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La valutazione del rischio da nanomateriali in ambito occupazionale: cenni di tossicologia e valutazione

dell'esposizione

Ivo Iavicoli Università degli Studi di Napoli Federico II

Situazione legislativa, aspetti tossicologici e conoscenza scientifica sulle nanoparticelle aerodisperse

Università degli Studi di Milano – Bicocca (DISAT) Mercoledì 23 novembre 2016 Milano, Piazza della scienza 1

NanoSimposio

Diffusione dei nanomateriali ingegnerizzati

Negli ultimi anni l’imponente progresso scientifico nel settore delle nanotecnologie ha reso possibile lo sviluppo e l’utilizzo dei nanomateriali ingegnerizzati in diversi ambiti industriali …

Cosmetici Elettronica

Abbigliamento

Edilizia

Produzione e conservazione dell’energia

Biotecnologie

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Diffusione dei nanomateriali ingegnerizzati

Modificato da Vance e coll. 2015

Ø  1827 prodotti di consumo;

Ø  33 nazioni produttrici;

Ø  715 aziende produttrici.

Fonte: Nanotechnology Consumer Products Inventory – Consultato a novembre 2016

… contribuendo quindi alla produzione di un numero costantemente crescente di prodotti di consumo che contengono questi materiali.

I nanomateriali ingegnerizzati: un rischio emergente

La rapida crescita delle nanotecnologie, la produzione di massa dei nanomateriali ingegnerizzati e la loro conseguente ampia diffusione e distribuzione a livello globale ha inevitabilmente aumentato la probabilità di una maggiore esposizione …

1. Ricerca e sviluppo

2. Produzione

3. Trasporto 4. Immagazzinamento

e stoccaggio

5. Smaltimento e riciclaggio

… dei lavoratori addetti alla produzione, manipolazione ed utilizzo di queste sostanze.

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I nanomateriali ingegnerizzati: un rischio emergente

1 – Ricerca e sviluppo

2 - Produzione

3 - Trasporto 4 – Immagazzinamento

e stoccaggio

5 – Smaltimento e riciclaggio

… ma anche della popolazione generale che può essere esposta ai nanomateriali ingegnerizzati sia attraverso il contatto con le matrici ambientali inquinate, sia utilizzando i prodotti di consumo che li contengono.

Nanomateriali ingegnerizzati: la valutazione del rischio

Appare quindi evidente la necessità di sviluppare delle efficaci strategie di valutazione e di gestione del rischio i cui principi basilari rimangono quelli stabiliti nel 1983 dalla National Academy of Sciences degli Stati Uniti d’America …

Identificazione del pericolo

Relazione dose-risposta

Valutazione dell’esposizione

Caratterizzazione del rischio

Valutazione del rischio

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Nanomateriali ingegnerizzati ed effetti avversi per la salute

Negli ultimi anni sono stati effettuati numerosi studi in vitro ed in vivo che hanno investigato la relazione causale tra le differenti caratteristiche chimico – fisiche dei nanomateriali ed i loro possibili effetti avversi…

Dimensione

Forma

Concentrazione numerica

Stato di agglomerazione

Carica di superficie

Funzionalizzazione

Area di superficie Composizione chimica

Struttura cristallina

Distribuzione dimensionale

Modificato da Hasselöw e Kaegi, 2009

Nanomateriali ingegnerizzati ed effetti avversi per la salute

Modificato da Hasselöw e Kaegi, 2009

…i risultati di tali studi hanno mostrato che le peculiari caratteristiche chimico – fisiche dei nanomateriali (che ne rendono estremamente attraente l’impiego industriale) sono anche responsabili dei principali effetti avversi osservati.

Util

izzi

indu

stri

ali

Pot

enzi

ali e

ffetti

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ersi

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La valutazione del rischio: aspetti tossicologici

Differenti tipologie di nanomateriali sono risultati in grado di indurre effetti citotossici, infiammatori e genotossici su differenti linee cellulari.

INFIAMMAZIONE CITOTOSSICITÀ GENOTOSSICITÀ

STRESS OSSIDATIVO

L’induzione dello stress ossidativo rappresenta uno dei principali meccanismi molecolari di azione responsabili dei suddetti effetti avversi

La valutazione del rischio: aspetti tossicologici

Gli studi in vivo condotti su differenti tipologie di animali da laboratorio hanno mostrato la capacità dei nanomateriali di causare effetti tossici su differenti organi e sistemi d’organo:

Sistema respiratorio

Sistema cardiovascolare

Sistema nervoso

Sistema renale

Sistema endocrino

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Aspetti tossicologici: l’apparato respiratorio

Risposta infiammatoria: Aumento del numero di cellule infiammatorie e alterazioni dei parametri biochimici nel liquido di lavaggio bronco-alveolare

Stress ossidativo: Aumento dei radicali

dell’ossigeno, ridotti livelli di enzimi anti-ossidanti

Danno strutturale: Infiltrazione di cellule

infiammatorie, enfisema ed edema polmonare, congestione

dei vasi sanguigni, sanguinamento

Alterazione dei profili genici: alterazione dell’espressione di

geni coinvolti nella risposta infiammatoria, immunitaria, nell’apoptosi cellulare e nelle

reazioni ossidative

NPs di TiO2 rutile (4-6 nm) instillate per via intratracheale in ratti sacrificati 24 ore dopo.

Nemmar et al., 2008

NPs di TiO2 anatase (5-6 nm) ) instillate in topi per via intratracheale per 90 giorni consecutivi. Sun et al., 2013

Polmone normale (controlli); enfisema + edema (2.5 mg/kg); infiltrato infiammatorio, congestione vascolare

(5 mg/kg); sanguinamento (10 mg/kg). Sun et al., 2013

NPs di TiO2 anatase TiO2-NPs (~6 nm) instillate per via intranasale (10 mg/kg) in topi a giorni alterni per 90

giorni. Li et al., 2013

Aspetti tossicologici: l’apparato cardiovascolare

Ateroma nell’aorta di topi trattati con nanotubi di carbonio a parete singola (20 mcg/topo a settimane

alterne per 8 settimane)

Soluzione salina Nanotubi di carbonio a parete

singola

Xu e coll. 2012; Li e coll., 2007; Abdelhalim, 2011

Ratti trattati con 50 mcl di nanoparticelle d’oro (50 nm) per via intraperitoneale per 3 giorni: foci emorragiche con stravaso di globuli rossi; vacuolizzazione citoplasmatica indicante un effetto tossico sul

tessuto miocardico.

Aterosclerosi aortica in ratti trattati per via intravenosa con nanotubi di carbonio a parete multipla.

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Aspetti tossicologici: il sistema nervoso

Le NPs di TiO2, dopo essere state assorbite dalle terminazioni nervose della mucosa nasale, raggiungono il sistema nervoso mediante trasporto trans–sinaptico, accumulandosi prevalentemente nel bulbo olfattorio e

nell’ippocampo

L’esposizione a NPs di TiO2-NP causava: Alterazioni dell’omeostasi enzimatica, dei

neurotrasmettitori e del sistema dopaminergico; Stress ossidativo e reazioni infiammatorie; Alterazioni

nell’espressione genica.

Alterazioni morfologiche dei neuroni dell’ippocampo e del bulbo olfattorio sono state osservate dopo

instillazione intranasale di NPs di TiO2

NPs di TiO2 (80 nm rutile e 155 nm anatase) instillate per via intranasale in topi (500 μg ) a giorni alterni per 30 giorni. Wang

et al., 2008a

Ma et al., 2010; Hu et al., 2010, 2011; Li et al., 2010; Wang et al., 2008a, 2008b; Ze et al. 2014

NPs di TiO2 sono in grado di raggiungere il sistema nervoso centrale dopo essere state somministrate per via

intra-addominale, -gastrica, -tracheale ed intranasale

Aspetti tossicologici: il sistema renale

Livelli urinari di Retinol Binding Protein (μg/ml)

Livelli urinari di β2-microglobulina (μg/ml)

NPs di Palladio (10±6 nm) sono state somministrate a ratti Wistar per via intravenosa

(0.012 to 12 µg/kg). Campioni di urina sono stati prelevati 14 giorni

dopo il trattamento.

Fontana e coll. Nanotoxicology. 2015

Le NPs di Palladio inducevano una significativa azione nefrotossica a livello del tubulo renale ,

come dimostrato dall’incremento delle concentrazioni urinarie di Retinol Binding

Protein e β2-microglobulina.

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Nanomateriali ingegnerizzati: la valutazione del rischio

Monitoraggio ambientale

Misura continua o periodica dei livelli o concentrazioni di un inquinante nell’ambiente per confrontare le misure ottenute con appropriati valori guida di riferimento

Monitoraggio biologico

Misura periodica di indicatori di esposizione (sostanza chimica o suo metabolita), di effetto o di suscettibilità presenti in matrici biologiche accessibili, da confrontare con appropriati

valori guida di riferimento

Monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati

L’effettuazione del monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati è particolarmente difficoltosa e presenta ancora alcune criticità piuttosto importanti.

Cosa misurare?

Attualmente, non è ancora stato raggiunto un consenso internazionale sui parametri metrologici più rappresentativi ed importanti da misurare negli ambienti di lavoro.

Massa Numero Dimensione Area di superficie

Area di superficie

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Monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati

Inoltre, numerosi studi di nanotossicologia hanno dimostrato che le risposte biologiche indotte dai nanomateriali ingegnerizzati sono anche collegate ad altre caratteristiche chimico-fisiche ...

Cosa valutare?

Forma Composizione

chimica Funzionalizzazione Carica di superficie

Monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati

Sfortunatamente, non è ancora disponibile un unico metodo di campionamento e/o analisi che da solo sia in grado di fornire simultaneamente informazioni utili riguardo alle diverse caratteristiche chimico-fisiche dei nanomateriali ingegnerizzati.

Come misurare?

Conseguentemente, come suggerito dall’Istituto Nazionale Americano per la Salute e Sicurezza Occupazionale (NIOSH) qualsiasi valutazione dell'esposizione professionale a nanomateriali ingegnerizzati si dovrebbe basare su un approccio multi-strumentale che preveda l'uso di diverse tecniche di campionamento e di analisi.

Nanoparticle Emission Assessment Technique (NEAT)

Strategia di campionamento per valutare in maniera semi-quantitativa il rilascio di nanomateriali ingegnerizzati negli ambienti di lavoro

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Nan

opar

ticle

Em

issi

on A

sses

smen

t Tec

hniq

ue

STEP 1: Identificare le potenziali fonti di emissione

STEP 2: Misura della concentrazione numerica delle nanoparticelle con contatore di particelle a condensazione (CPC) e contatore ottico di particelle (OPC)

STEP 3: Nel caso in cui alla fase precedente si evidenzi una possibile emissione di nanomateriali si effettua la raccolta su filtro per la successiva caratterizzazione

Acquisire informazioni su:

Ciclo produttivo

Processi lavorativi

Nanomateriali utilizzati

Sopralluogo ambienti di lavoro:

Processi e mansioni lavorative

Caratteristiche dell’esposizione

Sistemi di ventilazione

Misura del livello di fondo

Misura su postazione di lavoro

Ci sono differenze ?

SI

NO No emissione di

nanomateriali

Emissione di nanomateriali

Campionamento di area per

successiva analisi

Gravimetrica

ICP-MS

TEM/SEM

Eventuale campionamento

personale

Nan

opar

ticle

Em

issi

on A

sses

smen

t Tec

hniq

ue 2

.0 Recentemente, la NEAT è stata modificata ed implementata (NEAT 2.0) includendo

anche una valutazione personale dell’esposizione mediante la raccolta su filtro dell’aria ambientale campionata nella zona di respirazione dei lavoratori esposti a nanomateriali.

Raccolta di informazioni su:

Ambiente di lavoro

Forza lavoro

Nanomateriali utilizzati

Ciclo e processi lavorativi …

N° lavoratori potenzialmente esposti …

Composizione, dimensioni, forma …

Identificazione di possibili fonti di esposizione

Campionamenti di area e personali

+

Misure con strumenti a lettura diretta (CPC/OPC)

Gravimetrica

ICP-MS

TEM/SEM

Confronto con i valori di fondo

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Monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati

Tuttavia, una delle principali problematiche del monitoraggio ambientale dei nanomateriali, correlata all’impiego di molteplici strumenti di campionamento, è rappresentata dal fatto che tali strumenti sono particolarmente ingombranti e di non semplice utilizzo negli ambienti di lavoro.

Monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati

•  Campionatori personali a lettura diretta e per la raccolta delle particelle;

•  Valutazione dell'esposizione del

singolo lavoratore. MiniDisc ESP nano 100

Fonte: nanoIndEx Project Assessment of personal exposure to airborne nanomaterials: A guidance

document, 2016

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Monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati

Fonte: nanoIndEx Project Assessment of personal exposure to airborne nanomaterials: A guidance

document, 2016

Campionamento personale

Campionamento di area

Campionamento personale

Campionamento di area

Monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati

•  Criticità nell’interpretazione dei dati ottenuti;

•  Attualmente non sono disponibili valori limite di esposizione occupazionale normati e condivisi a livello internazionale;

•  Alcuni enti ed istituzioni di ricerca nazionali ed internazionali hanno proposto dei valori limite di esposizione;

•  La maggior parte dei valori limite di esposizione sino ad oggi suggeriti sono classicamente basati sulla misura della concentrazione in massa dei nanomateriali nella frazione respirabile del particolato.

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Monitoraggio ambientale dei nanomateriali ingegnerizzati

Finnish Institute of Occupational Health

Japanese New Energy and Industrial Technology Development

Organization

German Social Accident Insurance

NIOSH

British Standard Institute

Nanomateriali ingegnerizzati e valori limite di esposizione

Nanomateriali National Institute for Occupational Safety

and Health (NIOSH) (Stati Uniti)

Finnish Institute of Occupational Health (Scaffold Research)

Japanese New Energy and Industrial Technology

Development Organization (AIST)

Nanoparticelle di biossido di

Titanio (TiO2)

Limite di esposizione raccomandato: 0.3 mg/m3 come media ponderata su 10 ore

lavorative al giorno per un totale di 40 ore settimanali (frazione respirabile)

Limite di esposizione occupazionale: 0.1 mg/m3 come media ponderata su 8 ore lavorative al giorno (frazione respirabile)

Limite di esposizione occupazionale: 0.61 mg/m3 (come media ponderata su 8 ore lavorative al giorno)

Nanotubi di carbonio (CNTs)

Limite di esposizione raccomandato: 1 μg/m3 di carbonio elementare come media ponderata su 8 ore lavorative al

giorno (frazione respirabile)

Biossido di silicio amorfo

Limite di esposizione occupazionale: 0.3 mg/m3 (come media ponderata su 8 ore

lavorative al giorno) – frazione respirabile

Nanofibre di carbonio e

nanocellulosa

Limite di esposizione occupazionale: 0.01 fibre/cm3 (come media ponderata su 8 ore lavorative al giorno) - principio di

precauzione

Polveri a bassa tossicità

Limite di esposizione occupazionale: 0.3 mg/m3 (nella frazione respirabile);

4 mg/m3 (nella frazione inalabile)

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Nanomateriali ingegnerizzati e valori limite di esposizione

Livelli di riferimento sono stati proposti dal British Standard Institute per l’esposizione a quattro tipologie di nanomateriali: ü Nanomateriali insolubili: 0.066 × occupational exposure limit (OEL) del corrispondente materiale;

ü Nanomateriali fibrosi: 0.01 fibre/ml;

ü Nanomateriali altamente solubili: 0.5 × OEL del corrispondente materiale;

ü Per sostanze classificate come cancerogene, mutagene, asmogene o pericolose per la salute riproduttiva: 0.1 × OEL della corrispondente sostanza.

British Standard Institute

Nanomateriali ingegnerizzati e valori limite di esposizione

L’ IFA ha proposto dei livelli di riferimento basati sulla dimensione e densità dei nanomateriali. Essi sono intesi come incremento rispetto al livello di fondo durante un turno di lavoro di 8 ore: ü Nanomateriali metallici, ossidi di metallo e granulari bio-persistenti (con densità > 6000 kg/m3): 20000 particelle (1- 100 nm)/cm³.

ü Nanomateriali granulari bio-persistenti (con densità <6000 kg/m3): 40000 particelle (1-100 nm)/cm3.

ü Nanotubi di carbonio: 10000 fibre/m3.

German Social Accident Insurance (IFA)

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Monitoraggio biologico dei nanomateriali ingegnerizzati

•  Ulteriore utile strumento di valutazione dell’esposizione ai nanomateriali ingegnerizzati (integra le informazioni ottenute nell’ambito del monitoraggio ambientale);

•  La definizione di appropriati biomarcatori di esposizione, effetto o suscettibilità correlati all’esposizione ai nanomateriali è particolarmente difficoltosa;

•  Necessità di disporre di un grande numero di informazioni (affidabili) relative alla

tossicocinetica ed alla tossicodinamica di questi materiali.

Monitoraggio biologico dei nanomateriali ingegnerizzati

Aria, acqua, vestiti …

Bio - applicazioni Aria Cibo, acqua…

Deposizione

Apparato respiratorio

Inalazione

Apparato gastro-intestinale

Ingestione

Tratto nasale

Tratto tracheo -

bronchiale

Regione alveolare

Torrente circolatorio

Linfonodi

Fegato

Cuore Milza Reni Altri organi (muscolo,

placenta …)

Midollo osseo

Linfonodi

SNC

SNP

Iniezione

Esposizione

Via di assorbimento

Traslocazione e distribuzione

Vie di eliminazione

Sudorazione / esfoliazione

Cute

Urine Latte

materno Feci

Indicatori di esposizione

Indicatori di effetto

Vie di passaggio confermate Vie di passaggio potenziali

Modificato da Oberdörster e coll., 2005

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Nan

omat

eria

li in

gegn

eriz

zati:

Mon

itora

ggio

bio

logi

co

Potenziali biomarcatori

Tra i possibili indicatori biologici di esposizione, il dosaggio del contenuto metallico elementare in differenti matrici biologiche potrebbe rappresentare un valido marcatore dell’esposizione a nanomateriali metallici.

Differenti parametri (proteine della fase acuta, citochine pro-infiammatorie, sistemi enzimatici, addotti alle proteine o al DNA), coinvolti nella risposta infiammatoria dell’organismo o nell’induzione dello stress ossidativo, potrebbero essere impiegati come indicatori di effetto precoce.

Indicatori di esposizione Indicatori di effetto

Esposizione Dose interna Dose efficace Effetti precoci Alterazioni d’organo conclamate

Tipologia di indicatore Vantaggi Criticità

Contenuto metallico elementare nei liquidi

biologici

Facilmente accessibili per valutazione dell’esposizione

a nanomateriali metallici

Ruolo delle proprietà fisico-chimiche non ancora del tutto definito; Migliore conoscenza della tossicocinetica; Dosi sperimentali non realistiche.

Stress ossidativo e infiammazione

Si riferiscono alle principali risposte biologiche indotte

dall’esposizione a nanomateriali

Limitata specificità; Sono potenzialmente influenzati da fattori non correlati ai nanomateriali.

Indicatori di danno d’organo Valutano gli effetti dei

nanomateriali su specifici organi bersaglio

Migliore conoscenza della tossicodinamica; Influenza di fattori esterni; Quali effetti avversi precoci ? Risultati attualmente non conclusivi.

Nan

omat

eria

li in

gegn

eriz

zati:

Mon

itora

ggio

bio

logi

co

Potenziali biomarcatori

Indicatori di esposizione Indicatori di effetto

Esposizione Dose interna Dose efficace Effetti precoci Alterazioni d’organo conclamate

Tipologia di indicatore Vantaggi Criticità

Indicatori di genotossicità Definiscono le proprietà

genotossiche dei nanomateriali

Ruolo delle proprietà fisico-chimiche non ancora del tutto definite; Non specifici; Di difficile interpretazione; Questione etica.

Indicatori genomici, proteomici, …

Identificano alterazioni precoci indotte dai

nanomateriali

Analisi accurata di competenze e costi necessari per l’attuazione

Indicatori di suscettibilità

Possono essere impiegati per una valutazione

predittiva del rischio di eventi avversi

Migliore conoscenza della tossicocinetica e tossicodinamica; Definizione normale variabilità individuale e condizioni di ipersuscettibilità; Questione etica.

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Monitoraggio biologico dei nanomateriali ingegnerizzati

Inalazione

Ingestione

Deposizione

Iniezione

Assorbimento gastro-intestinale

Assorbimento respiratorio

Distribuzione

Eliminazione

Contenuto metallico elementare

Contenuto metallico elementare

Stress ossidativo e infiammazione

Indicatori di danno d’organo

Indicatori di genotossicità

Indicatori genomici, proteomici, …

Indicatori di suscettibilità

Con

clus

ioni

Monitoraggio ambientale: obiettivi futuri

Acquisire dati affidabili e dettagliati sul ruolo delle proprietà chimico-fisiche dei nanomateriali nell’induzione delle risposte biologiche.

Implementazione dell’utilizzo dei campionatori personali per la corretta definizione dell’esposizione dei lavoratori a nanomateriali.

Definire e validare una strategia di campionamento ed una metodologia di analisi e caratterizzazione dei nanomateriali che sia standardizzata e che abbia un consenso internazionale.

Ulteriori studi appaiono necessari per definire criteri razionali e condivisi mediante i quali proporre valori limite di esposizione occupazionale ai nanomateriali.

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Con

clus

ioni

Monitoraggio biologico: obiettivi futuri

Acquisire dati affidabili e dettagliati inerenti la tossicocinetica e la tossicodinamica dei nanomateriali.

Individuare biomarcatori più sensibili e specifici.

Implementare e validare l’utilizzo delle nuove metodiche di analisi genomica, proteomica o trascrittomica.

Ottenere un sempre maggior numero di informazioni utili a identificare quali alterazioni genetiche, genotossiche o epigenetiche, correlate all’esposizione ai nanomateriali, possano essere considerate come potenziali indicatori di suscettibilità.

Grazie per la cortese attenzione