LINEA PROGETTUALE 5

Valutazione degli effetti tossicologici dell’aria prelevata in prossimità degli impianti di incenerimento

LP5 – Valutazione degli effetti tossicologici dell’aria prelevata in prossimità degli impianti di incenerimento

• Modelli in vitro per la valutazione della risposta infiammatoria

• Studio dell’impatto ambientale da sostanze genotossiche derivanti dall’attività degli impianti di incenerimento

• Modelli in vitro predittivi del rischio cancerogeno

• Approcci di tossicogenomica per l’individuazione di profili genici di espressione in linee cellulari esposte al particolato

• Valutazione dl rischio cancerogeno

• Arpa ER – Laboratorio tematico Mutagenesi Ambientale

• Arpa ER – Centro tematico regionale Cancerogenesi Ambientale e Valutazione del Rischio

• Università di Bologna – Dipartimento Patologia Sperimentale – Sezione Cancerologia

• Università di Ferrara – Dipartimento di Medicina sperimentale e diagnostica

• Università di Parma – Dipartimento di Genetica, biologia dei microorganismi, antropologia, evoluzione

Responsabile: dott. Annamaria Colacci

Cosa e’ stato indagato

• Base razionale– L’esposizione a

contaminanti ambientali può innescare una serie di eventi che si traducono in effetti a carattere acuto o cronico

– La risposta immediata è di tipo infiammatorio

– Gli effetti acuti, al perdurare dell’esposizione, tendono a cronicizzarsi e a creare un ambiente ideale per l’insorgenza di effetti più gravi e a lungo trmine

• Domande– È possibile tracciare a

livello biologico e molecolare le diverse fasi dell’eventuale risposta a una esposizione ambientale puntiforme, quale quella rappresentata da un inceneritore?

– E’ possibile identificare marcatori di esposizione precoci che potessero esser utili in una predizione del rischio per la salute umana?

Cosa e’ stato indagato

AZIONE 1

AZIONE 1

AZIONE 2

AZIONE 2

AZIONE 3

AZIONE 3

AZIONE 4

AZIONE 4

AZIONE 5

AZIONE 5

S. Pietro Capofiume

(fuori dominio)

NE 44.6, 11.6

Calamosco

Giardini Frullo EST

Veduro

F19

Frullo Ovest

Pianeta

Analisi tossicologica Stima del rischio cancerogenoFrullo EST Frullo ESTCalamosco Calamosco

Giardini Margherita Giardini MargheritaS. Pietro Capofiume S. Pietro Capofiume

Frullo OvestF19

VeduroPianeta

Siti considerati

Rurale

Frullo Biancovs

Urbano

Analisi tossicologica: i

confronti

Gli esiti del confronto

I risultati ottenuti nella LP5 sono concordi nel mostrare un profilo tossicologico simile nei campioni di aria prelevati nel sito di massimo impatto dell’inceneritore (Frullo Est) e nel sito appartenente allo stesso dominio, ma non interessato dalla ricaduta dei fumi dell’impianto (Calamosco). Molti indici, anzi, imputano al sito Calamosco un’attività tossicologica più elevata. Sulla base dei risultati ottenuti si può concludere che l’inceneritore oggetto di questo studio non incrementa il rischio da esposizione a aria inquinata

Fondamenta delle conclusioni

L’analisi tossicologica

Azione 5

Il materiale raccolto per l’analisi tossicologica

I campioni analizzati

Per ogni sito di raccolta, e’ stato ottenuto un unico campione per stagione derivato dall’estrazione in acetone di tutti i filtri

Endpoint misurati

Gli endpoint biologici: infiammazione

La risposta infiammatoria

Figura 7 - Studio comparativo dell’attività di rilascio di IL-1beta stimolata da particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Monociti sono stati isolati dal sangue periferico di donatori , incubati in piastra (5 x 105/ml/piastra, 24 piastre) per 5 giorni e poi esposti a particolato alle concentrazioni di 80, 160, 320 µg/ml per 6 ore, I dati sono riportati come media di 3 repliche per punto per 2 donatori (totale 6 repliche)

Effetto analizzato Modello/Test Endpoint misurato Significato biologico

Risposta Infiammatoria

monociti primari di donatori sani

Rilascio di ATP e di IL1-beta

Le molecole ricercate sono rilasciate come risposta immediata a uno stress cellulare

Mutagenesi - Ames

Test su Salmonella - PM2,5 Inverno 2009

Salmonella assay - PM2,5 Winter 2009

0

20

40

60

80

SuperSite C. Calam. S. Pietro C. G. Margh.

rev

ert

en

ti/m3 -

re

ve

rta

nts

/m3

TA98 TA98+S9 TA100 TA100+S9

Figura 9 – Comparazione degli effetti mutageni dei campioni invernali

Differenze non significative nell’ambito dello stesso ceppo batterico

Effetto analizzato Modello/Test Endpoint misurato Significato biologico

Danno genetico

Salmonella typhimurium (Test di Ames)

Retromutazioni E’ il test di elezione per individuare l’induzione di mutazioni puntiformi

mutagenesi - COMET

Figura 10 - Studio comparativo dell’attività mutagena (Test della cometa) di particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Leucociti di donatori sani (106 leucociti/piastra) sono stati incubati con concentrazioni scalari (1.25, 2.5, 5 m3) di estratto per 1 h. Il DNA da cellule lisate, sottoposto a corsa elettroforetica su vetrino e marcato con bromuro di etidio viene osservato in fluorescenza. Il valore quantitativo del danno è dato dal coefficiente angolare delle rette di regressione dose-effetto dei campioni positivi e di quelli che presentano, comunque, un R2 ≥ 0,60. La significatività viene calcolata rispetto al controllo non trattato tramite test della medianaSupersite = Frullo EST

Inverno 2009_PM2,5_ Test della CometaWinter 2009_PM2,5_ Comet assay

0

5

10

15

0 1,25 2,5 5 0 1,25 2,5 5 0 1,25 2,5 5 0 1,25 2,5 5

SuperSite C. Calamosco S.Pietro C. G. Margheritam 3

me

dia

TI%

- m

ea

n T

I%

Estate 2008_PM2,5_ Test della CometaSummer 2008_PM2,5_ Comet assay

0

5

10

15

0 1,25 2,5 5 0 1,25 2,5 5 0 1,25 2,5 5 0 1,25 2,5 5

SuperSite C. Calamosco S.Pietro C. G. Margherita

m 3

me

dia

TI%

- m

ea

n T

I%

Effetto analizzato Modello/Test Endpoint misurato Significato biologico

Danno genetico

rotture a singolo e/o doppio filamento del DNA e siti in cui la struttura del DNA è deformata

Evidenzia danno primario a carico del DNA nelle singole cellule non ancora riparato, né fissato.

rotture a singolo e/o doppio filamento del DNA e siti in cui la struttura del DNA è deformata

Mutagenesi - Micronucleo

Figura 11 - Studio comparativo dell’attività mutagena (test del micronucleo) di particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Linfociti di donatori sani (105 leucociti/piastra) sono stati incubati con concentrazioni scalari (0, 3, 6, 12 m3) di estratto in due repliche indipendenti .Supersite = Frullo EST

Estate 2008_PM2,5_ Test dei Micronuclei

Summer 2008_PM2,5_ micronucleus assay

0

5

10

15

20

0 3 6 12 0 3 6 12 0 3 6 12 0 3 6 12

SuperSite Ch. Calamosco S. Pietro C. G. Margherita

m 3

med

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1,0

2,0

3,0

CB

PI

MN mean Citokynesis-Block P roliferation Index (CBP I) mean

Inverno 2009_PM2,5_ Test dei MicronucleiWinter 2009_PM2,5_ Micronucleus assay

0

5

10

15

20

0 3 6 12 0 3 6 12 0 3 6 12 0 3 6 12

SuperSite Ch. Calamosco S. Pietro C. G. Margherita

m 3

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CB

PI

MN mean Citokynesis-Block P roliferation Index (CBP I) mean

Effetto analizzato Modello/Test Endpoint misurato Significato biologico

Danno genetico

Micronucleo in linfociti periferici

Formazione di micronuclei (frammentazione del nucleo)

Evidenzia rotture dei cromosomi (sostanze clastogene) o perdita dei medesimi (sostanze aneugeniche)

Cancerogenesi in vitro

• L’endpoint di citotossicità misura il grado di sopravvivenza della cellula all’effetto tossico acuto del trattamento

FRULLO EST

****

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 6 12

m3

me

an

co

lon

y n

um

be

r ±

se

CALAMOSCO

****

0

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0 1 2 6 12

m3m

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SAN PIETRO

****

****

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MARGHERITA

****

****

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FRULLO EST

******

**

0

50

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150

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MARGHERITA

****

**

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0 1 2 6 12

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mea

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S. PIETRO C.

**

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0 1 2 6 12

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CALAMOSCO

**

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0 1 2 6 12

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Estate 2008 Inverno 2009

Figura 12– Effetti citotossici misurati in cellule BALB/c 3T3 dopo esposizione a particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Le cellule (250 cellule/piastra) sono state incubate per 48 ore con concentrazioni scalari di estratto. I dati sono riportati come numero di colonie per piastra w sono una media (±ES) di 5 repliche. Significatività statistica: * p<0.05, vs controllo solvente, Student t test; ** p<0.01, vs controllo solvente, Student t test.

Cancerogenesi in vitro

A B

Figura A3 - Piastre di un esperimento di trasformazione. A – controllo negativo - cellule trattate con il solvente (DMSO). B – controllo positivo - cellule trattate con il cancerogeno (3-MCA)

Figura A4- Focus ottenuto per trattamento con il cancerogeno (3-MCA) (ingrandimento 40x)

cancerogenesi in vitro

Figura 13 – Frequenza di trasformazione in cellule BALB/c 3T3 dopo esposizione a particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Le cellule (30.000 cellule/piastra) sono state incubate per 48 ore con concentrazioni scalari di estratto. I dati sono riportati come Trasformation frequency (TF) un indice ricavato dal numero di foci maligni di origine monoclonale riscontrato in ogni trattamento per il numero delle cellule a rischio (cellule sopravvissute all’effetto tossico acuto dell’estratto). Significatività statistica: ** p<0.01, vs controllo solvente, , Poisson rates comparisonMCA = 3-metilcolantrene, utilizzato come controllo positivo (cancerogeno) alla concentrazione di 2.5 µg/ml/piastra

Estate 2008 Inverno 2009

FRULLO EST

**

0

5

10

15

20

25

30

35

DMSO MCA 1 2 6 12

m3

TF

(X

10

-4)

CALAMOSCO

**

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MARGHERITA

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DMSO MCA 1 2 6 12

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TF

(X1

0-4

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S. PIETRO

**

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DMSO MCA 1 2 6 12

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TF

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-4)

FRULLO EST

**

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DMSO MCA 1 2 6 12

m3

TF

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S. PIETRO

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DMSO MCA 1 2 6 12

m3

TF

(X1

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MARGHERITA

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DMSO MCA 1 2 6 12

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(X10

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CALAMOSCO

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DMSO MCA 1 2 6 12

m3

TF

(X

10

-4)

Gli endpoint biomolecolari:trascrittomica (profili genici)

• Tossicogenomica– (disciplina) studia in quale modo il genoma di un organismo risponde ai fattori

ambientali di stress e agli inquinanti. – combina la tossicologia con la genomica per comprendere il ruolo delle

interazioni gene-ambiente nella insorgenza dei disturbi e delle patologie legate a specifiche esposizioni

• Trascrittomica – Una delle tecnologie omiche della tossicogenomica– Mediante l’utilizzo della tecnica di DNA microarray si valuta la variazione di

espressione di migliaia di geni (l’intero genoma che, a seconda dell’organismo, va da qualche migliaio di geni a decine di migliaia) in cellule che siano state esposte a singoli composti, chimici, miscele complesse di composti o, come nel caso di questo studio, a estratti di matrici ambientali.

– Con questo approccio è anche possibile identificare il modo d’azione o il meccanismo d’azione di composti chimici. Ogni esposizione determina uno specifico profilo trascrizionale, cioè un certo numero di geni che risulta differentemente espresso in seguito all’esposizione

Gli endpoint biomolecolari:trascrittomica (profili genici)

esposizione

Gli endpoint biomolecolari:profili genici

Gli endpoint biomolecolari :profili genici di cellule T47D

Figura 15 - Analisi delle componenti principali (PCA) in cellule T47D esposte agli estratti di particolato raccolto in tre siti prescelti. I dati sono il risultato di tre repliche biologiche. Il controllo è rappresentato da cellule non trattate

FES

CS

GMS

GMW

FEW

CW

.• Frullo Est e Calamosco differiscono tra loro per un

numero esiguo di geni, mostrando, anche in questo approccio biomolecolare, che i campioni d’aria raccolti in questi due siti hanno un profilo tossicologico sostanzialmente simile e differiscono in egual misura dal profilo identificato per il campione Giardini Margherita

Gli endpoint biomolecolari :profili genici di cellule T47D

• I risultati danno evidenza che la gran parte dei processi modulati sia in FrulloEst che in Calamosco si raggruppano nei seguenti percorsi biologici:– Attivazione del sistema immunitario e della risposta

infiammatoria, – Regolazione della coagulazione ed emostasi – Modulazione di processi di regolazione della crescita

cellulare.

Gli endpoint biomolecolari :profili genici di cellule T47D

• HuMI– ha risentito del forte effetto citotossico degli estratti in esame, che ha

determinato uno spegnimento a carico di molti geni, tanto da non risultare particolarmente informativa. Infatti, gia’ dopo solo 4 ore di trattamento con la dose 8 m3 l’effetto trascrizionale prevalente nella popolazione cellulare trattata è quello di un massiccio arresto della proliferazione dovuta all’insulto tossico.

• A549, – citotossicita’ indotta dagli estratti e’ stata piu’ modesta, e l’ inibizione

trascrizionale ha riguardato solo certi processi biologici relativi alla migrazione leucocitaria nei tessuti e ai sistemi di adesione tra cellule.

– E’ inoltre rilevante sottolineare che il solo trattamento con l’estratto di Calamosco comparato a G. Margherita interferisce con l’assemblaggio della cromatina, processo questo che viene riportato come significativo nella risposta a forti contaminazioni ambientali in bambini che vivono in zone altamente impattate dalla presenza di miniere di carbone.

• BALB/c 3T3, – è stato evidenziato un maggior effetto tossico da parte di Calamosco, attivati con

una attivazione anche dei marcatori di morte cellulare per apotosi.

Gli endpoint biomolecolari:altre linee cellulari

Fondamenta delle conclusioni

La valutazione del rischio cancerogeno

La valutazione del rischio tossicologico

• La valutazione del rischio si basa sull’utilizzo di modelli predittivi che consentono di stimare la probabilità che, in seguito a una specifica esposizione, un effetto avverso si verifichi in misura maggiore di quanto non accade in assenza di tale esposizione

• Questo concetto di “eccesso” di rischio sottolinea che la linea di partenza non corrisponde mai al rischio zero (assenza di

rischio).

Tossicità e rischio: le definizioni secondo l’OCSE

• Toxicity (= tossicità)– Capacità intrinseca di un composto chimico o di una

miscela di sostanze di indurre danno

• Hazard (= pericolosità)– Manifestazioni tossiche osservate indotte una quantità

nota di una sostanza in condizioni note di esposizione• Tossicità intrinseca

• Risk (rischio)– Probabilità che un pericolo (o più pericoli)

identificato(i) si possa realizzare in condizioni di esposizione prevedibili

– Risk = Hazard x Exposure

La valutazione del rischio tossicologico

– Stima del rischio cancerogeno

• UR (unità di rischio) (o potenza o hazard), – numero di tumori in eccesso attesi entro una certa dimensione

di popolazione come conseguenza di una esposizione quotidiana per tutta la vita a una dose unitaria del cancerogeno.

–

• Ci si basa sulla reale esposizione giornaliera, misurata o stimata (esposizione = E).

• Il rischio è pertanto dato da: UR x E.

Rischio in eccesso non deve superare 1 x 10-6

Siti considerati Campioni MicroinquinantiFrullo EST PM 2.5 IPA

Calamosco PM 1 nitroIPAGiardini Margherita diossine/furaniS. Pietro Capofiume PCB

Frullo OvestF19

VeduroPianeta

Stima del rischio cancerogeno

Rischio di cancro

PM2.5 Estate Inverno

B(a)PFrullo est 1.10 x10-8 3.99 x10-7

Calamosco 1.43 x10-8 10.22 x10-7

Frullo ovest 1.21 x10-8 1.94 x10-7

F19 1.98 x10-8 3.72 x10-7

Castenaso 1.32 x10-8 3.31 x10-7

Margherita 0.99 x10-8 2.96 x10-7

Pianeta 1.76 x10-8 2.09 x10-7

Veduro 0.44 x10-8 4.42 x10-7

I microinquinanti: IPA e NitroIPA (risultati)

Rischio di cancro

PM2.5 Estate Inverno

B(a)P eqFrullo est 0.93 x10-5 1.04 x10-4

Calamosco 0.58 x10-5 2.15 x10-4

Frullo ovest 0.75 x10-5 0.64 x10-4

F19 1.04 x10-5 0.88 x10-4

Castenaso 0.61 x10-5 0.85 x10-4

Margherita 0.51 x10-5 0.65 x10-4

Pianeta 0.61 x10-5 1.35 x10-4

Veduro 0.42 x10-5 1.17 x10-4

Fattori di equivalenza (Potency Equivalence factors, PEF)

derivanti da studi di cancerogenesi nei piccoli roditori dove disponibili, correlano il potenziale cancerogeno di IPA e NIPA a quello del Benzo(a)pirene [B(a)P] pari a 1

Potenza cancerogenaè stimata sulla base della somma dei valori trasformati in B(a)P equivalenti di ogni singolo componente

I microinquinanti: Diossine e PCB

• WHO (World Health Organization)

– TDI– 2 pg/kg p.c./die – assunzione massima senza

effetti sia tossico-riproduttivi (a soglia) che cancerogeni (la TCDD è un promovente)

• USA– cancerogeno con relazione

lineare tra dose e risposta e quindi senza soglia

– UR = 3.8 x10-5 per assunzione di 1 pg TCDD/mc/die per tutta la vita.

PCDD and PCDF WHO-TEF (1998) WHO-TEF (2005)2,3,7,8-TCDD 1 11,2,3,7,8-PnCDD 1 11,2,3,4,7,8-HxCDD 0.1 0.11,2,3,6,7,8-HxCDD 0.1 0.11,2,3,7,8,9-HxCDD 0.1 0.11,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0.01 0.01OCDD 0.0001 0.00032,3,7,8-TCDF 0.1 0.11,2,3,7,8-PnCDF 0.05 0.032,3,4,7,8-PnCDF 0.5 0.31,2,3,4,7,8-HxCDF 0.1 0.11,2,3,6,7,8-HxCDF 0.1 0.11,2,3,7,8,9-HxCDF 0.1 0.12,3,4,6,7,8-HxCDF 0.1 0.11,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0.01 0.011,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0.01 0.01OCDF 0.0001 0.0003

PCB (n. IUPAC)3,4,4',5-TCB (81) 0.0001 0.00033,3',4,4'-TCB (77) 0.0001 0.00012,3,4,4',5-PnCB (123) 0.0001 0.000032,3',4,4',5-PnCB (118) 0.0001 0.000032,3,4,4',5-PnCB (114) 0.0005 0.000032,3,3',4,4'-PnCB (105) 0.0001 0.000033,3',4,4',5-PnCB (126) 0.1 0.12,3',4,4',5,5'-HxCB (167) 0.00001 0.000032,3,3',4,4',5-HxCB (156) 0.0005 0.000032,3,3',4,4',5'-HxCB (157) 0.0005 0.000033,3',4,4',5,5'-HxCB (169) 0.01 0.032,3,3',4,4',5,5'-HpCB (189) 0.0001 0.00003

I microinquinanti: Diossine e PCB

Rischio di cancro

PM2.5 Estate Inverno Estate Inverno

PCB totali TCDD+PCDF+DL-PCB TCDD eq

Frullo est 4.27 x10-8 6.05 x10-8 6.59 x10-7 6.77 x10-7

Calamosco 3.59 x10-8 7.34 x10-8 6.54 x10-7 9.23 x10-7

Pianeta 4.20 x10-8 6.68 x10-8 5.99 x10-7 9.01 x10-7

Considerazioni conclusive

• I risultati ottenuti nella LP5 sono concordi nel mostrare un profilo tossicologico simile, anche se non completamente identico, nei campioni di aria prelevati nel sito di massimo impatto dell’inceneritore (Frullo Est) e nel sito appartenente allo stesso dominio, ma non interessato dalla ricaduta dei fumi dell’impianto (Calamosco).

• Molti indici, anzi, imputano al sito Calamosco un’attività tossicologica più elevata. Anche l’analisi dei microinquinanti rilevati in tutti i siti dove è stata eseguita la raccolta dei campioni e la caratterizzazione chimica del particolato non mostra situazioni preoccupanti legate alla predizione di un eccesso di rischio di tumori imputabili all’attività dell’impianto di incenerimento.

Considerazioni conclusive

• Ci sono rischi per la salute della popolazione attualmente residente nelle aree interessate dall’inceneritore di Bologna (Frullo)?– Dai risultati di questo studio, l’inceneritore non incrementa il rischio da

esposizione a aria inquinata.

• E’ possibile applicare questi risultati ad altri inceneritori?– Sì, se questi inceneritori hanno la stessa tecnologia dell’inceneritore

studiato

• Che significato ha questo studio? Si può considerare completo e definitivo?– Applicando test e procedure internazionalmente riconosciuti per valutare

la pericolosità delle sostanze, abbiamo delineato un metodo sensibile e specifico che potrà essere applicato in futuro per l’eventuale monitoraggio degli inceneritori e per studiare nuove, eventuali, situazioni di esposizione.