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• Sintesi (sul lato citoplasmatico del RER) e maturazione delleproteine di membrana, delle proteine secretorie e di quelledestinate al Golgi e ai lisosomi.

• Modifiche post traduzionali delle proteine:1. Taglio proteolitico del peptide segnale*2. Struttura (Folding)3. Modifiche covalenti a carico di aminoacidi4. Realizzazione di eventuali legami disolfuri5. Eventuale inserimento di un àncora lipidica (GPI),6. Aggiunta di una struttura glucidica complessa

(glicosilazione N-terminale)

RE granuloso(RER)

vedi lezione precedente

1- Taglio proteolitico del peptide segnale

Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Reticolo endoplasmatico

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2-Le molecole “chaperone” intervengono nel ripiegamento (folding) delleproteine appena traslocate.

Bip interagisce con i primidomini idrofobici delpolipeptide nascente el’interazione termina quandole porzioni idrofobicheinterascono fra di loro e sonocoperte delle porzioniidrofiliche della proteinaterminata



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3- Modifiche covalenti a carico di aminoacidi

Tra le modifiche covalenti a carico di aminoacidi si può citare il casodell’idrossiprolina e dell’idrossilisina. Questi aminoacidiparticolarmente abbondanti nel collagene dei tessuti connettivi umani,non fanno parte dei venti tipi compresi nel codice genetico, marisultano dall’idrossilazione post-traduzionale della prolina e dellalisina. L’idrossilazione si verifica nel RER, grazie allintervento diidrossilasi per la cui attività è indispensabile la presenza dell’acidoascorbico (vitamina C).



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PDI= proteina disolfuro isomerasi

La proteinadisolfuro isomerasiè localizzata nellume del RER e haper funzione dicatalizzare i legamidisolfuri



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4- Realizzazione di eventuali legami disolfuri

La corretta strutturatridimensionale delleproteine è monitoratadall’interazione conproteine residenti nelRER. Soltanto proteinecorrettamente ripiegate econ legami disolfuricorretti possono essereconvogliate versol’apparato di Golgi.



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Capacità di correzione: I meccanismi cellulari non sono perfetti ma l’evoluzione haselezionato efficienti meccanismi di identificazione degli errori e di correzione.

La proteina disolfuroisomerasi svolge ancheuna funzione dicorrezione dei legamidisolfuri non corretti.



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5- inserimento di un àncora lipidica. GPI:glicosilfosfatidilinositolo

Un piccolo masignificativo gruppo diproteine traslocateall’interno del RE vienemodificato per legamecovalente a un fosfolipide.

Enzima checatalizzal’aggancio

Notare la localizzazionedelle principale fasidella reazione. Laproteina cosi ancoratasarà esposta allasuperficie esterna dellacellula



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Dopo che una proteina è stata glicosilata, subisce varie modificazioni nella strutturaoligosaccaridica, inclusa la rimozione di alcuni residui glucidici.

Rimozione di unmannosio

Rimozione di 3molecole diglucosio



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Gli oligosaccaridi sono utilizzati come etichette perindicare lo stato di ripiegamento delle proteine



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1- Rapida “Spunta” di glucosio ma proteina noncorrettamente ripiegata perciò non può andareverso Golgi



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2- Con il riconoscimento dell’ultimo glucosio, interazionecon calnessine (o calreticuline) che sono “chaperone” efavoriscono il ripegamento delle proteine. Queste chaperoneassociano anche ERp57 che favorisce la corretta formazioneponti disolfuri



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4- la proteina si stracca dalla chaperone perché la glucosidase II rimuove l’ultimoglucosio: se la proteina non è correttamente ripegata viene riconosciuta dalla glicosiltrasferasi (UGGT) che aggiunge nuovamente un glucosio.



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5- In questa forma la proteina viene nuovamente associata alla calnessina: processociclico fino a ripiegamento corretto.



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5- La proteina correttamente ripiegata può essere trasportata verso il Golgi



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6- La proteina non correttamente ripiegata viene mandata verso i sistemi di degradazionedelle proteine (proteosoma)



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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Apparato di Golgi

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L’apparato del Golgi è un organello a più compartimenti, che contengonoun’ordinata serie di enzimi, che sequenzialmente modificano le glicoproteine e ilipidi quando essi transitano dalle cisterne cis a quelle trans; le molecole cargodevono pertanto passare attraverso ciascun compartimento di questo organello.

Gli oligosaccaridi legati ad N sono i più comuni presenti nelle glicoproteine;meno frequentemente gli oligosaccaridi sono legati al gruppo ossidrilico nellacatena laterale della serina, treonina o idrossilisina; questi oligosaccaridi legatiad O si formano nell’apparato di Golgi.



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•L’apparato di Golgi è formato dacisterne o sacchi discoidali impilati gliuni su gli altri cui sono associatepiccole vescicole.

•E’ di solito situato vicino al nucleo,attorno ai centrioli.

•Ogni gruppo di cisterne forma unapila di circa 1 um di diametro dettapila di Golgi o dittiosoma.

•L’apparato di Golgi è coinvolto nellamodificazione, nella separazione enell’impacchettamento di macro-molecole per la secrezione o per laspedizione ad altri organelli.



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Cis face

Trans face

Nell’apparato di Golgi esiste una polarizzazione strutturale e biochimica.Si distinguono due facce: una faccia cis o di formazione (convessa) rivolta versoil nucleo ed una fascia trans o di maturazione (convava) rivolta verso la periferiadella cellula.



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Le vescicole che si trovanoin prossimità della facciacis, contengono proteineneo sintetizzate, che sistaccano dal reticoloendoplasmatico e penetranonell’apparato di Golgi.A livello della faccia transsi accumulano invecevescicole contenentiproteine che verrannodistribuite nelle varie partidella cellula o escreteall’esterno di essa. trans

cis

Trasporto anterogrado



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A livello dell’apparato di Golgiavvengono i seguenti fenomeni:•Glicosilazioni, o comunquemodificazioni nei residui oligosaccaridicigià associati alle proteine.•Modificazione della struttura di alcuneproteine (glicosilazione terminale,fosforilazioni, solfatazione, e parzialeproteolisi)•Sintesi di glicosaminoglicani•Smistamento delle proteine produzione didiversi tipi di vescicole (vescicole disecrezione costitutiva, vescicole disecrezione regolata, vescicole lisosomiali,vescicole retrograde verso il RE).

Le due facce dell’apparato di Golgi possiedono enzimi diversi

Legenda: GlcNAc(Nacetilglucosammina),Man (Mannosio), Gal (galattosio), NANAo acido sialico (Nacetilmuramminico)



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Poiché uno o più oligosaccaridi legati ad N sono presenti in tutte le proteinetrasportate attraverso il RE ed il Golgi, via esclusiva delle cellule eucarioti, sisuppone che questa glicosilazione serva per il ripiegamento delle proteine (vedifile RE) e per il trasporto (vedi mannosio 6P per il trasporto della idrolasidall’apparato del Golgi verso il lisosoma). Gli zuccheri, poiché sporgono dallaproteina, limitano l’avvicinamento di altre molecole alla superficie dellaproteina; così una proteina può essere più resistente all’azione di proteasi. E’stato anche ipotizzato che in una cellula eucariote ancestrale gli zuccherifornissero un rivestimento protettivo, che a differenza della parete cellularerigida dei batteri, permetteva alla cellula di cambiare forma e muoversi



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L’apparato di Golgi è un organello costituito da più compartimenti che contengonouna serie ordinata di enzimi che modificano in modo sequenziale le glicoproteine e ilipidi che transitano dalle cisterne cis alle cisterne trans. Le molecole trasportate(carico), quindi, devono passare attraverso ognuno dei compartimenti di cui ècostituito questo organello, ma il meccanismo utilizzato è stato è stato oggetto di unampio dibattito.

Sulla base dei risultati ottenuti utilizzando carichi di diversa grandezza, sono statidefiniti due modelli di trasporto anterogrado attraverso l’apparato di Golgi: lamaturazione delle cisterne e il trasporto mediato da vescicole.

Modello del trasporto vescicolareModello della maturazione delle cisterne

ER

Gruppovescicolaretubulare CGN Cis MedialeTrans TGN

cisterne



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•Il trasporto di grossestrutture proteicheattraverso l’apparato delGolgi, come ad esempiofibrille di collagene,avviene per maturazionedelle cisterne.

•Singole proteine e piccolestrutture proteiche sonotrasferite attraversol’apparato di Golgi permaturazione delle cisterneo per trasporto mediato davescicole attraverso iltrasporto anterogrado.

Modello della maturazionedelle cisterne

Modello del trasporto vescicolare



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Trasporto anterogrado

Trasporto retrogrado

Il trasporto retrogrado (Golgi ---> RE) permette di ricondurre al RE proteinesolubili o transmembrana residenti nel RE. Queste proteine possiedono segnali di“recupero” al RE.



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In maggioranza, le vescicole che dal RE si dirigono verso il Golgi (trasportoanterogrado) sono rivestite di proteine COP II (coatomer II); mentre le vescicole chedal Golgi si dirigono verso il RE (trasporto retrogrado di recupero) sono rivestite diproteine COP I (coatomer I).

Proteine motrici (motore proteico) mediano l’interazione degli di organelli,vescicole o singole moecole con i microtubuli. La localizzazione dell’apparato diGolgi vicino al nucleo dipende dalle proteine motrici e dai microtubili delcitoscheletro; se questi sono depolimerizzati, l’apparato di Golgi perde la suatipica organizzazione e localizzazione e si riorganizza in pile sparse in tutto ilcitoplasma.

+-rivestimento

di COP II

microtubulo

trasporto retrogrado

proteinemotrici

rivestimentodi COP I

Gruppovescicolare

tubulare

ERReticolo Del Golgi Cis



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+-

Proteine motrici che si spostanoverso l’estremità (+) deimicrotubuli, in maggioranzaproteine della famiglia dellekinesine, assicurano il trasportoanterogrado delle vescicole.

Proteine motrici che si spostanoverso l’estremità (-) deimicrotubuli, in maggioranzaproteine della famiglia delledineine, assicurano il trasportoretrogrado.

Vedi filmato:movimento di organelli

vescicole

microtubulo



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La formazione della vescicola iniziadallo scambio del nucleotide legatoalla proteina ARF, da ARF-GDP adARF-GTP, una reazione catalizzatada un enzima della membrana delGolgi. Di seguito ARF-GTP si legaal suo recettore sulla citerna delGolgi, i coatomeri si legano a lorovolta sulla faccia citosolica dellacisterna del Golgi e polimerizzano aformare un riverstimento chefavorisce la formazione dellavescicola. Proteine transmembranache legano i coatomeri sonoincorporate nella vesicola informazione. Tra queste, ci sonole proteine V-SNARE responsabili della specificità di fusione della vescicola con elementi dimembrana del compartimento bersaglio. Proteine solubili contenute nelle vescicole sono selezionatea fare parte di specifiche vescicole grazie all’interazione con specifici recettori di membrana.

Modello di formazione delle vescicole rivestite di coatomero.



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Per permettere la fusione della vescicola conl’elemento di membrana bersaglio ènecessaria la depolimerizzazione delriverstimento di coatomero. Questo avvienegrazie all’idrolisi del GTP legato ad ARF cheprovoca la depolimerizzazione delrivestimento di cotomeri e il rilascio sia deicotomeri che di ARF-GDP.

Il tipo di V-SNARE contenuto in ciascunavescicola determina la specificità diinterazione con elementi di membrana delcompartimento bersaglio. La specificità diriconoscimento avviene tra v-SNARE(della vescicola) e t-SNARE (del bersaglio,“target”)

v-SNARE

Depolimerizzazione delrivestimento

Pi

ARF

coatomero



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v-snare

t-snare

Interazione tra proteine SNAREvescicolari (v-SNARE) e proteineSNARE del compartimento target(t-SNARE)

Materiale disecrezione

vescicola disecrezione

exocitosi

vescicola disecrezioneExocitosi



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Se la fusione della vescicola con la membrana plasmatica non richiedeulteriori segnali regolativi, la secrezione è detta “costitutiva”; negli altri casi,le vescicole sono stoccate nella cellula e la fusione con la membranaplasmatica avviene soltanto in risposta a segnali di communicazione cellulare.



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Oltre alle vescicole di secrezioni sono prodotte dal TGNvescicole precursori dei lisosomi: queste vescicole contengonospecificamente gli enzimi lisosomali e sono rivestite di clatrina



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L’oligosaccaride legato a Ndel precursore dell’idrolasilisosomiale, costruito nel RE,viene modificato nel reticolodel Golgi cis. Il segnale dismistamento degli enzimilisosomali precursori consistenell’aggiunta di un gruppofosfato in corrispondenza delcarbonio in posizione 6 delmannosio nel Golgi Cis.Il mannosio-6-P sarà poiriconosciuto da specificirecettori transmembrana nelTrans Golgi network (TGN)che permetterannol’indirizzamento degli enzimilisosomali in specifichevescicole.

mannosio-6-P

Smistamento degli enzimi lisosomali



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Immunogold con anticorpianti mannosio-6-P



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Il ruolo della clatrina è simile a quello deicoatomeri COP I e COP IIL’associazione delle molecole di clatrinacatalizzata dalla presenza di molecole ARF-GTP deforma la membrana del TGN efavorisce la formazione della vescicola. Unavolta formata la vescicola ricoperta diclatrina, l’idrolisi del GTP permette il rilasciodi ARF-GDP e della clatrina lasciando lavescicola “nuda”



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Continuità dei compartimenti intracellulari con lo spazio extracellulare



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