Università degli Studi di Università degli Studi di UrbinoUrbino

““Carlo Bo”Carlo Bo”

Utilizzo di globuli rossi ingegnerizzati come nuova strategia per la veicolazione di

farmaci

Prof. Luigia RossiProf. Luigia Rossiluigia.rossi@uniurb.itluigia.rossi@uniurb.it

PesaroPesaro22 settembre 22 settembre

20072007

USO DI FARMACI INTELLIGENTI

O

USO INTELLIGENTE DI FARMACI?

LE NUOVE SFIDE TERAPEUTICHE ALLA LUCE DELL’USO RAZIONALE DEI FARMACI

PERCHÈ UTILIZZARE “CARRIERS” PER FARMACI

aumentarne l’efficacia terapeutica ridurne la tossicità

• Maggiore stabilità in circolo

• Riduzione del dosaggio

• Riduzione della frequenza di somministrazione

• Riduzione degli effetti collaterali

Targeting specifico

PERCHÈ I GLOBULI ROSSI

ottenibili in grandi quantità

biodegradabili

non tossici nè immunogenici

grande volume cellulare quindi elevata capacità

possono circolare per lunghi periodi di tempo

(mesi)

possiedono corredo enzimatico in grado di

attivare profarmaci incapsulati

la procedura di incapsulamento (LOADING) non

ne altera le proprietà morfologiche, immunologiche

e biochimiche

TECNICHE DI LOADING

o ELETTROPORAZIONE

o ENDOCITOSI INDOTTA DA FARMACI

o METODO DEL PULSE OSMOTICO

o EMOLISI IPOTONICA

DILUTIONAL PRESWELL DILUTIONAL DIALYSIS PRESWELL DILUTIONAL WITH CONCENTRATION

Eritrocita

Farmaco da incapsulare

Soluzione ipotonica

Rigonfiamento e apertura dei pori di

membrana

Eritrocita “loaded”

Risigillamento e lavaggio

EMOLISI IPOTONICA

APPLICAZIONI BIOMEDICHE DEGLI RBC “LOADED”

A) Bioreattori circolanti con enzimi

incapsulati

B) Bioreattori circolanti per un lento

rilascio in circolo di farmaci

C) Targeting selettivo di farmaci a cellule

macrofagiche

erythrocyte enzyme

E

A

BA

B

A

B

B

A

A

A

B

B

B

- loading di adenosina deaminasi nella SCID (sindrome di immunodeficienza grave combinata)- loading di asparaginasi nella leucemia linfoblastica acuta

Bioreattori circolanti con enzimi incapsulati

Es:

ERYtech Pharma offers a new solution for the use of therapeutic enzymes by increasing their half life and reducing their toxicity.

Therapeutic enzymes are very often characterized by their toxicity. Thanks to their encapsulation into red blood cells, enzymes are active only inside the erythrocyte. The

development of neutralizing antibodies, which may decrease the effectiveness of the treatment, is prevented.

Moreover, enzymes have a very short half life, going from a few minutes to a maximum of a few days. Encapsulated enzymes’ half life is increased up to that of the erythrocyte; they

become active longer than under their free form – up to one month – and at a lower dosage – dosages are reduced about 100 fold.

BIOREATTORI CIRCOLANTI PER UN LENTO RILASCIO

IN CIRCOLO DI FARMACI

ERITROCITI CARICATI CON

PROFARMACI NON DIFFUSIBILI

BIOREATTORI PER IL RILASCIO DI

FARMACI DIFFUSIBILI E ATTIVI

A

E: enzimi del globulo rosso

EA B

A

BA

BB

AA

AA

A

A BB

BB

BB

Il globulo rosso caricato con il farmaco di interesse agisce come un bioreattore

A: profarmacoB: farmaco attivo

Vaso sanguigno

AA

AA

AA

AA

AA

A

A

Dex 21-P

Dex

Dex

DexDex

DexDex

dexamethasonedexamethasone

21-phosphate

ERITROCITA COME BIOREATTORE PER UN LENTO E COSTANTE RILASCIO IN CIRCOLO DELL’ANAOGO GLUCOCORTICOIDE DESAMETASONE (DEXA)

enzymeenzyme

Perchè il Desametasone ?Perchè il Desametasone ?Perchè il Desametasone ?Perchè il Desametasone ?

The highest anti-inflammatory potency together with no mineralcorticoid

activity candidate dexamethasone as the elective choice for low dose/long

term treatment such as needed in chronic inflammatory status of patients

COMPOUND Anti-inflammatory potency

Na+ retaining potency

Duration of action

Equivalent Dosemg

Cortisol 1 1 Short 20

Cortisone 0,8 0,8 Short 25

Fludrocortisone 10 125 Short -

Prednisone 4 0,8 Intermediate 5

Prednisolone 4 0,8 Intermediate 5

Methyprednisolone

5 0,5 Intermediate 4

Triamcinolone 5 0 Intermediate 4

Betamethasone 25 0 Long 0,75Desamethasone 25 0 Long 0,75

Extracted from Goodman Gilman “Pharmacological Basis of Therapeutics”

collecting bagtransferred

erythrocythes

heather

vacuum pump

saline washing solution

I hypotonic solution

II hypotonic solution

haemofilther

pump

rotating bowl

fluids to be dischargedblood of the donor

discharge of the II hypotonoc solution

RED CELL LOADERRED CELL LOADERdisposabledisposable

US patent 6,139,836 EU patent 882448 Japan patent

123228

erythrocyteserythrocytes

pre-swelled pre-swelled erythrocyteerythrocyte

s s

Lysed erythrocytes Lysed erythrocytes and opening of and opening of porespores

resealed resealed erythrocytes erythrocytes containing Dex 21-containing Dex 21-PP

addition of Dex addition of Dex 21-P to be 21-P to be encapsulatedencapsulated

concentrated concentrated red cell red cell lysatelysate

haemofiltehaemofilterr

Caricamento di desametasone 21-P in eritrociti Caricamento di desametasone 21-P in eritrociti tramite il Red Cell Loadertramite il Red Cell Loader

• Solution of Dexamethasone Solution of Dexamethasone sodium phosphate sodium phosphate (250mg/10ml)(250mg/10ml)

• Red Cells Loader (Compact Red Cells Loader (Compact Advanced)Advanced)

• Red Cells disposable kitRed Cells disposable kit

• Hypotonic Solutions 1&2Hypotonic Solutions 1&2

• Hypertonic Solution (PIGPA)Hypertonic Solution (PIGPA)

COMPACT + KIT COD. COMPACT + KIT COD. 04154 + 04154 + HYPOTONIC SOLUTIONS & HYPOTONIC SOLUTIONS & PIGPAPIGPA

RBC LOADING WITH RBC LOADING WITH DEXAMETHASONE 21-PDEXAMETHASONE 21-P

WITHDRAWAL OF WITHDRAWAL OF 50 ml OF WHOLE 50 ml OF WHOLE BLOOD FROM BLOOD FROM THE PATIENT THE PATIENT

AUTOLOGOUS LOADED AUTOLOGOUS LOADED RBC REINFUSION TO RBC REINFUSION TO THE PATIENTTHE PATIENT

STEP 1STEP 1

STEP 2STEP 2

STEP 3STEP 3

Desametasone 21-P e nuovo modo di Desametasone 21-P e nuovo modo di somministrazionesomministrazione

Desametasone 21-P e nuovo modo di Desametasone 21-P e nuovo modo di somministrazionesomministrazione

CE Marked Medical Device

Sperimentazioni cliniche

Fibrosi cisticain collaborazione con:Ospedale “Bambin Gesù”Roma

Morbo di Crohn e Colite ulcerosain collaborazione con: Ospedale “Bambin Gesù” RomaOspedale “Casa Sollievo della Sofferenza”San Giovanni Rotondo

BPCOin collaborazione con:Ospedale “S. Maria della Misericordia”Urbino

Gruppo A

Gruppo C

Gruppo B2 sommin. a distanza di 2

settiimane

1

2

3

4

5

72

45

75

71

75

0.78

1.96

3.93

4.28

8.78

> 11

4

> 10

12

> 13

> 11

4

> 10

> 10

> 13

Gruppi Pazienti Età Dexa 21-P

(mg)

Giorni senza

corticosteroidi

Giorni senza

beta2 agonisti

6

7

8

72

75

63

1 somm. 4.392 somm. 6.25

1 somm. 3.492 somm. 5.32

1 somm. 3.482 somm. 6.50

9

10

65

83

2.00

2.84

30

> 10

30

> 10

10> 30

10> 30

10> 30

10> 30

> 30

BPCO: VALUTAZIONE CLINICA

> 30

Farmacocinetica Rossi L. et al BAB 2001

GLOBULI ROSSI COME DRUG CARRIERSGLOBULI ROSSI COME DRUG CARRIERSAPPLICAZIONE CLINICA IN PEDIATRIAAPPLICAZIONE CLINICA IN PEDIATRIA

UNITÀ OPERATIVA DI GASTROENTEROLOGIA

OSPEDALE PEDIATRICO BAMBINO GESÙ-ROMA

IRCCS

La Fibrosi Cistica si manifesta con infezioni

broncopolmonari croniche, maldigestione ed eccessiva

risposta infiammatoria.

Una terapia antinfiammatoria prolungata è in grado

di rallentare l’evoluzione del danno polmonare.

I glucocorticoidi agiscono come efficaci farmaci

antinfiammatori ma non sono privi di effetti collaterali

Eritrociti Dex 21-P-loaded e Fibrosi Cistica

Caratteristiche dei pazienti FCCaratteristiche dei pazienti FC

17 CF patients homozygous for 17 CF patients homozygous for F508 deletionF508 deletion**

Age: ranging from 12 to 26 yearsAge: ranging from 12 to 26 years

Forced expiratory volume in one second (FEVForced expiratory volume in one second (FEV11) at ) at

least 35% of the predicted valueleast 35% of the predicted value

Presence of chronic suppurative pulmonary diseasePresence of chronic suppurative pulmonary disease

Colonization by Colonization by Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

**Braccio lungo cromosoma 7

Cystic Fibrosis Foundation, Patient Registry 2002 Annual Report, Bethesda, Maryland

FOLLOW UP CLINICO

Sicurezza

Riproducibilità

Funzionalità respiratoria (FEV1)

Riacutizzazioni infettive da Pseudomonas

aeruginosa

Parametri valutati

11stst Follow-up Clinico Follow-up ClinicoSafetySafety

Otto pazienti FC hanno ricevuto una somministrazione di eritrociti caricati Otto pazienti FC hanno ricevuto una somministrazione di eritrociti caricati con desametasone 21-P a concentrazioni crescenti (1.19 to 14.5 mg)con desametasone 21-P a concentrazioni crescenti (1.19 to 14.5 mg)

GroupGroupPatientPatient

ssDex 21-P Dex 21-P

(mg)(mg)

AA 11 1.191.19

BB22

332.262.26

2.282.28

CC

44

55

66

77

5.05.0

6.076.07

6.576.57

6.696.69

DD 88 14.514.5

Parametri valutati: pressione arteriosa, parametri ematochimici,Parametri valutati: pressione arteriosa, parametri ematochimici, cortisolo urinariocortisolo urinario → → non è stato registrato alcun segno di tossicitànon è stato registrato alcun segno di tossicità

I pazienti sono stati I pazienti sono stati

suddivisi in 4 gruppi (A, B, suddivisi in 4 gruppi (A, B,

C, D) sulla base della C, D) sulla base della

quantità di farmaco quantità di farmaco

somministratosomministrato

*

*

*

**patients underwent to pharmacokinetic studiespatients underwent to pharmacokinetic studies

11stst Follow-up Clinico Follow-up ClinicoSicurezza e riproducibilitàSicurezza e riproducibilità

Condizione selezionata: grouppo C (6.07 Condizione selezionata: grouppo C (6.07 ± 0.7 mg Dex ± 0.7 mg Dex 21-P)21-P)

Gli otto pazienti ricevettero 2 ulteriori somministrazioni Gli otto pazienti ricevettero 2 ulteriori somministrazioni di eritrociti carichi a distanza di tre settimane (16 di eritrociti carichi a distanza di tre settimane (16 infusionsi in totale)infusionsi in totale)

nessun effetto collaterale registratonessun effetto collaterale registrato →→ safety safety

confermataconfermata

6.09 6.09 ± 3.26 mg somministrati± 3.26 mg somministrati →→ riproducibilità ottenuta riproducibilità ottenuta

0,01

0,1

1

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Time (days)

Dex

amet

haso

ne

(nm

ol/m

l pl

asm

a)

10.76 mg Dex 21- P15.47 mg Dex 21- P

Semilogarithmic plot of plasma concentration of Dexamethasone in patient n. 9 at Semilogarithmic plot of plasma concentration of Dexamethasone in patient n. 9 at

times 0 (immediately post infusions) and 1, 9, 16 and 28 days post two successive times 0 (immediately post infusions) and 1, 9, 16 and 28 days post two successive

infusions of erythrocytes loaded with 10.76 and 15.47 mg of Dex 21-P, respectively.infusions of erythrocytes loaded with 10.76 and 15.47 mg of Dex 21-P, respectively.

CONCENTRAZIONI PLASMATICHE DI DESAMETASONECONCENTRAZIONI PLASMATICHE DI DESAMETASONE

Rossi L. et Blood Cells, Molecules and diseases, 2004 2005

0,001

0,01

0,1

1

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30Time (days)

Dexa

met

haso

ne

(nm

ol/m

l pla

sma)

10.76 mg Dex 21-P

15.47 mg Dex 21-P

The Glucocorticoid Receptor % saturation at steady state is:= [L]*100 / (Kd+ [L])

dissociation constant (Kd) of GR (glucocorticoid receptor) for dexamethasone on lymphocytes is 5,5 nM

and dexamethasone plasma concentration [L] at steady state is 0,025 nmol/ml.

80% GR saturation

Vantaggi del nuovo metodo di somministrazioneVantaggi del nuovo metodo di somministrazione

85% GR saturation

No soppressione del cortisolo plasmaticoNo soppressione del cortisolo plasmatico

      The Lipworth systematic review “Systemic Adverse Effects of Inhaled Corticosteroid Therapy” (Lipworth, 1999), shows suppression of 8 AM plasma cortisol level caused by inhaled and oral administration of corticosteroids (fluticasone, budesonide, triamcinolone and prednisolone). Below 0.3 mg/day in case of inhaled corticosteroids and below 4 mg/day in case of oral corticosteroids there is no evident cortisol suppression for any considered corticosteroid. Considering the average of Dex 21-P loaded in erythrocytes (8.9 mg) as constantly delivered in plasma by red blood cells along 28 days, the theoretical daily dose of intra-erythrocytic dexamethasone is 0.3 mg/day. Hence, the IED administered dose was supposed not to cause cortisol inhibition and therefore highly safe for patients.This conclusion was confirmed by the normal plasma cortisol level measured in 9 CF patients receiving intra-erythrocytic dexamethasone for 15 months during the preliminary clinical trial (Rossi et al.).

Systemic adverse effects are related to both dose and duration of treatment. Doses lower than 4 mg/day of oral corticosteroids cause no suppression of plasma cortisol.

22ndnd Follow-up Clinico Follow-up Clinicoefficaciaefficacia

Nove pazienti hanno ricevuto eritrociti con incapsulati Nove pazienti hanno ricevuto eritrociti con incapsulati

mediamente 8.9 mediamente 8.9 ± 3.8 mg di Dex 21-P ad intervalli mensili per 15 ± 3.8 mg di Dex 21-P ad intervalli mensili per 15

mesimesi

Parametri valutati durante il trattamento e nei 15 mesi precedenti Parametri valutati durante il trattamento e nei 15 mesi precedenti

::

-- FEV FEV11

-- infective relapses by infective relapses by Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

-- body mass index (BMI)body mass index (BMI) Parametri valutati durante il trattamentoParametri valutati durante il trattamento : : -- plasma level of IL-8 plasma level of IL-8

-- plasma level of TNF- plasma level of TNF-αα

30

40

50

60

70

80

90

100

- 15 0 15

Time (months)

FEV-

1(%

of

the

pred

icte

d va

lue)

CONTROLLICONTROLLIForced expiratory volume in 1 Forced expiratory volume in 1 second (FEVsecond (FEV11) in nine control ) in nine control CF patients submitted to CF patients submitted to usual therapeutic protocols. usual therapeutic protocols.

SOMMINISTRAZIONE DI RBC CON INCAPSULATO DEX 21-P E FUNZIONALITA’ SOMMINISTRAZIONE DI RBC CON INCAPSULATO DEX 21-P E FUNZIONALITA’ RESPIRATORIA RESPIRATORIA

TRATTATITRATTATIForced expiratory volume in Forced expiratory volume in one second (FEVone second (FEV11) in nine CF ) in nine CF patients that received patients that received erythrocytes loaded on the erythrocytes loaded on the average with 8.9±3.8 mg of average with 8.9±3.8 mg of Dex 21-P at 1 month interval. Dex 21-P at 1 month interval. P=0.03; Friedman’s testP=0.03; Friedman’s test

FEVFEV P=0.0002; Mann-Whitney U test between the two groupsP=0.0002; Mann-Whitney U test between the two groups

30

40

50

60

70

80

90

100

-15 0 15

Time (months)

FE

V-1

(%

of p

redic

ted v

alu

e)

VALORI FEV1 NEI SINGOLI PAZIENTIVALORI FEV1 NEI SINGOLI PAZIENTI

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

-1 5 1 5

anti

bio

tic

cycl

e/m

onth

TRATTATITRATTATIAntibiotic cycles per month in nine CF Antibiotic cycles per month in nine CF patients in 15 months precending Dex patients in 15 months precending Dex 21-P loaded RBC adiministrations (21-P loaded RBC adiministrations (AA) ) and in 15 months following Dex 21-P-and in 15 months following Dex 21-P-loaded RBC administrations (loaded RBC administrations (BB))

SOMMINISTRAZIONE DI RBC CON INCAPSULATO DEX 21-P E CICLI DI ANTIBIOTICO-TERAPIASOMMINISTRAZIONE DI RBC CON INCAPSULATO DEX 21-P E CICLI DI ANTIBIOTICO-TERAPIA

Infective relapses by Infective relapses by Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa were monitored by registering the were monitored by registering the frequency of antibiotic therapy cyclesfrequency of antibiotic therapy cycles

CONTROLLICONTROLLIAntibiotic cycles per month in Antibiotic cycles per month in nine control CF patients in a 30 nine control CF patients in a 30 months period. months period. AA first 15 months; first 15 months; BB second 15 second 15 monthsmonths

P=0.0002; Mann-Whitney U test between the two groupsP=0.0002; Mann-Whitney U test between the two groups

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

A BA B

51% riduzione 22% aumento

0

5

10

15

20

25

30

- 1 0 1 2 3 4 5 6

numero delle somministrazioni

IL-8 (

pg/m

l)

Mean IL-8 values in plasma samples of three CF patients (n. 10, 12 and 13) Mean IL-8 values in plasma samples of three CF patients (n. 10, 12 and 13)

during a five months period of treatment with Dex 21-P-loaded erythrocytes during a five months period of treatment with Dex 21-P-loaded erythrocytes

at one month interval. IL-8 was evaluated immediately before starting at one month interval. IL-8 was evaluated immediately before starting

therapy (time 0) and about one week post each infusion. Normal Values = therapy (time 0) and about one week post each infusion. Normal Values =

0-8.1 pg/ml0-8.1 pg/ml

LIVELLO PLASMATICO DI IL-8LIVELLO PLASMATICO DI IL-8

CONCLUSIONICONCLUSIONI

Tramite il red Cell Loader è possibile incapsulare il Tramite il red Cell Loader è possibile incapsulare il profarmaco desametasone 21-P nei globuli rossi autologhi di profarmaco desametasone 21-P nei globuli rossi autologhi di pazienti FCpazienti FC

La procedura di incapsulamento è riproducibile ed il La procedura di incapsulamento è riproducibile ed il trattamento è privo di effetti collateralitrattamento è privo di effetti collaterali

Gli eritrociti con il profarmaco incapsulato una volta reinfusi Gli eritrociti con il profarmaco incapsulato una volta reinfusi nei pazienti rilasciano il desametasone lentamente in circolo nei pazienti rilasciano il desametasone lentamente in circolo per almeno 28 giorni per almeno 28 giorni

Le basse concentrazioni di Desametasone somministrate Le basse concentrazioni di Desametasone somministrate tramite gli eritrociti sono state in grado di rallentare la tramite gli eritrociti sono state in grado di rallentare la progressione della patologia progressione della patologia (almeno 10 volte inferiori a quelle (almeno 10 volte inferiori a quelle somministrate in 2 settimane di terapia classica)somministrate in 2 settimane di terapia classica)

European Medicines Agency European Medicines Agency (EMEA) granting of orphan (EMEA) granting of orphan medicinal product designation medicinal product designation (EMEA/OD/39/04)(EMEA/OD/39/04)

in collaborazione con

Patologie infiammatorie intestinali (IBD) e

RBC ingegnerizzati

Ospedale “Bambino Gesù” Roma

Ospedale “Casa Sollievo della Sofferenza” San Giovanni Rotondo

PATOLOGIE INFIAMMATORIE INTESTINALI (IBD)

MORBO DI MORBO DI CROHNCROHN

INFIAMMAZIONE CRONICA DI TUTTI GLI STRATI DELLA PARETE INTESTINALE

FORMAZIONE DI FISTOLE E ASCESSI

COLITE COLITE ULCEROSAULCEROSA

INFIAMMAZIONE DELLA MUCOSA

SVILUPPO DI ULCERE MULTIPLE

Storia naturale e terapia Storia naturale e terapia steroideasteroidea

Colite Colite UlcerosaUlcerosa

2424%%

4747%%

2121%% 1919%% 77%%

M. diM. diCrohn Crohn

4343%%

4646%%

1818%% 2020%% 88%%

DiagnosiDiagnosi

1 anno1 anno

Steroido -Steroido -dipendentidipendenti

RespondersResponders

Non-RespondersNon-Responders

Globuli rossi con desametasone Globuli rossi con desametasone incapsulato in pazienti con m. di Crohn incapsulato in pazienti con m. di Crohn

(CD) e Colite Ulcerosa (UC)(CD) e Colite Ulcerosa (UC)

SCOPISCOPI Verificare efficacia in queste malattie Verificare efficacia in queste malattie

nell’induzione della remissione e nell’induzione della remissione e mantenimento della remissionemantenimento della remissione

Ridurre il fabbisogno steroidi Ridurre il fabbisogno steroidi sistemicisistemici

Evitare effetti indesiderati da steroidiEvitare effetti indesiderati da steroidi

Il trattamento nell’adulto Il trattamento nell’adulto del m. di Crohn e Colite Ulcerosa del m. di Crohn e Colite Ulcerosa

con Desametazone con Desametazone incapsulato in globuli rossi incapsulato in globuli rossi

Il trattamento nell’adulto Il trattamento nell’adulto del m. di Crohn e Colite Ulcerosa del m. di Crohn e Colite Ulcerosa

con Desametazone con Desametazone incapsulato in globuli rossi incapsulato in globuli rossi

Unità Operativa di GastroenterologiaUnità Operativa di GastroenterologiaOspedale IRCCS “Casa Sollievo della Sofferenza”Ospedale IRCCS “Casa Sollievo della Sofferenza”

San Giovanni RotondoSan Giovanni Rotondo

CasesCases Age,Age,sexsex

(yrs)(yrs)

DiseaseDisease SiteSite ClinicalClinicalactivityactivity

Endo.Endo.activityactivity

DurationDurationof the of the

diseasedisease(months)(months)

Duration of Duration of steroids steroids therapytherapy (months)(months)

Dosage of Dosage of PrednisolonePrednisolone

( mg)( mg)

Azat/ 6-Azat/ 6-MPMP**(mg/Kg)(mg/Kg)

11 36, m36, m UCUC Left Left ColonColon

RemisRemis MildMild 4848 1414 2020 1.25*1.25*

22 40, m40, m UCUC Pan-Pan-colitiscolitis

RemisRemis MildMild 108108 4343 1616 22

33 62, m62, m UCUC Left Left colitiscolitis

MildMild RemisRemis 2020 1414 2020 Intol.Intol.

44 28, m28, m UCUC Left Left colitiscolitis

RemisRemis MildMild 4141 1212 2424 2.52.5

55 28, f28, f UCUC Pan-Pan-ColitsColits

RemisRemis MildMild 142142 1313 1616 22

66 29, m29, m CDCD ColonColon RemisRemis MildMild 6060 1212 88 2.52.5

77 30, f30, f CDCD ColonColon MildMild MildMild 1616 99 2020 1.25*1.25*

88 30, m30, m CDCD ColonColon RemisRemis MildMild 6060 6060 88 2.52.5

99 33, m33, m CDCD ColonColon MildMild MildMild 7272 3030 1616 22

1010 44, m44, m CDCD ColonColon RemisRemis MildMild 9696 88 88 Intol.Intol.

Caratteristiche cliniche dei pazienti inseriti nello studio pilota

* patients under 6-Mercaptopurine

Azathioprine (AZA) or 6-Mercaptopurine (6-MP) are widely used as steroid-sparing, however, in one third of patients they are ineffective or not tolerated

Protocollo clinico

24

20

16

12

8

4

0

0 1 2 3 mesi

24

20

16

12

8

4

0

0 1 2 3 mesi

mgmg M. di CrohnM. di CrohnColite UlcerosaColite Ulcerosa

Riduzione fabbisogno steroidiRiduzione fabbisogno steroidi

Annese V. et al Am J Gastro 2005

Basal 3 months Basal 3 months

100

80

60

40

20

0

mm/hr

5

4

3

2

1

0

mg/dl

P<0.02 P<0.02

Ulcerative Colitis

Crohn’s disease

E.S.R C.R.P.

Velocità di eritrosedimentazione (ESR) e livelli plasmatici dellaproteina C reattiva (CRP)

Dotted lines represent upper limit of normal values (12 mmHr for ESR and 0.5 mg/dl for CRP).

0 2 4 6 8 10 12 14 16

10

8

6

4

2

0

mesimesi

N° pazienti in remissioneN° pazienti in remissionesenza steroidisenza steroidi

Follow-upFollow-up dopo 3 infusioni di Dexdopo 3 infusioni di Dex

N°N°

RBC CARICATI E MORBO DI CROHNRBC CARICATI E MORBO DI CROHN

•12 PAZIENTI (5-18 anni) CORTICODIPENDENTI

•PERIODO DI OSSERVAZIONE:24 MESI

PARAMETRI VALUTATI

•Assunzione di cortisone per bocca

•Pediatric Crohn’s Disease Activity Index (pCDAI)

• Indice di Massa Corporea (IMC)

•Giorni di permanenza in ospedale

•Mineralometria Ossea Computerizzata (MOC)

•Altri effetti collaterali dei glucocorticoidi (facies lunare,

striae rubrae, ipertensione….)

RBC CARICATI E MORBO DI CROHNRBC CARICATI E MORBO DI CROHNEFFICACIAEFFICACIA

VARIABILIVARIABILIMedia prima Media prima

deldel

trattamentotrattamento

Media a 24 Media a 24 mesimesi

SignificativitSignificativitàà

statisticastatistica

pCDAIpCDAI 23.823.8 9.69.6 p<0.05p<0.05

Steroidi/dieSteroidi/die 11.10 mg11.10 mg 2.9 mg2.9 mg p<0.05p<0.05

IMCIMC 20.520.5 20.420.4 n.s.n.s.

Giorni Giorni osp./annoosp./anno 30.1530.15 13.913.9 p<0.02p<0.02

MOC: 33% di miglioramento in 6 pazienti e nessuna variazione negli altri

ANDAMENTO ATTIVITA’ DI MALATTIA NEL ANDAMENTO ATTIVITA’ DI MALATTIA NEL M. DI CROHNM. DI CROHN

0

5

10

15

20

25

30

0 3 6 9 12 15 18 21 24

MESI

PC

DA

I

< 10 REMISSIONE

11-30 ATTIVITÀ LIEVE

> 30 ATTIVITÀ SEVERA

Castro M. et al J Ped. Gastr. Nutr. 2007

GR CARICATI E MORBO DI CROHNGR CARICATI E MORBO DI CROHNSICUREZZASICUREZZA

LIVELLI DI CORTISOLO EMATICOLIVELLI DI CORTISOLO EMATICO

LIVELLI DI CORTISOLO EMATICO MATTUTINO NELL'INTERVALLO TRA DUE INFUSIONI

0

5

10

15

20

0 1 3 7 14 21 28

GIORNI

CO

RT

ISO

LO

(m

cg

/dl)

GR CARICATI E RETTOCOLITE ULCEROSAGR CARICATI E RETTOCOLITE ULCEROSA

TUTTI CORTICODIPENDENTI

INDICE CLINICO UTILIZZATO: CAI (Colitis Activity Index)

(Rachmilewitz et al, BMJ 1989; 298: 82-86)

TOTALE PAZIENTI TRATTATI: 8

PAZIENTI ATTUALMENTE IN TRATTAMENTO: 7

NUMERO INFUSIONI TOTALI: 67

ANDAMENTO ATTIVITA’ DI MALATTIA NELLA UCANDAMENTO ATTIVITA’ DI MALATTIA NELLA UC

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

mesi

CA

I

REMISSIONE

•…..NESSUN PAZIENTE HA ASSUNTO CORTISONE PER BOCCA

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

TOTALE INFUSIONITOTALE INFUSIONI

INIZIO PROGETTO FIRB

“Bambino Gesù” Pediatric Hospital (Rome)

Numero di infusioni di eritrociti con incapsulato il

desametasone 21-P in pazienti FC e IBD fino a tutto il

2006

1423

“Casa Sollievo della Sofferenza” Hospital (S. Giovanni Rotondo)

Numero di infusioni di eritrociti con incapsulato il

desametasone 21-P in pazienti IBD fino a tutto il 2006

234

TOTALE1657

RBC e Targeting

Glicoforina C

Banda 3Anchirina

Spettrina

Proteina 4.1

Actina

Adducina

Proteina 4.2

Dematina

RBC e Banda 3

opsonized erythrocyte

Targeting selettivo di farmaci a cellule macrofagiche

BS3

Band 3 clusters

band 3

drug-loaded erythrocyte

opsonized erythrocyte

ZnCl2

irreversibleclusters

Serum IgG

macrophage

Alcuni patogeni con tropismo macrofagico

Listeria Monocytogenes

Batterio

Brucella spp. “

Salmonella spp. “

Mycobacteria spp. “

Herpes simplex Virus

Varicella zoster “

Cytomegalovirus “

HIV-1 “

Candida spp. Fungo

Toxoplasma gondii Protozoo

TARGETING DI FLUDARABINATARGETING DI FLUDARABINA

A MACROFAGI INFETTATI CON HIV-1A MACROFAGI INFETTATI CON HIV-1

TRAMITE ERITROCITITRAMITE ERITROCITI

obiettivo

Deplezione selettiva di macrofagi infettati

O

HO

HO

CH2P

O

OH

OHO

F

NH2

N

N

N

N

Fludarabine (9--D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine-5’-monophosphate)

JK/STAT PATHWAY JK/STAT PATHWAY

0100200300400500

1 6 10 20Days post infection

% S

tat1

0100200300400500

1 6 10 20

Days post infection

% p

Sta

t1

Analisi quantitativa dei livelli di STAT-1 e pSTAT1

Magnani M. et al. J. Leuk. Biol. 2003

A: Uninfected macrophages+UL-RBC;

B: Infected macrophages+UL-RBC;

C: Uninfected macrophages+L-RBC;

D: Infected macrophages+L-RBC.

Pictures have been taken after a single 18-hours treatment with RBC.

La somministrazione di eritrociti con incapsulata Fludarabina ha eliminato i macrofagi infettati da HIV-1

controlli trattati infettati trattati

COSA C’E’ DI NUOVO?

Studi preclinici di globuli rossi con farmaci nel trapianto di isole

pancreatiche

Studi preclinici di globuli rossi con farmaci nel trapianto di isole

pancreatiche

Federico Bertuzzi Istituto Scientifico San Raffaele, Milano

MECCANISMO D’AZIONE DEI NONAMINOBISFOSFONATI

I nonaminobisfosfonati sono metabolicamente incorporati in analoghi nucleotidici

Aminoacido + ATP aminoacido-AMP + PPi

Aminoacido-AMP + pCCl2p aminoacido + AppCCl2p

O-

O-

O

PC

O-

O-

O

P

Cl

Cl

Clodronate pCCl2p

analogo di ATP tossico per le cellule

PROSPETTIVE CLINICHE DEGLI ERITROCITI CON CLODRONATE INCAPSULATO

Somministrazione di RBC-clodronate nei trapianti

Somministrazione di RBC-clodronate nelle patologie

autoimmuni

Somministrazione di RBC-clodronate nelle patologie

infiammatorie

Somministrazione di RBC-clodronate nelle patologie

causate da patogeni con tropismo macrofagico (HIV-1,

Mycobacteria spp., Listeria monocytogenes, Herpes

simplex virus, etc.)

500 micron

IL TRAPIANTO DI ISOLEIL TRAPIANTO DI ISOLE

Post-transplant days

P=0.011

P=0.0013

P=0.0014

100

80

60

40

20

0

Sur

viva

l (%

)

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

Control mice

Free clodronate treated mice

Clodronate-loaded RBC mice

Strategie per ridurre la reazione infiammatoria:Ruolo degli eritrociti caricati con clodronato

Day 1:

Unloaded RBC mice

Graft survival

Controls 19.4 ± 0.9 daysRBC unloaded 20 ± 2 daysFree clod 25 ± 1.9 daysRBC clod-loaded 35 ± 6 days

Rejection occured when 3 consecutive blood glycemic values after transplantation were found over 250 mg/dl

Prospettive future

Carriers di nanoparticelle Carriers di nanoparticelle magnetichemagnetiche

Carriers di agenti di contrasto nell’IR

Choroidal neovascular membrane (CNVM) is a problem that is related to a wide variety of retinal diseases, but is most commonly linked to age-related macular degeneration.

AMD DISEASE

Fluorescein angiography (fluorescein - the type of dye that is used; angiogram - a study of the blood vessels) is an extremely valuable test that provides information about the circulatory system and the condition of the back of the eye. FAs are useful for evaluating many eye diseases that affect the retina.

Fluorescein angiogram indicating fluid leakage

within the retina.

Retinal photograph of a patient complaining of decreased vision.

Riesce ad identificare i neovasi sottoretinici solo nel 15% dei casi

Indocyanine Green Dye Study

An Indocyanin Green study (ICG) is a special dye test used to evaluate the circulatory system of the choroid, the layer just behind the retina. ICG reacts to light with a longer wavelength than fluorescein dye, allowing the doctor to pinpoint the location of leaking vessels deeper within the eye that may not be apparent with fluorescein angiography.

Sfrutta emissione dell’ICG nell’infrarosso, cosa che permette di visualizzare la coroide consentendo di evidenziare circa il 60-70% dei vasi occulti

ICG può uscire dai neovasi Perchè non usare un carrier?

membrane swelling and opening of

pores

erythrocyte

washing

nanomaterial loaded

erythrocyte

resealing

magnetic nanoparticles

Carriers di nanoparticelle Carriers di nanoparticelle magnetichemagnetiche

membrane swelling and opening of pores

erythrocyte

washing

loaded erythrocyte

resealing

mesoporous nanospheres or nanotubes filled or loaded with

drugssilica magnetite

LOADING

erythrocytes loaded are reinfused in the patient

magnetic field

TEM analysis

RBC-SiMagn6D-Loaded

UK Patent Application GBP95309 of 03 July 2006UK Patent Application GBP95309 of 03 July 2006 Delivery of Contrasting Agents for Magnetic Delivery of Contrasting Agents for Magnetic

Resonance ImagingResonance Imaging

““Erytrocytes exposed to dialysis with an hypotonic Erytrocytes exposed to dialysis with an hypotonic buffer stably take up superparamagnetic iron oxide buffer stably take up superparamagnetic iron oxide particles and may be used MRI contrast agents. particles and may be used MRI contrast agents. Such erythrocytes may also be used as drug Such erythrocytes may also be used as drug delivery vehicles”delivery vehicles”

Università degli Studi di Urbino “Carlo Bo” Università degli Studi di Urbino “Carlo Bo”

FEBBRAIO 2007

Tutto ciò ha permesso la nascita di una nuova

START UP

EryDel s.r.l. Viale F. Brandani, 18 Urbino (PU)info@erydel.com – www.erydel.com