Spettroscopia NMR (Risonanza Magnetica Nucleare)...Spettroscopia NMR (Risonanza Magnetica Nucleare)...

Spettroscopia NMR

(Risonanza Magnetica Nucleare)

•studia l’assorbimento della radiazione a radiofrequenze da parte di

molecole quando i loro atomi sono orientati da un campo magnetico

applicato.

•rispetto alle altre tecniche (es. IR, UV), fornisce un maggior numero

di informazioni di tipo strutturale utili all’identificazione di un composto

organico.

•Dallo spettro NMR di un composto si possono ottenere informazioni

qualitative e quantitative.

•inoltre, conducendo esperimenti sofisticati, è possibile risalire alla

conformazione di molecole molto complesse.

Rabi Fisica 1944

Ernst Chimica 1991

Lauterbur Medicina 2003

Mansfield Medicina 2003

Wutrich Chimica 2002

Bloch Fisica 1952

Purcell Fisica 1952

Spettroscopia NMR

(Risonanza Magnetica Nucleare)

Le particelle elementari che compongono gli atomi, come

elettroni, protoni e neutroni, hanno alcune proprietà di

base:

•Massa

•Carica elettrica (protoni ed elettroni)

•Momento angolare di spin

Momento angolare di spin

Il momento angolare di spin può essere

rappresentato intuitivamente come

un movimento di rotazione intorno al

proprio asse della massa

Il numero quantico principale n definisce il livello di energia dell'elettrone e la

dimensione degli orbitali. Può assumere valori interi positivi: n = 1, 2, 3, 4, 5, 6 ……

Il numero quantico secondario l stablisce il numero dei sottolivelli in cui si differenzia

ciascun livello. Ogni sottolivello raggruppa orbitali della stessa forma definita dal valore di

l compreso tra 0 e (n – 1). Ogni sottolivello corrispondente a ciascun valore di l viene

indicato con una lettera minuscola secondo il seguente schema: valore di l=0 1 2 3 4

simbolo s p d f g Si parla quindi di orbitali di tipo s, orbitali di tipo p, orbitali di tipo d

ecc.

Il numero quantico magnetico m. Determina il numero di orbitali appartenenti a ciascun

sottolivello e il loro orientamento nello spazio. Gli orbitali di uno stesso sottolivello sono

isoenergetici (degeneri); m può assumere tutti i valori interi da -l a +l, compreso lo zero.

Per esempio, per l = 1, m = -1, 0, +1, ossia al sottolivello p appartengono tre orbitali

degeneri orientati secondo gli assi cartesiani: px, py, pz.

Il numero quantico di spin, ms è legato al senso della rotazione, orario o antiorario,

dell'elettrone attorno al proprio asse. Esso può assumere valore +1/2 e -1/2. Ogni orbitale

può contenere al massimo due elettroni (doppietto elettronico) con spin opposto.

?????????

UN PO’ DI RIPASSO:

I nuclei che posseggono una massa dispari o una carica dispari o

entrambe si comportano come se fossero in rotazione (spin)

attorno all’asse nucleare.

Essi posseggono un momento angolare di spin quantizzato P

ed un momento magnetico μ

.

Proprietà magnetiche dei nuclei

Il momento magnetico m è proporzionale al momento di spin

La costante di proporzionalità tra il momento magnetico m ed il

momento angolare nucleare P è detta rapporto giromagnetico (g)

m = g P

Momento magnetico

Il momento magnetico (chiamato anche momento di

dipolo magnetico e indicato dalla lettera greca μ) è un

vettore che caratterizza le proprietà magnetiche di un

corpo: in una barra magnetica, per esempio, il verso

del momento magnetico è diretto dal polo sud al polo

nord della barra.

Un magnete produce un campo

magnetico ed è a sua volta

influenzato dai campi magnetici.

L'intensità del campo magnetico

prodotto è proporzionale al

momento magnetico.

m

http://vam.anest.ufl.edu/forensic/nmr.html

Campo magnetico spento

Campo magnetico acceso

Momento magnetico

Il modulo del momento magnetico è fisso per ogni nucleo, e non può

cambiare in nessun modo.

Può cambiare l’orientazione che il vettore momento magnetico può assumere

nei confronti di una direzione esterna z.

Il modulo del momento magnetico è fisso per ogni nucleo, e non può

cambiare in nessun modo.

Può cambiare l’orientazione che il vettore momento magnetico può assumere

nei confronti di una direzione esterna z.

Momento magnetico

Questa orientazione è quantizzata, ed il vettore momento magnetico può

assumere solo

2I+1 orientazioni

dove il numero quantico di spin I è una costante fisica per ogni nucleo

Numero quantico di spin

Elemento 1H 2H 12C 13C 14N 16O 17O

N° massa 1 2 12 13 14 16 17

N°carica 1 1 6 6 7 8 8

Numero

quantico

di spin ( I ) 1/2 1 0 1/2 1 0 5/2

A ogni numero quantico di spin sono associati degli

stati di spin -I<m<+I (Δm=±1)

A ogni numero quantico di spin sono associati degli

stati di spin -I<m<+I (Δm=±1)

2

1

2

1

I = 1/2 I = 1

+

_

0

z

h_

h_

m=1 m=0

m=-1

m=1

m=-1

m=0

La Spettroscopia NMR si basa sul fatto che i nuclei atomici possono

essere orientati in un campo magnetico* (B0) e assorbire una

radiazione a radiofrequenze ad una determinata frequenza.

Fenomeno di

Risonanza Magnetica

Radiazione spenta Processi di

Rilassamento

Magnetico

hn=DE DE

B0

La transizione avverra’ quando

hn= DE, e comportera’ un

assorbimento di energia

* Lo spazio entro il quale un magnete esercita la sua azione prende il nome di Campo magnetico

I=1/2

In assenza di campo magnetico

In presenza di campo magnetico

2I+1=2*1/2+1=2

Precessione del Momento

Magnetico Nucleare

I=1/2 B0

La frequenza di precessione è

chiamata frequenza di Larmor

n=(g/2p)B0

In presenza di campo magnetico

B0

a

b

DE1 DE2

B0

a

b

DE1 DE2

Nell’NMR la differenza di energia tra gli stati nucleari è indotta dal campo

magnetico esterno, e può quindi essere variata.

0BE gD

Poiché i due stati di spin hanno energia diversa, è quindi possibile indurre il

passaggio da uno stato all’altro mediante un quanto di radiazione elettromagnetica

di frequenza

p

ggn

2

00 B

h

B

h

E

D

Principale problema della spettroscopia NMR

kT

Ee

N

NkT

ED

D

1a

b

kT

B

N

N01

g

a

b

LA SENSIBILITA’

Distribuzione di Boltzmann

a

a

aa

a

a

a

aa

aa a

ab

b

bb

b

b

b

b

b b

b

b

a

hn

hn

hn

hn

hn

hn

hn

hn

b

hn


kT

Ee

N

NkT

ED

D

1a

b

kT

B

N

N01

g

a

b

LA SENSIBILITA’


a

a

aa

a

a

a

aa

aa a

ab

b

bb

b

b

b

b

b b

b

b

a

hn

hn

hn

hn

hn

hn

hn

hn

b

hn


kT

Ee

N

NkT

ED

D

1a

b

kT

B

N

N01

g

a

b

LA SENSIBILITA’


La sensibilità di un esperimento NMR aumenta:

• all’aumentare del campo applicato;

•all’aumentare del rapporto giromagnetico

0BE gD

Come si induce una transizione tra differenti livelli energetici?

•Nell’NMR cio’ viene realizzato attraverso l’irradiazione del nucleo con una

radiazione a radiofrequenze (r.f) la cui componente magnetica possa interagire

con i dipoli nucleari.

•La transizione avrà luogo quando hn= DE; ciò comporterà un assorbimento di

energia. In pratica la frequenza n della radiazione a r.f. dovra’ essere uguale alla

frequenza di Larmor (ogni transizione comporta un cambiamento di spin)

•Secondo le regole di selezione, saranno permesse solo le transizioni in cui il numero

quantico m vari di 1: Dm = 1

PRINCIPI BASILARI DI UN ESPERIMENTO NMR

Spettrometro NMR

900 MHz (21.2 T)

Il campione viene eccitato mediante pulsi di RF

di durata molto breve (ms).

Il segnale rivelato dallo spettrometro è quello rilasciato dai nuclei

durante la fase di rilassamento

(ritorno all’equilibrio).

dttitfF )2exp()()( pnn

FID

Freq. Larmor

Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT)


Vi sono persone in grado di riconoscere le singole note nel caso di piu' note suonate

contemporaneamente, anche se questo processo diventa piu' difficile all'aumentare delle

note

Provate a suonare più note simultaneamente. Riuscireste a dire quali frequenze

sono state suonate? La trasformata di Fourier puo' farlo!

Cambiate ora le ampiezze relative delle note. Riuscireste a determinare le

intensita' relative delle note con il vostro orecchio? La trasformata di Fourier puo'

farlo!

L'operazione effettuata dalla trasformata di

Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che

ascolta un insieme di toni (segnale nel dominio del

tempo) e ne determina le note (contenuto in

frequenza).

La trasformata inversa di Fourier puo' essere

assimilata ad un musicista che vede le note

(frequenze) sullo spartito musicale e le converte in

toni (segnali nel domino del tempo).

Se tutti i nuclei dello stesso tipo di una molecola precedono alla stessa

frequenza di risonanza

quanti segnali ci aspettiamo di trovare nel corrispondente

spettro NMR?

Es. Quanti segnali ci aspettiamo

dallo spettro 1H-NMR dell’ etanolo

(CH3-CH2-OH)?

Sotto l’influenza del campo magnetico

esterno gli elettroni tendono ad

assumere un movimento rotatorio, e

ruotando generano essi stessi un campo

magnetico.

Il campo magnetico generato si oppone al campo magnetico esterno

Pertanto, il nucleo sarà sottoposto ad un campo magnetico effettivo

minore di quello applicato, è cioè schermato dagli elettroni.

LO SPOSTAMENTO CHIMICO (CHEMICAL SHIFT)

Nonostante tutti i nuclei di una certo tipo

(per esempio 1H) siano esattamente identici,

essi risuonano a frequenze leggermente

diverse purché si trovino in intorni chimici

differenti.

http://faculty.ccc.edu/cabrams/projects/nmrtutor/INTRO.dcr

Beff=B0(1-s) s= costante di schermo

che dipende dalla

struttura elettronica in prossimità del nucleo in esame

neff=n0(1-s) FREQUENZA DI LARMOR

EFFETTIVA

CAMPO MAGNETICO

EFFETTIVO

SCHERMAGGIO

LO SPOSTAMENTO CHIMICO

La posizione del centro del segnale NMR è chiamata

spostamento chimico (chemical shift, d) e viene espressa in

ppm:

610*)(

rospettromet

oriferimentcampione

n

nnd

riferimento=tetrametilsilano (TMS) Si(CH3)4

LO SPOSTAMENTO CHIMICO

n=g/2pB0

Il principale fattore che determina il

chemical shift di un protone è la densità

elettronica del relativo idrogeno.

d- d

C H Cl Elemento

elettronegativo

d- d

Composto CH3X

Elemento X

Elettronegatività of X

Chemical shift d

CH3F CH3OH CH3Cl CH3Br CH3I CH4 (CH3)4Si

F O Cl Br I H Si

4.0 3.5 3.1 2.8 2.5 2.1 1.8

4.26 3.40 3.05 2.68 2.16 0.23 0

TMS Più

deschermati

CHEMICAL SHIFT PROTONICO


idrogeni alifatici primari, secondari e terziari

risuonano a valori di ppp via via più alti.

L’elettronegatività del carbonio è bassa per cui

tutti e tre i tipi d idrogeno si trovano al di sotto dei

2 ppm


Come nel caso delle spettroscopie di assorbimento anche per l’NMR è possibile formulare

alcune regole di additività che permettono di prevedere, con ragionevole approssimazione , il

chemical shift dei vari nuclei.

Per quanto riguarda la spettroscopia protonica il calcolo è ristretto a 1) derivati metilenici

derivati metilenici 2) derivati etilenici.

REGOLE DI SHOOLERY PER I DERIVATI METILENICI

Serve per calcolare il chemical shift di derivati del tipo X-CH2-Y. Si parte dal c.s. del metano (

0.233 ppm) e si addizionano i contributi tabulati per i vari sostituenti:

d=0.233+Somma(contributi)

-C 0.248

-C-C 0.244

-C 0.147

-C 0.006

c

c c

c c

C=C H H

H H BO

I protoni sono deschermati

Linee di forza del campo magnetico

indotto

ANISOTROPIA DI CHEMICAL SHIFT

I protoni olefinici (legati a carboni sp2) hanno chemical shifts molto più

alti dei protoni legati a carboni sp3, con valori tipici di d 5-6 ppm. Ciò è

dovuto alla nuvola elettronica p che può generare campi magnetici

relativamente intensi.

elettroni p

DeschermatI

H H

Linee di forza del campo magnetico indotto dagli

elettroni p

CORRENTE DI ANELLO NEL BENZENE

B0

http://faculty.ccc.edu/cabrams/projects/nmrtutor/BENZENE.dcr

aumenta lo schermaggio

aumenta d

NON DOBBIAMO RICORDARE TUTTI I VALORI DI CHEMICAL SHIFT A MEMORIA !!!!

alifatico

C-H

CH vicino a un legame

p

C-H dove C è legato ad un

atomo elettronegativ

o

alcheni

=C-H benzene

CH aldeidi

CHO acidi

COOH

2 3 4 6 7 9 10 0

X-C-H X=C-C-H

(ppm)

L’intensità di un segnale nello spettro NMR protonico è

proporzionale al numero di protoni che lo genera.

INTEGRAZIONE

CH3OH metanolo

3

1

CH3CH2OH etanolo

1H-NMR

Es. HO-CH2-

Es HO-CH3

CH3CH2OH

CH3

Tripletto 1:2:1 per accoppiamento con il CH2

CH2

I protoni del metilene sono meno schermati di quelli del metile (d più grande). Quartetto 1:3:3:1 per accoppiamento con il CH3

OH

il protone dell’OH è ancora meno schermato. Qui scambia “rapidamente” con le altre molecole ed è quindi disaccoppiato dagli altri nuclei

Integrali dei multipletti. Sono proporzionali al numero di nuclei che contribuiscono al

multipletto.

CH3CH2OH

STRUTTURA FINE & ACCOPPIAMENTO SCALARE (SPIN-SPIN)

deriva dall’interazione magnetica tra i nuclei presenti nella molecola

e viene trasmesso attraverso la polarizzazione degli elettroni di legame

un gruppo di N nuclei magneticamente equivalenti scompone il segnale NMR di un nucleo o un gruppo di nuclei non

magneticamente ai primi in 2NI+1 componenti.

nuclei magneticamente equivalenti

stesso chemical shift e stesso accoppiamento con altri gruppi di nuclei

nella stessa molecola.

3 nuclei A equivalenti

2 nuclei B equivalenti

BA nn ,

frequenze di risonanza

Ma se c’è accoppiamento, i nuclei A risentono della situazione dei nuclei

B, e viceversa. In tal caso ogni riga dovuta ad un gruppo di nuclei

equivalenti si separa (splitting) in un numero di righe corrispondente ai

diversi stati di spin del gruppo vicino.

Se tra i due gruppi di nuclei non ci

fosse accoppiamento...

nA nB

NMR

nA nB

Gli integrali dei

due multipletti

stanno nello

stesso rapporto

del numero di

protoni

equivalenti

corrispondenti

1 2 1

Tripletto di righe 1 3 3 1

Quartetto di righe

3 : 2

J J J J J

J = 0

J 0

3 nuclei A equivalenti

2 nuclei B equivalenti

Accoppiamenti uguali con nuclei vicini

Poiché l’ accoppiamento spin-spin è

dovuto alle interazioni tra i momenti

magnetici nucleari, che sono

indipendenti dal campo magnetico

applicato B0, le costanti di

accoppiamento J sono indipendenti dal

campo magnetico applicato e risultano

uguali in qualunque spettrometro.

Il valore di J decresce con l’aumentare

del numero di legami tra i nuclei

accoppiati

J(Hz)

costante di accoppiamento scalare

Functional Group JHH (Hz)

6 – 8

11 – 18

6 – 15

4 – 10

6 – 10

8 – 11

a,a: 8 - 14 a,e: 0 - 7 e,e: 0 – 5

cis: 6 - 12 trans: 4 - 8

Le intensità relative dei segnali di un multipletto generato

dalla vicinanza di N nuclei a spin ½ possono essere previste

sulla base dei valori numerici del TRIANGOLO DI PASCAL

Numero e intensità delle righe numero di H

0

1

2

3

4

5

1

1 1

1 1 2

1 1 3 3

1 1 5 5 10 10

1 1 4 4 6

ecc.

TRIANGOLO DI PASCAL

I=1/2

Triangolo di Pascal

Se due nuclei (o gruppi di nuclei) non chimicamente equivalenti accoppiano con il medesimo nucleo (o gruppo di nuclei), l’effetto dei nuclei va considerato separatamente.

CH3CH2CH2CH2…….

esempio

Accoppiamenti diversi con nuclei vicini

le differenze in chemical shift sono maggiori della costante di

accoppiamento (d»J), e l’identificazione dei nuclei magneticamente

equivalenti e´ di facile risoluzione.

•Molteplicità 2nI+1

•Triangolo di Pascal se I=1/2

•Segnali equidistanti

spettro del primo ordine

le differenze in chemical shift sono comparabili con le costanti di

accoppiamento (d≤J) e l’attribuzione dei segnali risulta più

complicata. In tal caso bisogna ricorrere all'analisi quanto

meccanica dello spettro.

spettro di ordine superiore

2,2-DIMETILBUTANO

13C-NMR

STRUTTURA FINE DEGLI SPETTRI 13C-NMR

Accoppiamento 1JCH

Dominante negli spettri NMR del 13C

Spettro 13C

Accoppiato

Spettro 13C

Accoppiato

Spettro 13C

Disaccoppiato

I TEMPI DI RILASSAMENTO T1 E T2

L’energia assorbita dai nuclei sottoposti alla risonanza magnetica viene

dissipata mediante processi di rilassamento magnetico nucleare, che

regolano il ritorno all’equilibrio della magnetizzazione. Questi processi

sono chiamati

•Rilassamento spin-reticolo (che comporta uno scambio di energia tra il

nucleo e l’ambiente circostante)

•Rilassamento spin-spin (che comporta uno scambio diretto di energia

elettromagnetica tra gli spin nucleari)

I due processi sono rispettivamente regolati da due constanti di tempo T1

e T2 il cui valori dipendono dalla struttura molecolare del campione e dal

suo stato di aggregazione (solido, liquido)

NMR in biologia

La risonanza magnetica nucleare viene utilizzata per

determinare la struttura di macromolecole

Attraverso l’identificazione di biomarcatori in patologie oncologiche è possibile

diagnosticare alcune forme di cancro.

Nei campioni biologici ha permesso l’identificazione di composti di rilevanza

farmacologica-tossicologica (es. ricerca di un farmaco, pesticidi, droghe d’abuso,

veleni).

Informazioni sulla possibilità di molecole di piccole dimensioni di legarsi

ad un recettore proteico alterandone la funzionalità.

NMR di biomolecole

Problema: Come si fa ad assegnare tutti i segnali di

uno spettro NMR di una proteina?

Etanolo

SPETTROSCOPIA NMR BI-DIMENSIONALE

2D-NMR

6 4

2 5

3

Etil crotonato

glicina

isoleucina

valina

glicina

isoleucina

valina val

leu

Spettro NMR di una Miscela di aminoacidi??? Esempio: Estratto acquoso di Bottarga (amino acidi, nucleotidi, ac.organici,…)

HETCOR non è altro che la versione eteronucleare dell’esperimento di

correlazione COSY.

La tecnica Hetcor correla gli shifts del 13C con quelli dell’1H attraverso

l’accoppiamento tramite un legame. Gli shifts dei carboni e degli idrogeni che

sono legati l’uno all’altro sono letti come segnali fuori diagonale.

Tale tecnica permette di misurare gli shifts dei due nuclei in un solo

esperimento, e allo stesso tempo permette di stabilirne la connettivita’.

HETeronuclear CORrelation(COSY 1H-13C)

HETCOR

HETeronuclear CORrelation(COSY 1H-13C)

J-resolved Spectra

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