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VIRUS A DNA

Replicazione nucleare e citoplasmaticaHEPADNAVIRUS

Replicazione nucleare

Replicazione citoplasmatica POXVIRUS

.a DNAds = Adenovirus e Herpesvirus. Poxvirus.b DNAss = Parvovirus

1) DNA lineare

2) DNAds circolare = Hepadnavirus, Poliomavirus e Papillomavirus

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Parvovirus - Papillomavirus e Poliomavirus: DNA pol cellulare

Adenovirus - Herpesvirus: DNA pol virale

> velocità> errori

Target per agenti antivirali(es. acyclovir, AZT)

REPLICAZIONE del DNA VIRALE

SEMICONSERVATIVA

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REPLICAZIONE DEI VIRUS a DNA

PROBLEMI Richiesta di un primer di inizio della replicazione del DNA

lo stesso problema della cellula ospite: le DNA polimerasi non sono in grado di replicare il DNA a partire da uno stampo a ssDNA. Possono solo iniziare la replicazione a partire da regioni ds (5’ 3’)

•come replicare le estremità senza perdere informazione?•soluzione: specifiche caratteristiche strutturali dei genomi

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Le sequenze Ori

From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

siti di legame per proteine (Ori recognition proteins): Palindromi

sequenze ricche di AT: facilitano lo srotolamentote

sequenze dentro o vicino a regioni di controllo trascrizionale

siti di legame per fattori trascrizionali e proteine con funzione di enhancer , virali e/o cellulari (aumento dell’efficienza di replicazione)

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Replicazione del genoma dei virus a DNA : le proteine di riconoscimento della regione ORI

From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

Tutti i virus a DNA devono codificare almeno una proteina per iniziare la replicazione del genoma

legame di specifiche proteine alla regione ORI del genoma virale.il legame con le proteine tende a distorcere la regione ORI

eventuale reclutamento di proteine cellulari per la replicazione del DNA virale

Molte delle proteine reclutate sulla regione ORI hanno attività di elicasi ATP-dipendente per lo srotolamento del DNA virale

Caratteristiche comuni:

I virus più grandi codificano anche la loro DNA polimerasi e altre proteine essenziali per la replicazione del genoma

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TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA

Presenza di proteine regolatrici virali e/o cellulari che interagiscono con sequenze “promoter”al 5’ dei geni virali

5’ sequenze “cap”3’ poli A (100-200 residui di adenina)

Trascrizione di geni su filamenti diversi di DNA ed in direzione opposta (es. SV40 = early e late su filamenti opposti)

mRNA con introni Splicing

mRNA policistronicilettura in ORF differenti

Utilizzano RNA pol II cellulare

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TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA nel nucleo della cellula ospite

Replicazione del DNA

ecc: Poxvirus: Utilizzano enzimi presenti nel core del virione Trascritti senza introni. Assenza di splicing

- Organizzazione temporale (in 2 tempi) con:

mRNA precoci Proteine non-strutturali

mRNA tardivi Proteine strutturali

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TRASCRIZIONE DEI VIRUS A DNA

- Organizzazione temporale (in 3 tempi) con:

immediati precoci (CHX insensibili)

Precoci ritardati (CHX sensibili)

Es. HERPESVIRUS

Replicazione del DNA

mRNA precoci

mRNA tardivi Proteine strutturali

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DNA ds circolare (5.2 kbp)legato a istoni cellulari (H2A, H2B, H3 e H4)

Capside icosaedrico nudoVP1, VP2 e VP3

geni precoci replicazione DNA geni tardivi

Espressione temporale

mRNA E e L trascritti in modo divergente a partire da ORI

(45 nm)

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tardive: proteine strutturali (VP1, VP2, VP3)

- regolano la loro stessa sintesi transizione della trascrizione da precoce a tardiva- attivano l’espressione dei geni tardivi

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- essenziale per la replicazione del DNA virale

interazione con pRB e p53 (induzione della fase S nella cellula ospite ed inibizione dell’apoptosi cellulare

Proteine di SV40

precoci: proteine T e t ( regolatorie e multifunzionali)

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Replicazione del Genoma di SV40

sito di origine della replicazione (ORI)

la replicazione del DNA è bidirezionale (replicazione a Theta)

ORI = sequenza unica

Terminazione della sintesi del DNA a 180o da ORI ( congiunzione delle forche di replicazione)

2 esameri di proteina T legano un sito (sito II) della ORI

proteina T (elicasi) insieme a RpA cellulare (proteina di legame ssDNA) srotolano il DNA in modo da permettere la sintesi bidirezionale del DNA

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DNA ds circolare (8 kbp)legato a istoni cellulari

Capside icosaedrico nudo (L1,L2)

Specie-specificiTropismo per cellule dell’epitelio squamosoInfezione produttiva solo in cellule epiteliali differenziate

>100 tipi di HPV (Human Papilloma Virus) alto rischio: HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-45

(55 nm)

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PAPILLOMAVIRUS

7 geni E 2 geni L ( L1 e L2 strutturali)

E6 si lega a p53 : segnale per ubiquitina e degradazione

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E7 attiva la proteina Rb

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I PAPILLOMAVIRUS: il ciclo virale

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Proteine Virali• E2: fattore regolatore della trascrizione e della replicazione del DNA

virale.

• E1: fattore importante per la replicazione del DNA virale, si lega all’origine di replicazione posto nel LCR

• E4: e’ espressa come gene late. Overlaps E2, ma ha un differente ORF. Viene sintetizzata contemporaneamente alla relicazione del DNA, prima della sintesi di L1 ed L2

• E5: è altamente idrofobica, associata a membrane cellulari. Sembra induca una down regulation del sistema MHC

• E6: oncogene virale, interagisce con p53

• E7: oncogene virale, interagisce con pRb

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Capside icosaedriconudo 60-90 nm

Circa 100 sierotipi umani Infezioni respiratorie ed enteriche

Congiuntiviti acute

infezioni latenti nel tessuto linfatico di tonsille, adenoidi e placche del Peyer

(alcuni tipi oncogeni per roditori neonati)

isolati da adenoidi umane - 1953

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ADENOVIRUS Genoma:dsDNA lineare

ITR ITR

(30-35 Kbp)

ITR = Inverted Terminal Repeat

Terminal proteinP55

5’desossicitosina

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Espressione del genoma

Geni precoci = E1a, E1b, E2a, E2b (DNA pol), E3, E4

Geni tardivi = L1, L2, L3, L4, L5 (proteine strutturali)

ADENOVIRUS

19From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

3. l’elica di DNA dislocata forma un “panhandle” via gli “inverted terminal repeats”

4.associazione Pol-pre-TP e ……

1. la Polimerasi virale forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP

il legame di Nf-1 e Oct-1 alla sequenza core Ori facilita la formazione del complesso

2. il 3’OH di dCMP serve da innesco per la sintesi (in continuo) del filamento di DNA complementare

Ad ssDBP (E2), e Topoisomerasi

5. sintesi (in continuo) del filamento complementare

Adenovirus: replicazione del DNA lineare la PROTEINA TERMINALE funge da PRIMER

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Sottofamiglia Genere Tipo

AlphaherpesvirinaeSimplexvirus

Herpes simplex virus tipo 1

Herpes simplex virus tipo 2

Varicellovirus Virus VaricellaZoster

Betaherpesvirinae

Cytomegalovirus Citomegalovirus

Roseolovirus

Herpesvirus umano 6

Herpesvirus umano 7

Gammaherpesvirinae Lymphocrypto-virus

EpsteinBarr virus

Rhadinoviruso del sarcoma

Herpesvirusumano 8

di Kaposi

Capside icosaedricocon involucro

150 nm

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Sequenze Uniche = U (L e S)

Sequenze Ripetute = R (L e S), (T e I)

Genoma di HSV-1 DNAds lineare QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)sono necessari per visualizzare quest'immagine.

(150 Kb)

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Genoma del virus Herpes Simplex di Tipo 1

Il genoma lineare quando entra del nucleo della cellula ospite circolarizza per la presenza di sequenze presenti alle due estremità TR

Il genoma viene trascritto ad opera della RNA polimerasi II cellulare

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HSV-1:REPLICAZIONE DEL GENOMA

proteine necessarie per la sintesi del DNA viraleORI binding protein (UL9)helicase/primase complex (UL5, UL8, UL52). DNA polymerase (UL30), DNA binding proteins (UL42, UL29, ICP8)

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Modello di replicazione del DNA dei virus erpetici Cerchio rotante

From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

1. taglio della molecola circolare : 3’-OH utilizzato come primer

2. la sintesi della nuova elica provoca la dislocazione dell’elica complementare

3 e 4. sintesi in continuo della forma circolare e sintesi discontinua sull’elica dislocata con formazione di concatameri di dsDNA

Il taglio del DNA (sequenza terminale

ripetuta a) congiuntamente al processo di incapsidamento del DNA genera i nuovi genomi virali lineari

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CICLO DIREPLICAZIO

NE

cascata di espressione

genica

assemblaggio e maturazione

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Capside icosaedriconon-rivestito

18-28 nm

Parvovirus autonomi Dependovirus o Virus adeno-associati (AAV)

: 1 molecola lineare DNAss 4.5 - 6 Kb

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Adeno-associati

QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)sono necessari per visualizzare quest'immagine.

Ad

Virus satelliti: Per replicare richiedono attiva replicazione cellulare o la co-infezione con un virus helper (adenovirus o herpesvirus)

AAV

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PARVOVIRUS: DNA lineare ss (4.5 - 6 Kb)

Sequenze terminali palindromiche

Sequenze terminali

filamento codificante: filamento(-)

QuickTime™ and aGIF decompressorare needed to see this picture.115nt 115nt

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PARVOVIRUS

Per vedere questa immagineoccorre QuickTime™ e un

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Regioni separate per:proteine non strutturali (gene NS1, gene rep) proteine strutturali (geni cap)

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REPLICAZIONE DEL GENOMA DEI PARVOVIRUSrolling hairpin model

REP78 reazione nicking necessaria per la risoluzione dei terminali.

attività di elicasi essenziale per srotolamento della regione ITR

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