Spettroscopia di assorbimento nel visibile e nellultravioletto Carlo I.G. Tuberoso – Appunti...

Spettroscopia Spettroscopia di assorbimento nel di assorbimento nel

visibile e visibile e nell’ultraviolettonell’ultravioletto

Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici uso laboratorio ver. 00

I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla

misura della radiazione elettromagnetica prodotta misura della radiazione elettromagnetica prodotta

o assorbita dagli analiti.o assorbita dagli analiti.

Si possono classificare in funzione della regione Si possono classificare in funzione della regione

dello spettro elettromagnetico (raggi X, dello spettro elettromagnetico (raggi X,

ultravioletto, visibile, infrarosso ecc.) e ultravioletto, visibile, infrarosso ecc.) e

storicamente i primi metodi spettroscopici erano storicamente i primi metodi spettroscopici erano

ristretti all’uso della radiazione visibile.ristretti all’uso della radiazione visibile.

La spettroscopia costituisce un potente La spettroscopia costituisce un potente

strumento di analisi chimica poiché ogni strumento di analisi chimica poiché ogni

elemento chimico, ed in generale ogni sostanza, elemento chimico, ed in generale ogni sostanza,

presenta uno presenta uno spettrospettro caratteristico che fornisce caratteristico che fornisce

informazioni dettagliate e precise sulla sua informazioni dettagliate e precise sulla sua

struttura o sulla sua composizione.struttura o sulla sua composizione.

La luce viene emessa o assorbita sotto forma di La luce viene emessa o assorbita sotto forma di

quanti o fotoni. quanti o fotoni.

L'energia L'energia EE di un singolo fotone è direttamente di un singolo fotone è direttamente

proporzionale alla frequenza di radiazione proporzionale alla frequenza di radiazione e quindi e quindi

inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda

, secondo la formula:, secondo la formula:

E = hE = h = hc/ = hc/

hh costante di Planckcostante di Planck cc velocità della lucevelocità della luce

Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Si definisce Si definisce lunghezza d’ondalunghezza d’onda ( (λλ) la distanza minima ) la distanza minima

tra due punti in fase e viene espressa in: tra due punti in fase e viene espressa in:

Å = 10Å = 10-8-8 cm (raggi X) cm (raggi X)

μμm = 10m = 10-4-4 cm (IR) cm (IR)

nm = 10nm = 10-7-7 cm (UV-Visibile) cm (UV-Visibile)

La La frequenzafrequenza rappresenta il numero di oscillazioni al rappresenta il numero di oscillazioni al

secondo, ossia è il numero di cicli che passa per un secondo, ossia è il numero di cicli che passa per un

punto nell’unità di tempo e viene espressa in secpunto nell’unità di tempo e viene espressa in sec-1-1..

Il colore o la lunghezza d’onda dei quanti di luce Il colore o la lunghezza d’onda dei quanti di luce

emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da

una molecola, dipende dalla loro struttura interna. una molecola, dipende dalla loro struttura interna.

In un atomo, l’assorbimento o l’emissione di luce di In un atomo, l’assorbimento o l’emissione di luce di

una determinata lunghezza d’onda corrisponde alla una determinata lunghezza d’onda corrisponde alla

transizione di un elettrone da un’orbita ad un’altra. transizione di un elettrone da un’orbita ad un’altra.

Lo spettro di un atomo è sempre a righe e cade Lo spettro di un atomo è sempre a righe e cade

nell’intervallo di frequenze dall’infrarosso al visibile.nell’intervallo di frequenze dall’infrarosso al visibile.


TECNICHE SPETTROSCOPICHETECNICHE SPETTROSCOPICHE


≈ ≈ 10-380 nm (UV) 10-380 nm (UV) ≈ ≈ 380-780 nm (Vis)380-780 nm (Vis)

≈ ≈ 1-1000 1-1000 m (IR) m (IR)

espresso anche come espresso anche come numero d’onda 1/numero d’onda 1/

≈ ≈ 10.000-10 cm10.000-10 cmDott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Quando una radiazione d’onda compresa tra Quando una radiazione d’onda compresa tra

190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli 190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli

elettroni dei legami dei composti presenti in elettroni dei legami dei composti presenti in

soluzione passano allo stato eccitato. Meno soluzione passano allo stato eccitato. Meno

fortemente sono legati gli elettroni dei lagami fortemente sono legati gli elettroni dei lagami

entro la molecola, più elevata sarà la lunghezza entro la molecola, più elevata sarà la lunghezza

d’onda della radiazione assorbita e quindi più d’onda della radiazione assorbita e quindi più

bassa l’energia.bassa l’energia.

SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTOSPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO


ECCITAZIONE DELL’ETILENEECCITAZIONE DELL’ETILENE


PP00 = intensità radiazione incidente= intensità radiazione incidente

P P == intensità radiazione emessaintensità radiazione emessab = b = spessore dello strato di soluzionespessore dello strato di soluzione

Quando un fascio di radiazione monocromatica Quando un fascio di radiazione monocromatica

attraversa una soluzione contenente un analita, attraversa una soluzione contenente un analita,

parte della radiazione viene assorbita:parte della radiazione viene assorbita:


Transmittanza Transmittanza T = P / PT = P / P00

Assorbanza Assorbanza A = log 1 / TA = log 1 / T A = logA = log PP00 / P/ P


A= A= b cb cA= A= b cb c

LEGGE DI LAMBERT-BEERLEGGE DI LAMBERT-BEER

A = assorbanza

= assorbività molare (l mol-1 cm-1)

b = cammino ottico (spessore cuvetta espresso in cm)

c = concentrazione, espressa in mol l-1


Se si riporta il segnale (Se si riporta il segnale (TT o o AA) in funzione della ) in funzione della

lunghezza del cammino ottico:lunghezza del cammino ottico:

La risposta dell’assorbanza in funzione della La risposta dell’assorbanza in funzione della

concentrazione è lineare fino ad un certo punto:concentrazione è lineare fino ad un certo punto:


I cromoforiI cromofori

Sono gruppi presenti in molecole organiche che Sono gruppi presenti in molecole organiche che

hanno la capacità di assorbire la radiazione hanno la capacità di assorbire la radiazione

elettromagnetica nella regione del visibile e in elettromagnetica nella regione del visibile e in

quella dell’ultravioletto. I cromofori più comuni quella dell’ultravioletto. I cromofori più comuni

sono caratterizzati da gruppi insaturi in grado di sono caratterizzati da gruppi insaturi in grado di

delocalizzare le cariche (etileni, acetileni, dieni, delocalizzare le cariche (etileni, acetileni, dieni,

carbonili, azoico, benzeni…). Gruppi in grado di carbonili, azoico, benzeni…). Gruppi in grado di

esaltare l’attività del cromoforo vengono denominati esaltare l’attività del cromoforo vengono denominati

auxocromi.auxocromi.


Caratteristiche di alcuni cromofori benzeniciCaratteristiche di alcuni cromofori benzenici


Le variazioni dello spettroLe variazioni dello spettro

SPOSTAMENTOSPOSTAMENTO DENOMINAZIONEDENOMINAZIONE

Lunghezze d’onda Lunghezze d’onda maggioremaggiore batocromicobatocromico

Lunghezze d’onda minoreLunghezze d’onda minore ipsocromicoipsocromico

Assorbanza maggioreAssorbanza maggiore ipercromicoipercromico

Assorbanza minoreAssorbanza minore ipocromicoipocromicoDott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

200200 nmnm 600600

00A

bs

Ab

s 22 QUERCETINAQUERCETINA

Lo spettro UV-VISLo spettro UV-VIS


Lo spettro UV-VISLo spettro UV-VIS


Singolo raggioSingolo raggio

LO SPETTROFOTOMETROLO SPETTROFOTOMETRO

Doppio raggioDoppio raggio


La La sorgente luminosasorgente luminosa è costituita da lampada a: è costituita da lampada a:

deuterio per la zona dell’UVdeuterio per la zona dell’UV D2 + Ee → D2* → D’ + D’’ + hv (U.V.) spettro della radiazione emessa: ≈ 160-375 nm

tungsteno (W) per la regione visibiletungsteno (W) per la regione visibile temperatura filamento: ≈ 2870 K spettro della radiazione emessa: ≈ 350-2500 nm

xenon (Xe) per coprire entrambe le zonexenon (Xe) per coprire entrambe le zone


Il Il monocromatoremonocromatore scinde la luce nelle sue lunghezze scinde la luce nelle sue lunghezze

d’onda costituenti, ulteriormente selezionate da una d’onda costituenti, ulteriormente selezionate da una

fenditura successiva. I modelli più utilizzati sono il fenditura successiva. I modelli più utilizzati sono il

prisma e il reticolo di diffrazione:prisma e il reticolo di diffrazione:


Il Il rivelatorerivelatore permette di trasformare l’intensità permette di trasformare l’intensità

luminosa in un segnale elettrico. Possono essere luminosa in un segnale elettrico. Possono essere

utilizzate fotocellule (a), fotomoltiplicatori (PMT, utilizzate fotocellule (a), fotomoltiplicatori (PMT,

photomultiplier tubesphotomultiplier tubes, b) o fotodiodi., b) o fotodiodi.

b


Spettrofotometro con rivelatore a serie di diodiSpettrofotometro con rivelatore a serie di diodi


lati opachilati opachi

LE CUVETTELE CUVETTE


Lampada: singola sorgente pulsata allo XenonLampada: singola sorgente pulsata allo Xenon

Intervallo: 190-1100nm Intervallo: 190-1100nm


La taraturaLa taratura


Differenza spettriDifferenza spettri


L’influenza del pHL’influenza del pH


Spettri in derivataSpettri in derivata


Rilascio di un farmaco da una Rilascio di un farmaco da una formulazioneformulazione


Grazie allo sviluppo di opportuni Grazie allo sviluppo di opportuni

software, gli attuali spettrofotometri software, gli attuali spettrofotometri

possono essere utilizzati come possono essere utilizzati come

colorimetri, apparecchi che sono in grado colorimetri, apparecchi che sono in grado

di misurare la radiazione luminosa e di misurare la radiazione luminosa e

fornire un dato numerico che corrisponde fornire un dato numerico che corrisponde

alla sensazione visiva percepita alla sensazione visiva percepita

dall’occhio umano. dall’occhio umano.

I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI)I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI)


Lavorando su campioni trasparenti e in Lavorando su campioni trasparenti e in

soluzione è possibile effettuare una soluzione è possibile effettuare una

scansione tra 380 e 780nm, impostare scansione tra 380 e 780nm, impostare

l’osservatore standard e il tipo di sorgente l’osservatore standard e il tipo di sorgente

(in genere 10° e D65, rispettivamente) (in genere 10° e D65, rispettivamente)

ottenendo i valori di coordinate cromatiche ottenendo i valori di coordinate cromatiche

nel sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o nel sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o

L*C*H*. L*C*H*.

In tale modo vengono valutati l’intensità, la In tale modo vengono valutati l’intensità, la

tinta e la saturazione senza bisogno di tinta e la saturazione senza bisogno di

strumenti più costosi muniti della sfera. strumenti più costosi muniti della sfera.

Poiché il colore viene influenzato dalle Poiché il colore viene influenzato dalle

diluizioni, nel caso di campioni molto diluizioni, nel caso di campioni molto

intensi è preferibile ricorrere a celle dal intensi è preferibile ricorrere a celle dal

cammino ottico inferiore ed effettuare le cammino ottico inferiore ed effettuare le

opportune correzioni. opportune correzioni.


• TintaTinta (Hue, h) = definisce la tonalità (Hue, h) = definisce la tonalità del colore (rosso, giallo, verde, del colore (rosso, giallo, verde, azzurro)azzurro)

• LuminositàLuminosità (L*): indica la diversa (L*): indica la diversa intensità di luce, ossia di quanto la intensità di luce, ossia di quanto la tinta è diluita con il nero. Varia da tinta è diluita con il nero. Varia da zero (nero) a 100 (bianco)zero (nero) a 100 (bianco)

• SaturazioneSaturazione (Chroma, C*): indica di (Chroma, C*): indica di quanto la tinta pura è diluita con il quanto la tinta pura è diluita con il bianco. Varia da zero (bianco) a 100 bianco. Varia da zero (bianco) a 100 (colori spettrali puri, luci (colori spettrali puri, luci monocromatiche) monocromatiche)

I parametri di misura del coloreI parametri di misura del colore


LA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIOLA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIO

Spazio CIE L*a*b* (1976)

Spazio CIE xy (1931)


Lo spazio CIE L*a*b*Lo spazio CIE L*a*b*

luminositàluminositàtinta, tonalitàtinta, tonalità saturazionesaturazione


LA FUORIMETRIALA FUORIMETRIA

Quando gli elettroni nello stato eccitato di singoletto tornano Quando gli elettroni nello stato eccitato di singoletto tornano allo stato fondamentale di singoletto ed emettono fotoni si allo stato fondamentale di singoletto ed emettono fotoni si parla di fluorescenza, processo che dura tra 10parla di fluorescenza, processo che dura tra 10-10-10 s e 10 s e 10-5-5 s ed s ed è indipendente dalla temperatura. è indipendente dalla temperatura.

Si parla di fluorescenza primaria Si parla di fluorescenza primaria quando la sostanza è fluorescente allo quando la sostanza è fluorescente allo stato naturale, mentre la fluorescenza stato naturale, mentre la fluorescenza secondaria deriva dalla reazione con secondaria deriva dalla reazione con sostanze fluorescenti (derivatizzazione). sostanze fluorescenti (derivatizzazione). Le molecole naturalmente fluorescenti Le molecole naturalmente fluorescenti sono quelle con sistemi fortemente sono quelle con sistemi fortemente coniugati o aromatici e struttura rigida. coniugati o aromatici e struttura rigida. Il picco di emissione si trova sempre a Il picco di emissione si trova sempre a lunghezza d’onda maggiori lunghezza d’onda maggiori (spostamento di Stokes), e pertanto, a (spostamento di Stokes), e pertanto, a energia più bassa. energia più bassa.


FUORIMETRIFUORIMETRI

Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza molecolare (spettrofluorimetri) sono simili allo molecolare (spettrofluorimetri) sono simili allo spettrofotometro UV-VIS: è presente una sorgente luminosa spettrofotometro UV-VIS: è presente una sorgente luminosa (allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore, (allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore, un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo monocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perché monocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perché in questo caso il raggio che viene emesso è letto a 90° rispetto in questo caso il raggio che viene emesso è letto a 90° rispetto alla luce incidente. alla luce incidente.


Esistono alcune peculiarità che richiedono opportuni Esistono alcune peculiarità che richiedono opportuni

accorgimenti tecnici, ad es. l’assenza di fluorescenza provoca accorgimenti tecnici, ad es. l’assenza di fluorescenza provoca

il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della

linea di base. Inoltre la fluorescenza è molto sensibile alla linea di base. Inoltre la fluorescenza è molto sensibile alla

diffusione provocata dal solvente (effetto Rayleigh) o da diffusione provocata dal solvente (effetto Rayleigh) o da

sostanze colloidali (effetto Tyndall), alle variazioni di pH, sostanze colloidali (effetto Tyndall), alle variazioni di pH,

temperatura e viscosità o alla presenza di sostanze temperatura e viscosità o alla presenza di sostanze

sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo

concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere

riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si

eseguono diluizioni pari a 10-100 volte rispetto a quelle eseguono diluizioni pari a 10-100 volte rispetto a quelle

utilizzate in spettrofotometria UV-VIS. utilizzate in spettrofotometria UV-VIS.


SPETTROSCOPIA NELL’INFRAROSSOSPETTROSCOPIA NELL’INFRAROSSO

processo che dura processo che dura tra 10tra 10-10-10 s e 10 s e 10-5-5 s s ed è indipendente ed è indipendente dalla temperatura. dalla temperatura.

È una tecnica molto utilizzata per identificare composti È una tecnica molto utilizzata per identificare composti organici ed inorganici poiché la stragrande maggioranza organici ed inorganici poiché la stragrande maggioranza delle molecole presenta spettri di assorbimento delle molecole presenta spettri di assorbimento caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le analisi quantitative a causa della bassa sensibilità e analisi quantitative a causa della bassa sensibilità e precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di Beer.precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di Beer.


Il gran numero di legami presenti nelle molecole Il gran numero di legami presenti nelle molecole poliatomiche comporta che i dati ottenuti dall’analisi IR poliatomiche comporta che i dati ottenuti dall’analisi IR siano molto complessi e forniscano un’siano molto complessi e forniscano un’improntaimpronta digitaledigitale di di identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare molecola.molecola.


GRUPPO LEGAME ENERGIA (approx, cm-1)

hydroxyl O-H 3610-3640

amines N-H 3300-3500

aromatic rings C-H 3000-3100

alkenes C-H 3020-3080

alkanes C-H 2850-2960

nitriles C ΞN 2210-2260

carbonyl C=O 1650-1750

amines C-N 1180-1360


STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRSTRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRsistemi a dispersionesistemi a dispersione


GlobarGlobar

Lampada di NernstLampada di Nernst

Filo Ni-CrFilo Ni-Cr

GlobarGlobar

Lampada di NernstLampada di Nernst

Filo Ni-CrFilo Ni-Cr

STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRSTRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRsistemi a trasformata di Fouriersistemi a trasformata di Fourier


GLI SPETTRI IRGLI SPETTRI IR


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