• metaboliti dell’acido arachidonico

L’ISOFORMA CYP 450 3A4

Tra le isoforme enzimatiche questa è la responsabile di ~60% del metabolismo dei farmaci:

Rappresenta il ~28% del CYP450 totale.

La sua funzionalità viene inibita da:

• Antibiotici (es. eritromicina, claritromicina)

• Antifungini (es. ketoconazolo, itraconazolo)

• Antidepressivi (es.nefazolone)

• Inibitori della proteasi (Anti-HIV)

I bioflavonoidi presenti nel succo di pompelmo ne riducono la sua espressione, così come la curcumina e il tè verde!!

FATTORI CHE INFLUENZANO IL CYP450 (1/3)➢I livelli e l’attività di ciascun enzima variano da individuo a individuo e in rapporto a fattori ambientali e genetici

❑L’attività può risultare diminuita a causa di:

▪mutazioni che bloccano la sintesi dell’enzima o determinano la produzione di enzima inattivo o poco efficiente dal punto di vista catalitico

▪influenze ambientali (infezioni, esposizione a xenobiotici) che deprimono la sintesi di CYP 450

▪esposizione a sostanze che inibiscono o rendono inattivo l’enzima presente

FATTORI CHE INFLUENZANO IL CYP450 (2/3)

❑Mediante inibizione del CYP450 uno xenobiotico può:

▪bloccare la biotrasformazione di un altro e modificare la risposta farmacologica o tossica della seconda molecola

▪riprodurre effetti analoghi a quelli di un deficit genetico (ampia variabilità interindividuale nel metabolismo e quindi nella tossicità delle sostanze chimiche)

FATTORI CHE INFLUENZANO IL CYP450 (3/3) ➢Età

➢Sesso

➢Dieta:

•Induttori: Cruciferae (es. cavolfiore, broccoli, rape verdi)

•Inibitori: bioflavonoidi, curcumina, tè verde

➢Farmaci:

•Induttori: barbiturici, anticonvulsivanti, antistaminici, assunzione cronica di bevande alcoliche

•Inibitori: estrogeni, cimetidina, anticoagulanti, assunzione acuta di bevande alcoliche

➢Alterata funzionalità epatica (es. digiuno, epatiti, tumori epatici)

➢Fattori genetici

BIOTRASFORMAZIONE DEL BENZO(A)PIRENE (1/3)➢Il benzo(a)pirene è un forte cancerogeno che subisce fenomeni di idrolisi dall’epossido-idrolasi.

➢Il metabolita (Benzo(a)pirene 7,8-diidrodiolo-9,10-ossido) è la molecola cancerogena di numerosi idrocarburi policiclici aromatici (IPA).

✓Il metabolita è resistente alle epossido idrolasi, a causa dell’impedimento sterico che esercita il gruppo di-idrodiolico.

✓Può formare legami covalenti con il DNA e provoca mutazioni e tumori alla cute.

BIOTRASFORMAZIONE DEL BENZO(A)PIRENE (2/3) ➢L’importanza dell’epossido idrolasi microsomialenella conversione degli idrocarburi aromatici policiclici in metaboliti cancerogeni diolo epossidi trova conferma da studi su topi KO per tale enzima, i quali sono meno sensibili rispetto al WT alla tossicità di tali sostanze.

➢Il benzo[a]pirene-7,8-diidrodiolo-9,10-diidroossido può legarsi al DNA attraverso, ad esempio, l’adenina mediante attacco nucleofilo

BIOTRASFORMAZIONE DEL BENZO(A)PIRENE (3/3)

REAZIONI DI FASE IISono reazioni enzimatiche di biosintesi per mezzo delle quali uno xenobiotico o un metabolita derivatodalle reazioni di fase I si lega in modo covalente con una molecola endogena mediante uno dei seguenti gruppi funzionali:

-OH,-COOH, -NH2, –SH

Reazione Substrato

endogeno

Enzima Tipo di substrato

Glucoroconiugazione Ac. UDP glucuronico UDP-glucuronil

transferasi

Fenoli, glicoli, morfina,

diazepam, digossina

Acetilazione Acetil-CoA N-acetil transferasi Amine, isoniazide,

clonazepam

Glutatione GSH-S-transferasi Epossidi Acido etacrinico

Glicina Glicina Acil-CoA glicina

trans.

Acidi carbossilici:

salicilico, nicotinico

Solfato Fosfoadenosil

fosfosolfato

Sulfotransferasi Fenoli, alcoli, amine:

paracetamolo,

metildopa

Metilazione S-adenosil

metionina

Transmetilasi Dopamina, adrenalina,

istamina

REAZIONI DI FASE II

REAZIONI DI FASE II

In generale i coniugati sono molecole polari facilmente eliminabili.

Il meccanismo di reazione prevede consumo di energia che viene utilizzata per attivare i cofattori ad intermedi ad alta energia.

METABOLISMOPrincipio attivo

Reazioni di fase IOSSIDAZIONE

RIDUZIONE IDROLISI

Metaboliti di fase I-OH

-COOH-NH2-SH

Reazioni di fase IICONIUGAZIONE

Metaboliti coniugati

ELIMINAZIONE

INDUZIONE ENZIMATICA (1/2)Definizione: Aumento reversibile del contenuto di enzimi epatici capaci di metabolizzare certi farmaci che può essere causato da:• somministrazione dei farmaci stessi• somministrazione di altri farmaci • abitudini alimentari o dieta• esposizione a tossine ambientali

L’induzione di enzimi di biotrasformazione e di trasportatori di efflusso è un processo adattativo recettore-mediato, che consente di aumentare la velocità di eliminazione di xenobiotici in situazioni in cui il livello di esposizione alla sostanza è particolarmente elevato.

INDUZIONE ENZIMATICA (2/2)➢ L’ induzione può causare un aumento della velocità del metabolismo dei farmaci con conseguente diminuzione dei loro effetti (es. tolleranza di tipo farmacocinetico).

➢Può anche potenziare l’azione farmacologica o la tossicità nel caso il metabolita sia dotato di attività terapeutica o tossica.

➢Come causa di ADR, è meno pericolosa dell’inibizione poiché abbassa i livelli ematici del farmaco. L’induzione ha molta importanza quando si somministrano farmaci salvavita.

L’esempio del succo di pompelmo

✓Il succo di pompelmo (SP) aumenta il picco plasmatico della concentrazione del farmaco, non la cinetica di eliminazione

✓Il SP riduce il rapporto AUC del metabolita/AUC del farmaco

✓L’effetto del SP dura ~4 h, in quanto richiede una nuova sintesi enzimatica

✓L’effetto è cumulativo e altamente variabile tra gli individui.

Metaboliti tossici: l’esempio del paracetamolo

Il paracetamolo viene biotrasformato in un metabolita tossico: il parabenzochinone.

▪Se il paracetamolo viene somministrato a dosi terapeutiche il metabolita viene coniugato con il glutatione (GSH) ed eliminato.

▪Se il paracetamolo viene somministrato a dosi troppo alte il metabolita tossico, dopo avere saturato tutto il GSH disponibile, si lega alle proteine e provoca epatotossicità (morte in 3-5 giorni).

METABOLITI ATTIVI: I PROFARMACI

Vi è la possibilità che un farmaco non sia di per sè attivo e che lo diventi solo dopo la sua biotrasformazione.

In questo caso le biotrasformazioni prendono il nome di bioattivazioni e il farmaco viene definito profarmaco.

Nel caso dei profarmaci, l’attività farmacologica dipendedalle capacità metaboliche dell’individuo.

FARMACODINAMICAINTERAZIONI FARMACO -RECETTORE

RECET TORI

AT TIVITÀ INTRINSECA E AFFINITÀ

INTERAZIONE FARMACO-RECETTORE (1/3)

L’interazione tra un farmaco e un recettore segue la legge dell’azione di massa, cioè la velocità di una reazione chimica è proporzionale alla concentrazione delle sostanze partecipanti

Il farmaco interagisce con un recettore e l’effetto risultante è proporzionale al numero dei recettori occupati.

INTERAZIONE FARMACO-RECETTORE (2/3)

Il legame farmaco-recettore è:

➢ Saturabile➢ Stereospecifico➢ Reversibile

L’interazione è mediata da legami chimici deboli come :➢ ponti idrogeno➢ forze di Van Der Waals➢ interazioni idrofobiche

•Il complesso RX, eventualmente RX*, è l’unica entità in grado di iniziare la serie dieventi che porta all’effetto finale, mentre R ed X di per sé sono inattivi.

INTERAZIONE FARMACO-RECETTORE (3/3)

R+XEvento biochimico intracellulare

RX*Risposta biologica

•SATURABILE: un N finito di recettori/cellula (o per peso del tessuto),rilevabile attraverso una curva di saturazione del legame. Aggiungendouna quantità crescente di farmaco, il N di molecole legate dovrebbeformare un plateau in funzione del N di siti di legame presenti.•SPECIFICO: Il farmaco deve essere strutturalmente complementare alrecettore.•REVERSIBILE: Il farmaco dovrebbe legarsi al recettore e quindidissociarsi. Questa proprietà distingue l’interazione FARMACO-RECETTORE da quella ENZIMA-SUBSTRATO.

PROPRIETA’ LEGAME FARMACO-RECETTORE

CLASSIFICAZIONE DEI RECETTORI1. Recettori canali

2. Associati a proteine G

3. Con attività tirosino-kinasica

4. Associati a tirosino-kinasi

5. Con attività guanilato-ciclasica

6. Con attività tirosino-fosfatasica

7. Con attività serino/treonino kinasica

8. Per le citochine

9. Per le integrine

10. Etc.

1. Per ormoni steroidei

2. Per i retinoidi

3. Per gli ormoni tiroidei

4. Altri

Recettori di membrana

Recettori intracellulari

CLASSIFICAZIONE DEI RECETTORI

Recettori di membrana →

Recettori intracellulari →

CLASSI DI RECETTORI

▪ Son proteine citosolubili capaci di legare il DNA modulando la trascrizione genica

▪Sono coinvolti nell’espressione genica della cellula bersaglio

▪ Ligandi endogeni: ormoni steroidei, tiroidei, vitamina D, vitamina A, iacidoretinoico

RECETTORI INTRACELLULARI (1/2)

RECETTORI INTRACELLULARI (2/2)

✓ Dimero inattivo✓ Il legame con l’agonista causa il

distacco delle proteine inibitorie ✓ la formazione del complesso

recettore-DNA-polimerasi✓ Effetti biologici

RECETTORI INTRACELLULARI: XENOSENSORI (1/2)

➢Xenosensori: proteine implicate nell’induzione di enzimi di biotrasformazione (CYP).

➢Induzione enzimatica:modificazione nella velocità di eliminazione di xenobiotici quando il loro livello è elevato.

➢Tolleranza farmacocinetica

PRP: pregnane X receptor; RXR: retinoid x receptor

RECETTORI INTRACELLULARI: XENOSENSORI (2/2)

➢I principali xenosensori sono:

▪Recettore degli idrocarburi arilici (AhR)▪Recettore costitutivo dell’androstano

(CAR)▪Recettore X del pregnano (PXP)▪Recettore attivato dal proliferatore dei

perossisomi (PPAR)▪Fattore nucleare correlato all’eritroide-

derivato 2 (Nrf2)

RECETTORI INTRACELLULARI: TCDD (1/2)

➢Le fonti di TetraCloroDibenzo-p-Diossina sono:▪ Inceneritori di rifiuti urbani e industriali▪Scarico auto (Pb)

➢Classificato nel Gruppo 1 carcinogeno (IARC)

➢Meccanismo d’azione:▪Alta affinità per AhR e rilascio della Hsp90 →

TCDD-AhR▪TCDD-AhR migra nel nucleo dove si lega a

ARNT→ induce al trascrizione di DRE (DioxinResponive Elements)

RECETTORI INTRACELLULARI: TCDD (2/2)

➢ Meccanismo d’azione:▪ Tossicità ∝ alta affinità per AhR (Kd ~ nM)▪ Le prove a favore di questa ipotesi sono:

a.Le differenze nella tossicità nelle differenti specie di roditori sono dovuti a polimorfismi dell’AhR. b.I topi AhR-KO sono resistenti alla tossicità da TCDD, mentre topi transgenici per una forma attiva di AhR mostrano spontaneamente numerose anomalie che ricordano i segni di tossicità da TCDD.c.Il blocco del recettore AhR riduce gli effetti inducenti della TCDD e i segni di tossicità.

DIOXIN POISONING (1/2)

DIO

XIN

PO

ISO

NIN

G (2

/2)

RECETTORI DI MEMBRANA

RECETTORI LEGATI AI CANALI IONICI (ionotropici) (1/2)

▪ I RECETTORI-CANALE sono complessi macroproteici trans-membranari che formano un canale ionico aperto in seguito al legame con il neurotrasmettitore o con farmaci agonisti.

▪ L’attivazione di questi recettori produce un cambiamento delle concentrazioni ioniche all’interno della cellula.

▪ Esempi: recettore GABAA, recettore nAChR.

RECETTORI LEGATI AI CANALI IONICI (ionotropici) (2/2)

▪ I RECETTORI-CANALE possono essere permeabili sia a cationi che anioni → diversa risposta biologica

▪ I farmaci attivi su questi recettori possono avere come bersaglio il sito di legame dell’agonista naturale (D-tubocurina) o siti allosterici (BDZ).

▪ I recettori accoppiati alle proteine G esplicano il loro effetto attraverso delle particolari strutture dette PROTEINE G (Gp).

▪Le Gp son proteine trasduttrici del segnale iniziato dal legame farmaco-recettore e sono associate ad un enzima effettore.

▪ L’enzima effettore produce una serie di molecole (secondi messaggeri) provocando un’ amplificazione del segnale e un effetto cellulare. AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE!!!

▪ Esempi: recettori mAChR, recettori b-adrenergici

RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G: (i recettori metabotropici)

➢Sono formati da un unico filamento proteico che attraversa 7 volte lamembrana plasmatica.➢La trasduzione del segnale avviene attraverso Gp localizzate sul lato internodella membrana: le Gp sono chiamate così per la capacità di legare il GTP esuccessivamente idrolizzarlo grazie ad un’attività GTPasica intrinseca.

➢Le Gp sono costituite datre subunità (a, b e g): lasubunità a in grado dilegare ed idrolizzare il GTP.

In condizioni di riposo lasubunità a è legata al GDP.

RECETTORI METABOTROPICI (1/2)

Esistono diversi sottotipi di proteine G in base all’attività dellasubunità a :

➢proteine G stimolanti (Gas)

➢proteine G inibitorie (Gai)

➢proteine Gi/Gq

RECETTORI METABOTROPICI (2/2)

Le proteine G sono eterotrimeri che legano e idrolizzanoil GTP:

➢Passano dalla forma inattiva (G-GDP) a attiva (G-GTP)

➢Trasduttrici del segnale

RECETTORI METABOTROPICI: le proteine G

RECETTORI METABOTROPICI: i secondi messaggeri

APOLARI

• DAG

POLARI

• cAMP

• cGMP

• IP3

• Ca2+

GAS

RECETTORI METABOTROPICI: cAMP (1/2)

Le proteine Gs attivano l’Adenilato Ciclasi (AC) che :

➢ATP → cAMP

➢cAMP degradato dalla PDE

➢L’cAMP attiva la PKA

➢La PKA attiva CREB (cAMPResponse Element Bindingprotein)

RECETTORI METABOTROPICI: cAMP (2/2)

Le proteine Giinibiscono l’ AC con

➢↓ livelli di cAMP

RECETTORI METABOTROPICI: DAG e IP3

Le proteine Gq generano:

➢DAG, che resta attaccato alla membrana e attiva la PKC, la Ser/Thr-chinasi, oltre a produrre mediatori lipidici

➢IP3, che diffonde e regola i livelli di Ca2+

intracellulari e quelli di diverse proteine (es., CaMKII).

RECETTORI METABOTROPICI: cGMP

La Guanilato Ciclasi genera cGMP:

➢Esistono due isoforme, GC solubile (sGC) target del NO e di membrana (pGC) target del peptide natriuretico atriale

➢cGMP regola l’attività di diverse proteine (PKG, CNG).

RECETTORE MUSCARINICO

➢Il recettore muscarinico si distingue in 2 classi:

1.Quelli che sono legati a proteine Gs

2.Quelli che sono legati a proteine Gq

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