Gioele Casagranda,

Camilla Larentis,

Emanuele Pallaoro,

Filippo Quattrocchi

Povo, 1 marzo 2016

P r o g e t t o C L I L - E s p e r i m e n t o f i n a l e

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

ed elettroforesi

Cos’è la PCR: introduzione generale e premesse al

nostro esperimento

La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un

procedimento che serve per replicare alcune

sequenze di materiale genetico al fine di

ottenerne molteplici copie che possono essere

utilizzate a scopo di ricerca. L'amplificazione

mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di

materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.

Questa metodica ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della duplicazione

cellulare, ovvero la sintesi della doppia elica di DNA, processo che, come noto, si

definisce semiconservativo. Infatti, le doppie eliche che si formano contengono

ciascuna un filamento della molecola di DNA originale. Lo stesso discorso vale per

la PRC, anche se ad essere duplicato è solo un frammento del codice genetico.

La PCR fu ideata nel 1983 da

Kary B. Mullis il quale

ottenne, per questo, il Premio

Nobel per la chimica nel

1993.

La PCR richiede che due molecole d’innesco si ibridino alle estremità dei due

filamenti opposti della molecola di DNA stampo. Per eseguire una PCR è

necessario denaturare lo stampo di DNA e lasciare ai due inneschi, ai nucleotidi e

alla DNA polimerasi il tempo di interagire e dare avvio alle reazioni di sintesi.

Successivamente il materiale genetico e determinati composti chimici vengono

sottoposti a numerosi cicli durante i quali viene riscaldato e raffreddato

ripetutamente il mix favorendo denaturazione e duplicazione della molecola

interessata.

Fino a questo punto si è parlato di DNA, ma per quanto riguarda il nostro

esperimento sarebbe più corretto appellare il materiale genetico con il nome di

cDNA (dall’inglese Complementary DNA). Si tratta di una particolare molecola che

contiene l’informazione genetica e si origina a partire dal singolo filamento di una

molecola di mRNA per opera dell’enzima

trascrittasi inversa. La molecola risultante

è costituita dal filamento iniziale di mRNA

e dal filamento duplicato, quindi ha una

struttura a doppia elica.

La reazione a catena della

polimerasi si costituisce di

diverse fasi:

Denaturazione

Consiste nella separazione dei

legami a idrogeno che intercorrono

fra le basi azotate complementari

delle due eliche di cDNA.

• Annealing

Si formano dei legami a idrogeno tra i primer e le sequenze di DNA. La

temperatura di questo stadio dipende dai primer usati. Durante

l’annealing vengono utilizzati due primer che si legano ai loro siti specifici.

Si formano e si rompono continuamente i legami ionici tra i filamenti dei

primer ed i singoli filamenti di DNA che funzionano da template (filamento

stampo). I primer che si appaiano esattamente con il filamento stampo

formano i legami più stabili e, in questo piccolo tratto di doppia elica, si

lega la polimerasi che inizia così a copiare il filamento stampo;

• Estensione/Elongation

La DNA polimerasi estende il filamento a partire dal primer fino alla fine

della sequenza. La temperatura di elongation dipende dalla DNA

Polimerasi. Durante l’estensione la Polimerasi prolunga la sequenza di

basi dei primer aggiungendo le basi (complementari al template)

dall’estremità 5’ all’estremità 3’. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio

filamento.

Questi step principali vengono poi ripetuti 30 volte attraverso l’utilizzo di

un termociclatore.

Step Temperature Time

Initial denaturation 95 °C 2 min

Denaturation 95 °C 15 sec 30 cicli

Annealing 58 °C 15 sec

Extenstion 72 °C 15 sec

Final Extention 72 °C 5 min

Hold 4 °C Indefinite

Scopo dell’esperimento

Eseguire una PCR di cDNA derivante da cellule staminali neurali (NSC) ed

embrionali (ESC) e verificarne il corretto funzionamento attraverso l’osservazione

di determinati geni (Nestin, OCT4, 18S) che, come spiegheremo, si esprimono solo

ad un determinato grado di specializzazione delle cellule staminali.

Strumenti

• Microprovette Eppendorf;

Nota operativa:

Questo esperimento ha un’elevata sensibilità ed efficienza; infatti il

procedimento, e quindi i risultati, dipendono sensibilmente dalla presenza di

materiale genetico contaminante che si può trovare nell’ambiente e sulla

strumentazione. Il problema della contaminazione è elevato tanto quanto la

sensibilità della PCR, questo perché gli elementi contaminanti vengono

anch’essi amplificati.

E’ quindi opportuno mantenere tutto ciò che può essere necessario al fine

dell’esperimento il più possibile sterile.

Tutti i puntali e le provette Eppendorf sono state sterilizzate attraverso un

procedimento a caldo, in autoclave e con onde ultraviolette.

Il primo apparato consiste in una camera d’acciaio, chiusa ermeticamente al

cui interno del vapore sotto pressione produce temperature di 121°C senza che

i liquidi vadano in ebollizione.

• Micropipette con relativi puntali per maneggiare quantità dell’ordine di 1-

20 microL;

• Termociclatore (strumento che permette di regolare la temperatura

dell’ambiente di reazione in maniera precisa e per periodi di tempo ben

determinati);

• Forno a microonde;

• Vasca di preparazione per gel di Agarosio;

• Cella elettrolitica per elettroforesi;

• Pettine per pozzetti;

• Transilluminatore UV.

Materiali

• Mater mix (23 microL): composto contenente 2.5 microL di buffer di

reazione ad una concentrazione 10X, 2.5 microL di MgCl2 50mM, 2.5

microL di dNTP 10mM, 1 microL di primer forward 10 microM, 1 microL di

primer reverse (i primer nei vari mix sono specifici per determinati geni:

Nestin, OCT4 e/o 18S), 10

microM, 0.5 microL di EuroTaq

5U/microL, 14.5 microL di acqua;

• cDNA (2 microL): da

cellule NSC per i gruppi 1, 3, 5 e

da cellule ESC per i gruppi 2, 4,

6;

• Agarosio in polvere;

• TAE buffer 10X;

• Acqua;

• Colorante blu;

• Colorante BIOATLAS UV;

Nestin è un gene che è espresso principalmente dalle

cellule staminali neurali (e non deve quindi essere presente nelle cellule

staminali embrionali).

OCT4 è un gene che è espresso principalmente dalle cellule

staminali embrionali (e non deve quindi essere presente nelle cellule

staminali neurali).

18S è un gene che è espresso in tutte le cellule.

Template DNA: filamento stampo di DNA.

MgCl2: è un cofattore essenziale per il funzionamento della

TAQ.

TAQ DNA polimerasi: è un enzima termostabile che aiuta a

catalizzare la polimerizzazione dei desossinucleotidi che risultano in un

filamento di DNA; proviene dall'organismo termofilo Thermus

aquaticus.

Primer: è una

sequenza a filamento singolo di

DNA atta a localizzare la sequenza

target. Ne sono necessari due per

amplificare un frammento di DNA

agganciandosi ai due punti

estremi del frammento.

dNTP: è un mix di

nucleotidi desossiribonucleici.

PCR buffer: crea un

ambiente per l’attività ottimale

della TAQ.

Procedimento

Preparare 2 Eppendorf, nelle quali verranno versati, rispettivamente, 23 microL di

Master mix + 2 microL di cDNA e 23 microL di Master mix + 2 microL di acqua

(campione di controllo); in seguito indicarne con una sigla il contenuto.

Posizionare nel termociclatore per l’esecuzione di 30 cicli di PCR al fine di

svolgere la moltiplicazione dei frammenti di DNA secondo lo schema indicato

nella premessa.

Ogni ciclo si compone, quindi in questo modo:

• Denaturazione: alla temperatura di 95 °C per 15 sec, in seguito ad una

denaturazione iniziale che avviene a 95 °C per una durata di 2 min.

• Annealing: alla temperatura di 58 °C per 15 sec;

• Estensione: alla temperatura di 72 °C per 15 sec.

Si termina con un’estensione finale a 72 °C per 5 minuti. Poi il composto viene

tenuto a una temperatura di 4 °C all’interno del termociclatore.

Preparazione del gel di agarosio

Per preparare

l’ambiente su cui si

svolgerà la corsa

elettroforetica si

diluisce il TAE

buffer per crearne

una soluzione di

questo al 10%

volume/volume,

quindi si deve

aggiungere 1 parte

del composto ogni 9

parti di acqua (si intendono partizioni di volume). Il buffer è infatti inizialmente

ad una concentrazione che è 10 volte maggiore di quella operativa e va quindi

diluito.

Per preparare il gel vero e proprio, si prepara una soluzione di concentrazione

pari al 2% massa/volume e si mette la soluzione così ottenuta nel forno a

L’agarosio è un polisaccaride purificato dall’agar-agar, una

sostanza gelatinosa estratta dalle alghe. E’ un polimero

lineare e neutro, uno zucchero solubile in acqua alla

temperatura di ebollizione. Quando raffredda assume la

composizione di gel grazie alla formazione di una matrice

tridimensionale costituitasi attraverso legami ad idrogeno fra

le catene lineari. La sue rete di pori permette al gel di fungere

da setaccio e di separare le molecole in base alla loro

grandezza e, quindi, anche in base alla loro velocità.

microonde. La soluzione viene fatta riscaldare fino a quando, giunta ad

ebollizione, diviene trasparente.

In seguito la soluzione in questione viene versata nella vasca di preparazione a

gelificare, dove in precedenza era stato posizionato il pettino per pozzetti e si

aggiungono al composto 9 microL di colorante BIOATLAS che, grazie alla sua

proprietà di legarsi con le basi di acido nucleico a doppio filamento ed emettere

luce fluorescente se irradiata a raggi UV, ci permette di identificare con precisione

i risultati della corsa.

Una volta solidificato, si pone il gel nella cella elettrolitica e si ricopre il tutto con

la soluzione buffer, fino a che il gel di agarosio non è immerso per 1 cm circa.

Elettroforesi su gel di agarosio:

A questo punto si devono aggiungere i campioni che hanno subito il processo di

PCR nei pozzetti lasciati liberi dalla rimozione del pettine. Abbiamo aggiunto ai

nostri campioni un colorante blu che permette di allocare la sostanza nelle

fenditure verticali più agevolmente e precisamente e di disciogliere il DNA

amplificato in una temporanea fase omogenea più densa dell’acqua, che ne evita

la risalita dal pozzetto.

Le bande centrali contengono un composto detto “ladder” che essendo costituite

da frammenti di lunghezza prefissata (ad esempio, 100, 200, 300, 400 nucleotidi)

forniscono per l’appunto una scala atta a determinare la lunghezza dei frammenti

di DNA che si fanno correre sul gel.

La cellula elettrolitica genera un campo elettrico che mette in moto le molecole di

DNA aggiunte nei pozzetti. Il DNA è un acido nucleico e liberando protoni assume

una carica negativa che fa sì, grazie alla d.d.p. fra i due poli, che venga attratta al

polo positivo.

Osservazioni e conclusioni

Come previsto, si osserva la presenza di Nestin solo nelle cellule neuronali, la

presenza dell’OCT4 solo in quelle embrionali e il 18S in tutte le cellule. Inoltre

dalla tabella e dalle immagini si può notare che tutti i gruppi di controllo hanno

dato esito negativo.

L’ordine seguito

nell’introdurre i mix

amplificati nei pozzetti

è lo stesso seguito nella

tabella per i campioni

contenenti il DNA e

inverso per quanto

riguarda i campioni

contenenti l’acqua.

Quindi a partire da

sinistra abbiamo:

NSC+Nestin,

ESC+Nestin,

NSC+OCT4, ESC+OCT4, NSC+18S, NSC+18S, “ladder”, Acqua+18S, Acqua+18S,

Acqua+OCT4, Acqua+OCT4, Acqua+Nestin, Acqua+Nestin.

GENE TIPO DI

CELLULA

BANDE

OSSERVATE

Nestin

NSC SI

ESC NO

Acqua NO

OCT4

NSC NO

ESC SI

Acqua NO

18S

NSC SI

ESC SI

Acqua NO

La PCR è riuscita alla perfezione. Si sono amplificati tratti di DNA solo nei

composti dove ci aspettavamo preventivamente che il processo avesse effetto.

Unica nota negativa, forse, una leggera banda nel campione di controllo del

gruppo 6 che, come si può notare nella foto al trasilluminatore, ha lasciato una

piccola traccia sul gel di agarosio. Bisogna ricordare che il gene 18S è espresso da

gran parte delle cellule viventi e quindi anche una leggerissima contaminazione

può determinare un esito negativo.