Laurea Triennale in Scienze Biologiche 3° annoCorso di Laboratorio di Metodologie Biomolecolari

1. Manipolazione del DNA 2. Purificazione di

proteine e saggi enzimatici

3. Cristallizzazione di proteine

4. Bioinformatica e struttura di proteine

Buone regole per il lavoro sperimentale in laboratorio

• attività in gruppo, attività in singolo (lavorare in team) • scrivere sul quaderno (riproducibilità dei risultati) e sulle provette

• utilizzo del waste (normale e Alipak)

• utilizzo delle pipette (next slide)

1. Maneggiare con cura (pericolo di scalibrazione)

Utilizzo delle pipette automatiche

2. Impostare il volume

E’ un’alternativa alla clonazione: consente di amplificare direttamente specifici frammenti di DNA o di RNA presenti in una miscela o in un genoma complesso.

E’ necessario conoscere la sequenza delle estremità del frammento da amplificare.

Estremamente sensibile.

Si possono produrre grandi quantità di un frammento specifico a partire anche da pochissime molecole di stampo iniziale (una singola cellula, macchia di sangue, saliva, pelle)

Ingredienti di baseStampo di DNA I primers complementari alle estremità dello stampoDNA polimerasi4 nucleotidi (dATP, dTTP, dCTP e dGTP)Il tampone appropriato

Cicli di denaturazione a 94°C seguiti da annealing dei primer e polimerizzazione:

e’ necessario usare una polimerasi termoresistente.

La Taq polimerasi deriva dal batterio Termus aquaticus, resiste ad alte temperature (94°C) ed estende i primer a 72°C.

Polymerase Chain Reaction (PCR) MISCELA DI REAZIONE

Templato: plasmid DNA (pGem-Ins )(In pGem è clonato Human genomic fragment containing an ITS)

Profilo di PCR95° C 2 min

95° C 55 sec63° C 55 sec72° C 55 sec

72° C 5 min

4° C hold

35 cicli

5 ul DNA plasmidico (1uM)

3 ul Primer Mix(10uM)

10 ul dNTPs (1mM)

10 ul 5X Colorless GoTaq® Flexi Reaction Buffer

6 ul MgCl2 (25mM)

0.5 ul GoTaq

15,5 ul H20

50 ul Tot

Reazione in 50 ul

Ingredienti stampo di DNA i primersTaq polimerasidNTPs (dATP, dTTP, dCTP e dGTP)tampone

Il Thermocycler esegue automaticamente i cambi di temperatura necessari per la PCR

L’elettroforesi su gel di agarosio

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE

Gli enzimi di restrizione sono un particolare tipo di endonucleasi. Tagliano il DNA all’interno di sequenze specifiche. Si ottengono quindi frammenti riproducibili e discreti.

Bisturi molecolari - indispensabili per analizzare

- molecole lunghe di DNA

-strutture dei cromosomi

-isolare i geni

CREARE nuove molecole di DNA

Clonaggio

’ ’

’ ’

’ ’ ’ ’

’ ’ ’ ’

↓

↓

↓

VETTORIIl vettore è un trasportatore di molecole di DNA. E‘una molecola di DNA che può entrare nella cellula ospite ed essere replicata.

Le proprietà fondamentali di un vettore:

•Deve essere capace di replicarsi autonomamente replicando quindi il frammento di DNA trasportato

•Deve contenere siti di restrizione presenti una sola volta nel vettore (polycloning site)

•Deve contenere almeno un marcatore selezionabile per distinguere le cellule ospite che portano il vettore da quelle che non lo portano

•Deve essere facile da isolare dalle cellule ospite

Esperimento ADigestione di DNA