Immunologia e Immunopatologia

MATURAZIONE DEI LINFOCITI T

Il percorso di maturazione dei linfociti

Sviluppo della specificità immunologica

•  I linfociti B e T avviano le risposte immunitarie dopo il riconoscimento specifico dell’antigene.

•  I linfociti B e T riconoscono l’antigene attraverso il proprio recettore di membrana:

- Recettore dei linfociti B è BCR

- Recettore dei linfociti T è TCR

Repertorio linfocitario = Insieme di tutti i recettori per l’antigene espressi da un individuo = Numero di antigeni riconoscibili da un individuo.

Recettori dei linfociti T

Recettori T: proprietà generali

•  Proteine di membrana espresse da tutte le classi di linfociti T. •  Molecole specializzate per riconoscere un peptide antigenico.

•  Il riconoscimento dell’antigene avviene esclusivamente se caricato su molecole MHC.

•  Il TCR ha bisogno di riconoscere contemporaneamente antigene e MHC.

Struttura del TCR •  Tutti i TCR hanno la stessa struttura molecolare, ma

grande variabilità nella regione che lega l’antigene

•  Struttura simmetrica: - 1 catena polipeptidica α - 1 catena polipeptidica β

•  Circa il 10% dei linfociti T

esprime un TCR costituito da: - 1 catena polipeptidica γ - 1 catena polipeptidica δ

Struttura del TCR

•  Le catene α e β sono costituite da 2 domini proteici ripetuti: il dominio immunoglobulinico (Ig).

•  Le catene α e β sono caratterizzate da 3 regioni distinte:

- 1 regione variabile (legame antigene) - 1 regione costante - 1 regione transmembrana

Caratteristiche delle regioni variabili

•  La variabilità nelle sequenze aminoacidiche dei TCR si concentra nelle regioni ipervariabili e determina la specificità dei singoli recettori.

•  Regioni ipervariabili (∼10 aa):

- 3 segmenti della regione Vα

- 3 segmenti della regione Vβ

•  Regioni ipervariabili = Regioni che determinano la

complementarità (CDR): - CDR1, CDR2 e CDR3 (catena α) - CDR1, CDR2 e CDR3 (catena β)

Il sito di legame per l’antigene •  È formato dalla disposizione tridimensionale delle regioni

variabili della catena α e della catena β.

•  Ogni molecola TCR possiede 1 sito di legame che riconosce il complesso peptide-MHC.

Il complesso del TCR •  Il complesso recettoriale dei linfociti T è formato da diverse

catene polipeptidiche: -  TCR è Legame antigene-MHC -  Proteine CD3 è Trasduzione del segnale intracellulare -  Proteine ζ (zeta) è Trasduzione del segnale intracellulare

•  Nelle proteine del complesso sono presenti le Sequenze ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-Based Activating Motifs):

- Contengono residui di tirosina - Sono il bersaglio di tirosin-chinasi - Quando fosforilate avviano la cascata enzimatica intracellulare

Il complesso del TCR

Recettori B e T: Omologie

•  Funzioni: riconoscimento dello stimolo (antigene) e attivazione della risposta cellulare (trasduzione). •  Distribuzione clonale: 1 clone = 1 recettore = 1 antigene •  Sito di legame per l’antigene : Regioni Variabili (CDR) -  BCR è regioni V delle catene H e L -  TCR è regioni V delle catene α e β

Recettori B e T: Differenze •  Antigene Bersaglio BCR: -  Macromolecole in forma nativa (proteine, lipidi, carboidrati, DNA, RNA) -  Macromolecole in forma lineare (peptidi e parti di macromolecole) -  Piccole molecole chimiche

•  Antigene Bersaglio TCR: - Piccoli peptidi

•  Riconoscimento Antigene: -  BCR è Diretto -  TCR è Mediato da MHC (CD4/CD8)

Recettori B e T: Differenze

Recettori T: Risposte Cellulari

•  Linfociti immaturi, naïve e di memoria:

-  Proliferazione -  Sopravvivenza -  Apoptosi -  Differenziamento

Maturazione dei linfociti T

Le linee differenziative dei linfociti

HSC è Cellula Staminale Ematopoietica CLP è Progenitore Linfoide Comune •  Le cellule staminali ematopoietiche

danno origine a tutti i linfociti: - HSC del fegato fetale è Linfociti T γδ - HSC del midollo osseo è Linfociti T αβ

•  A partire dal progenitore linfoide comune, il differenziamento è determinato dall’attivazione di fattori trascrizionali diversi: - Notch-1 e GATA-3 è Cellula Pro-T

Ruolo del timo nella maturazione T

•  Tutte le fasi di maturazione dei timociti si svolgono nel timo:

Ø  Dopo la nascita il timo regredisce con l’età e diventa quasi assente dopo la pubertà. Ø  Nell’adulto, il residuo di timo involuto permette una maturazione limitata. Ø  L’accumulo di linfociti T di memoria riduce nel tempo la necessità di nuovi linfociti T.

Ø  Sindrome di DiGeorge = Assenza congenita del timo -  Linfociti T maturi assenti

-  Deficit dell’immunità cellulo-mediata

Timo: Corticale e Midollare

• Tutti gli stimoli che permettono proliferazione e maturazione dei

timociti provengono dalle cellule timiche: Corticale è Cellule timiche epiteliali Giunzione Corticomidollare è Cellule dendritiche midollari Midollare è a) Cellule epiteliali timiche midollari b) Cellule dendritiche midollari c) Macrofagi

• Molecole critiche presenti nell’ambiente timico: Cellule epiteliali e dendritiche è MHC I e II (selezione) Cellule stromali timiche è a) IL-7 (proliferazione) b) CCL25 (chemotassi CCR9) c) CCL21 (chemotassi CCR7)

Il processo di maturazione linfocitaria

Maturazione dei linfociti = Diversificazione della specificità

Lo sviluppo del repertorio linfocitario prevede 3 processi: -  Proliferazione dei linfociti immaturi -  Espressione dei geni per il recettore dell’antigene -  Selezione dei linfociti con recettore utile

Linfociti maturi

Linfociti immaturi con recettore completo

Linfociti immaturi con pre-recettore

Fase 1: Proliferazione

•  I linfociti immaturi proliferano intensamente in due stadi del processo di maturazione: - Prima di esprimere il pre-recettore (stadio pre-B/T) -  Prima di esprimere il recettore completo (stadio immaturo) •  La produzione del recettore in ogni singolo linfocita è un evento genetico casuale è alta probabilità di insuccesso.

•  La grande proliferazione permette di ottenere un adeguato numero di “candidati” da selezionare in base al singolo recettore.

Ruolo dell’interleuchina 7 nella proliferazione

•  IL-7 regola la proliferazione dei linfociti B e T murini. Ø  Mutazioni nei geni IL-7 e recettore IL-7R determinano un deficit nella maturazione B e T. •  IL-7 regola la proliferazione dei linfociti T umani. Ø  Mutazione della catena γ del recettore IL-7 è la causa dell’immunodeficienza grave legata al cromosoma X (X-SCID):

Blocco dello sviluppo di cellule T e cellule NK.

Fase 2: Diversificazione

La diversità dei recettori per l’antigene si genera

attraverso la ricombinazione genetica.

•  I geni che codificano per le catene del recettore contengono molti segmenti per le regioni variabili e pochi segmenti costanti: -  Segmenti V (30-100) -  Segmenti D (0-30) -  Segmenti J (4-60) -  Segmenti C

•  Durante la maturazione di ogni singolo linfocita avviene la ricombinazione casuale dei segmenti che crea la sequenza finale codificante il recettore.

Loci genici per il TCR

•  I geni che codificano per le catene del TCR sono organizzati in 3 loci diversi su 2 cromosomi distinti: - Catena α è Cromosoma 14 - Catena β è Cromosoma 7 - Catena γ è Cromosoma 7 - Catena δ è Cromosoma 14 (interno al locus α)

• Le regioni variabili sono codificate dai diversi tipi di esoni: - Catena β e δ è Esoni V+D+J - Catena α e γ è Esoni V+J

Ricombinazione dei geni TCR

La diversificazione del repertorio dei recettori deriva dalla somma di 2 meccanismi genetici: 1. Ricombinazione dei segmenti V (D) J 2. Diversità delle giunzioni create tra i segmenti ricombinati

Ricombinazione dei geni TCR

Numeri: Catena α è 54 segmenti V, 61 segmenti J. Catena β è 67 segmenti V, 2 segmenti D, 4 segmenti J. Risultato potenziale: ∼ 1016 recettori diversi Risultato reale: ∼ 107 recettori diversi

Fase 3: Selezione

•  I linfociti immaturi vengono selezionati in base al proprio recettore:

Ø  Assenza del pre-recettore = Apoptosi Ø  Assenza del recettore completo = Apoptosi Ø  Forte legame antigeni self = Selezione negativa = Apoptosi Ø  Mancato legame MHC = Apoptosi (Mancata selezione positiva)

Ø  Debole riconoscimento antigeni self = Selezione positiva = Maturazione

Selezione positiva dei linfociti T

Selezione negativa dei linfociti T

Stadi della maturazione delle cellule T

•  La maturazione T passa attraverso 4 tipi di linfociti (timociti): -  Cellule Pro-T (CD4- CD8-) -  Cellule Pre-T (espressione pre-TCR) -  Cellule T immature (espressione TCR; CD4+ CD8+) -  Cellule T mature (CD4+ oppure CD8+)

Linfociti pro-T

•  Localizzazione nel timo è Corticale

•  Espressione TCR è Nessuna

•  Espresione CD3 e ζ è Nessuna

•  Espressione CD4 e CD8 è Nessuna

•  Processi in corso: - Primo ciclo proliferativo (Staminale è Pro-T) - Primo riarrangiamento: Catena β TCR (Pro-T è Pre-T)

Linfociti pre-T

•  Localizzazione nel timo è Corticale

•  Espressione TCR è pre-TCR = Catena β + pre-Tα

•  Espressione CD3 e ζ è Presente

•  Espressione CD4 e CD8 è Nessuna

•  Processi in corso: - Controllo pre-TCR è Apoptosi (Pro-T è Pre-T) - Secondo ciclo proliferativo (Pre-T è Doppio positivi) - Inizio secondo riarrangiamento: Catena α TCR - Esclusione allelica della catena β

Linfociti doppio-positivi

•  Localizzazione nel timo è Corticale

•  Espressione TCR è TCR completo αβ

•  Espresione CD3 e ζ è Presente

•  Espressione CD4 e CD8 è CD4+CD8+

•  Processi in corso: - Fine secondo riarrangiamento: Catena α TCR - Delezione del locus catena δ (giunzione V-J catena α) - Controllo TCR completo è Apoptosi (Pre-T è CD4+CD8+) - Selezione positiva e negativa

Linfociti T immaturi (singolo-positivi)

•  Localizzazione nel timo è Midollare

•  Espressione TCR è TCR completo αβ

•  Espresione CD3 e ζ è Presente

•  Espressione CD4 e CD8 è CD4+ oppure CD8+

•  Processi in corso: - Selezione negativa è Apoptosi

Tolleranza centrale

Selezione timica negativa = Tolleranza al self

1.  Eliminazione dei linfociti T autoreattivi per: - Antigeni self timici. - Antigeni self ubiquitari. - Alcuni antigeni self tessuto specifici (tiroide, pancreas, surrenali)

espressi nelle epiteliali midollari dal fattore trascrizionale AIRE.

2. Generazione dei linfociti T regolatori: - Alcuni linfociti T CD4+ autoreattivi differenziano in cellule Treg e

controllano le reazioni autoimmuni.

Al termine della selezione timica i linfociti T maturi andranno in circolo:

Linfociti T CD4+ è Attivazione via MHCII è Linfociti T helper

Linfociti T CD8+ è Attivazione via MHCI è Linfociti T citotossici

Linfociti T γδ è Niente attivazione MHC è Linfociti intraepiteliali