TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di

ISOLARE

AMPLIFICARE frammenti di DNA

SEQUENZIARE

Perché manipolare i geni?

1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica;

2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovraespressione;

3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine;

4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici

PROCEDURA di CLONAGGIO

ISOLAMENTO del gene

INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO

INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE VIVENTI per propagarlo

Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell’unione di sequenze di DNA in modo preciso….…..tutto ciò si ottiene con l’ausilio di ENZIMI

Cosa serve per un clonaggio

• Gene (DNA di interesse)

• Enzimi di restrizione

• DNA ligasi

• Vettore

• Cellula ospite

OH

OH P

P

OH

OHP

P

DNA LIGASI

Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5’ di una estremità ed il gruppo ossidrilico 3’ della catena adiacente.

L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi perché stabile e poco costosa.

CARATTERISTICHE DELLA REAZIONE:

Presenza di ATP

10° C o.n. oppure temperatura ambiente, poche ore

OH

POH

P

BamHI

5’-G GATCC-3’3’-CCTAG G-5’

OH

P OH

P

EcoRI

5’-G AATTC-3’3’-CTTAA G-5’

La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendo l’energia cinetica delle molecole, riduce la possibilità che le estremità appaiate si separino prima di venir stabilizzate dalla ligazione.

DNA LIGASI

OH

OH P

P

OH

OH

P

P

OH

OH P

P

OH

OHP

P

FOSFATASI ALCALINA

OH

POH

P

BamHI

5’-G GATCC-3’3’-CCTAG G-5’

HpaI

5’-GTT AAC-3’3’-CAA TTG-5’

OH

P OH

P

OH

OH

Blunt ends ligationoppure trattamento conTransferasi terminale

OH

OH

Sticky ends ligation

OH

OH P

P

+ dATP

OH

OH+ dTTP

AAA P

P AAA

TTT

TTT

Sticky ends ligation

Vettori di clonaggio

• Plasmidi

• Fagi

• Cosmidi

• Yac

• Bac

PLASMIDI

Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide deve avere:

Dimensioni contenute

Un sito di origine della replicazione

Un gene per la resistenza a un antibiotico

Siti unici di restrizione (polilinker)

Piccole molecole di DNA batterico extracromosomico, circolare.

In natura conferiscono vantaggi selettivi ai ceppi che li contengono.

Ingegnerizzati per l’uso di laboratorio.

TRASFORMAZIONE delle CELLULE BATTTERICHE:Inserimento del plasmide nella cellula ospite

Cellule competenti

Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide formeranno delle colonie.

Curva di crescita di E. coli

INTERVALLO (Lag phase)

I batteri vengono diluiti nella coltura iniziale; la divisione procede lentamente in quanto le cellule si stanno adattando al terreno fresco.

FASE LOGARITMICA

4 - 5 ore

I batteri crescono esponenzialmente.

10 - 11 ore

FASE STAZIONARIA

La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.

Tempo (h)D

ensi

tà c

ellu

lare

(O

D6

00)

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0

0 5 10 15 20

PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO

LISI ALCALINA

1. RISOSPENSIONE

E. coli

2. LISI

NaOH / SDS

RNasi

DNA cromosomico

DNA plasmidico

Centrifugazione

3. NEUTRALIZZAZIONE

KAc

Precipitato contenente DNA genomico, proteine, detriti cellulari

Supernatante contenente il DNA plasmidico

DNA cromosomico DNA plasmidico

Bromuro d’etidio Bromuro d’etidio

Svolgimento della doppia elica e diminuzione della densità

idrodinamica

Svolgimento della doppia elica compensato dall’introduzione di

supereliche

...PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO

ULTRACENTRIFUGAZIONE in gradiente di densita’ di CsCl in presenza di EtBr

Il superavvolgimento indotto nel DNA plasmidico dall’intercalazione del bromuro d’etidio fra le basi ne impedisce progressivamente il legame

rendendo la densità idrodinamica del DNA plasmidico maggiore di quella del DNA cromosomico.

TProdotto di PCR

P

OH

O

Tyr-274

Topoisomerasi

PO

Tyr-274

OH

Riepilogo di un procedimento di clonaggio

Libreria genomica

Quando si clona l’intero genoma di un organismo si dice che si costruisce una libreria (library) genomica

La miscela di frammenti che contiene tutte le sequenze codificanti costituisce la “libreria di cDNA”.

Libreria di cDNA (DNA complementare)

AAAAAAAA

AAAAAAAATTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

TTTTT

AAAAA

AAAAA

Caricamento Lavaggio Eluizione

AAAAAAAA

AAAAAAAA

AAAAAAAA

1-Estrazione di mRNA

AAAAAAA 3’ mRNA5’

+ oligo dT

3’ TTTTTTT 5’

AAAAAAA 3’ mRNATTTTTTT 5’

5’

AAAAAAA 3’ mRNATTTTTTT 5’ DNA

5’3’

3’TTTTTTT 5’

Formazione della forcina

TTTTTTT 5’3’AAAAAA

A

3’TTTTTTT 5’

Sintesi del filamento complementareDna polimerasi

3’TTTTTTT 5’AAAAAAA

cDNAA

Rimozione della forcina con la nucleasi S1

+ trascriptasi inversa

Rimozione del mRNA(degradazione alcalina o calore)

2-Sintesi del cDNA (1° metodo)

Sintesi del cDNA (2° metodo)

• genoma di 1.85 x 108 bp • dopo digestione, abbiamo avuto frammenti di circa 20.000 basi che

possiamo clonare nel vettore opportuno. • Se ogni tratto del genoma fosse presente una sola volta, basterebbero

10.000 cloni per rappresentare tutto il genoma.

• Esiste una formula che permette di calcolare il numero dei cloni necessari per avere un alta probabilità che tutti frammenti siano rappresentati:

• n = ln(1-p)/ln(1-f)

• f = 20.000 bp/185.000.000 = circa 10-4 cioè ogni inserto di 20 kb è 1/10.000 del genoma totale.

• La probabilità p può essere scelta come 95%, 99%, 99.9% a seconda della sicurezza che si desidera avere.

• Nei tre casi il numero dei cloni sarà:• 30.000, 4-50.000, 70.000

SCREENING mediante IBRIDIZZAZIONE SU PLACCA

Placche o colonie

Punti di riferimento per l’orientazione della replica al termine dell’esperimento

•• •

•

• •Replica su filtri di nitrocellulosa(conservare le piastre originali)

Denaturazione, neutralizzazione e

legame del DNA al filtro

•

• •

Ibridizzazione con sonda marcata e lavaggio della sonda non legata

32P

32P

•

• •

32P32P 32P

32P

Sonda non legata

Sonda ibridizzata

•

• •Autoradiografia

Autoradiogramma che mostra la posizione delle

sonde ibridizzate

Recupero delle placche positive dalla piastra

originale

SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE

Una sonda è un filamento di DNA complementare a quello che si vuole isolare dalla biblioteca.

STRATEGIE DI SINTESI:

E’ nota la sequenza amminoacidica della proteina codificata dal gene

Si sintetizzano chimicamente le sequenze nucleotidiche (degenerate) più appropriate

osi amplifica un frammento del gene di interesse mediante

PCR

E’ nota la sequenza nucleotidica del gene di

interesse

CASO 1: CASO 2:

Si predice la sequenza nucleotidica che dovrebbe codificare per quella proteina

Nello screening di una libreria genica il cDNA può essere utilizzato come sonda per l’isolamento del corrispondente gene.

Altri vettori di clonaggio

• Fagi

• Cosmidi

• Yac (yeast artificial chromosome)

• BAC

• I fagi (o batteriofagi) sono strutture biologiche complesse in grado di fissarsi alla parete batterica e quindi introdurre il loro DNA all'interno del batterio. (trasfezione) . Il fago più usato e conosciuto è il fago lambda.

• Il fago è un fago temperato, ha un peso molecolare di 31.106 Da ed è lungo 48.502 bp

• Il DNA isolato da alcune particelle virali è a doppio strand con due estremità a singolo filamento di 12 nucletotidi complementari fra loro, chiamati siti cos. Questi siti permettono al DNA di circolarizzare dopo l’infezione della cellula ospite.

• 5’ GGGCGGCGACCTCGC---------------------- ACG 3’• GCG---------------------TCGCCCGCCGCTGG• La mappa genetica del fago comprende circa 40 geni che possono essere

suddivisi in tre gruppi funzionali: • la parte sinistra, comprendente i geni da A a J, codifica per proteine strutturali della

testa e della coda.• la parte centrale, contiene geni responsabili per la lisogenia, cioé il processo che

porta all'integrazione del DNA virale ed altri processi ricombinativi. Gran parte di questa regione non é essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la costruzione di vettori.

• la parte destra contiene geni coinvolti nella replicazione del DNA e nel ciclo litico (S, R), geni regolatori (cI, cII, cIII, cro, N, Q) (Fig. 33)

ASSORBIMENTO

CICLO LITICO CICLOLISOGENICO

REPLICAZIONEPRECOCE

(bidirezionale)

REPLICAZIONETARDIVA

(modello circolare)

CON CATAMERO

TAGLI AD OPERAPROTEINA A

INCAPSIDAZIONE

PARTICELLAFAGICA

MATURA

LISI DELLAPARETE BATTERICA

R

A

A

R

COS

DNAE. coli

RICOMBINAZ.

CROMOSOMAE. coli

GAL bio

ATT

ATT ATT

bioGAL RICOMBINAZ.

AR COS J

REPLICAZIONE CONDNA CROMOSOMICO

CICLO LISOGENICOAd alto stato di infezione la cellula contiene alte concentrazioni di cIII:

Hfl è inibitacII stimola la trascrizione di cI e la proteina

IntegrasicI è un repressore dei geni del ciclo litico e

blocca la sintesi di N, O, P e Q legandosi agli operatori OL e OR, bloccando il ciclo litico

CICLO LITICOA basse concentrazioni di cIII:

Hfl non inibita

riduce l’attività o la quantità di cIIblocco della sintesi di cIla sintesi di N, O, P, Q non è più bloccata

Proteine di assembaggio

Proteine di assembaggio

pD

Geni fagici Geni fagici

Ceppo lisogenico di E.coli portatore della mutazione amber BHB2688. L’induzione porta alla produzione di

di code di , di proteina D e delle proteine di assemblaggio,ma non di proteina E. Non si formano i precursori delle teste.

Ceppo lisogenico di E.coli portatore della mutazione amber BHB2690. L’induzione porta alla produzione di

di code di , dei precursori delle teste e delle proteine di assemblaggio,ma non di proteina D.

L’impaccamento è impedito a causa della mancnaza di proteina D

LISI E MISCELAZIONE DEGLI ESTRATTI + AGGIUNTA DI ATP + DNA CONCATAMENRIZZATO

Proteine di assembaggio

pD+ + +

COS COS COS COS

PARTICELLA FAGICA MATURA

IMPACCAMENTO IN VITRO

• La regione tra i geni J e N del genoma di non è essenziale per la crescita litica. In linea di principio, un vettore privo di questa regione potrebbe contenere circa 14.500 bp di DNA estraneo

• Nella testa del fago può trovare posto fino al 105% della lunghezza del suo DNA e, inoltre, esistono nei bracci di altre regioni non essenziali che possono essere rimosse.

• Considerando tutto questo si ottiene un valore massimo di circa 22 Kb di DNA estraneo inseribile.

• Esiste anche un limite inferiore, pari al 75% del genoma di l, pari a circa 37 Kb, al di sotto il DNA non viene impaccato e il non è vitale.

• Esistono due tipi di vettori • * I vettori d'inserzione • * I vettori di sostituzione

DNA VIRALE come VETTORE DI CLONAGGIO

Regione non essenziale (circa

20 Kb)

Eliminazione del DNA non essenziale

DNA da clonare

DNA ricombinante

Teste e code del

virus

Assemblaggio in vitro delle

particelle virali

Il DNA virale entra nelle cellule, viene replicato e dirige la sintesi delle proteine virali. La lisi delle cellule rilascia le nuove particelle virali assemblate Recupero delle particelle virali e

isolamento del DNA clonato

Infezione dei batteri

DNA virale

Un vettore comunemente utilizzato è il batteriofago , lungo 49 Kb.

IMPACCHETTAMENTO del DNA VIRALE

Il DNA virale a doppia elica entra nelle cellule batteriche durante l’infezione come molecola lineare

Estremità coesive Estremità

coesive All’interno della cellula,

le estremità si appaiano originando una molecola di DNA

circolare

Sito cos

Concatameri di copie di DNA virale

Cicli ripetuti di replicazione con il

meccanismo del cerchio rotante

Il DNA codifica per le proteine della testa e della coda del virus

Il DNA viene inserito nelle teste del virus e tagliato a livello del sito cos

Sono aggiunte le

code Particella virale infettiva.I virus sono rilasciati per lisi delle cellule e possono infettare altre cellule batteriche.

5’•

COSMIDI

Sono PLASMIDI, ma contengono, oltre alle caratteristiche essenziali di un plasmide, anche un

SITO COS

La presenza di questo elemento è determinante per consentire

l’inserimento della molecola di DNA ricombinante nella testa del

virus che, a sua volta, la inietta in una cellula batterica per

infezione.

c) cosmidi

Sono plasmidi che utilizzano la capacità del batteriofago lambda di impacchettare lunghi frammenti di DNA lineare all’interno del capside, di aderire alla superficie delle cellule batteriche e di iniettare il loro contenuto all’interno del batterio.

Rispetto al batteriofago lambda, può contenere un inserto di DNA di dimensioni maggiori (45 kb).

Il cosmide circolarizza e si comporta come un grande plasmide replicando il proprio genoma.

d) Vettori BAC

Bacterial Artificial Chromosome

Plasmidi di dimensioni enormi, consentono l’inserimento di frammenti di DNA umano fino a 300 Kb.

Il DNA viene inserito nei batteri mediante processo di elettroporazione: uno shock elettrico provoca la formazione transitoria di pori sulla membrana batterica attraverso i quali passa il DNA.

Ospiti per i vettori

• Le caratteristiche di un ospite di clonaggo sono:• crescita rapida• capacità di crescere in terreni di coltura poco

costosi• non patogencità• capacità di essere trasformato• stabilità della coltura.

Curva di crescita di E. coli

INTERVALLO (Lag phase)

I batteri vengono diluiti nella coltura iniziale; la divisione procede lentamente in quanto le cellule si stanno adattando al terreno fresco.

FASE LOGARITMICA

4 - 5 ore

I batteri crescono esponenzialmente.

10 - 11 ore

FASE STAZIONARIA

La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.

Tempo (h)D

ensi

tà c

ellu

lare

(O

D6

00)

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0

0 5 10 15 20

DNA stampo a singola elica

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC5’ 3’

Ibridazione conIl primer

+ [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC-C ddC

-CC ddG-CCGATT ddG

-CCGA ddT-CCGAT ddT

Sequenza: 5’-CCGATTG

A C G T

-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC

GT

T

AGCC

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

Direzione dilettura