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Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica Tesi di Laurea di: Serena Diana Ghezzi Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Silvia DE BIASI Correlatore: Chiar.mo Prof. Giacomo P. COMI Internato di tesi svolto presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche, Universit degli Studi di Milano Fondazione IRCCS CA GRANDA Ospedale Maggiore Policlinico

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tipo di SLAgeneclasse geni mendeliani SLA1SOD1enzima detossificante SLA2ALS2signali GEF SLA4SETXmetabolismo del DNA e dell RNA SLA5SPG11recettore o trasportatore di membrana SLA6FUSlegame al RNA, silenziamento e riparo del DNA SLA8VAPBtraffico vesciculare SLA9ANGneovascolarizzazione SLA10TARDBPlegame allRNA ed exon skipping SLADCTN1trasporto assonale SLA- FTDP MAPTassemblamento dei microtubuli e loro stabilit loci mendeliani SLA3IgnotoIgnota SLA7IgnotoIgnota SLA-XIgnotoIgnota SLA-FTD1IgnotoIgnota SLA-FTD2IgnotoIgnota Sclerosi Laterale Amiotrofica INTRODUZIONE La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) una patologia neurodegenerativa fatale, risultato del preminente interessamento dei motoneuroni superiori e inferiori. La durata di malattia dal momento dellesordio dei sintomi in media di 3-5 anni con un decorso pi rapido nelle forme ad esordio bulbare. La diagnosi essenzialmente clinica, non esiste infatti un test diagnostico specifico. 5-10% familiari (SLAf) 90-95% sporadici (SLAs) Dati familiari ed epidemiologici indicano che i fattori genetici contribuiscono alla sua patogenesi. Lexitus avviene generalmente in seguito a paralisi della muscolatura respiratoria

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INTRODUZIONETARDBP La proteina TAR DNA binding protein (TDP43) il principale componente delle inclusioni citoplasmatiche neuronali ubiquitino-positive presenti nella maggior parte dei casi SLAs e di SLAf negativi per mutazioni di SOD1 Nel tessuto nervoso dei pazienti SLA, TDP43 iperfosforilata, ubiquitinata e clivata in modo anomalo. Si ipotizza che in condizioni patologiche la proteina sia eliminata dal nucleo e si accumuli a livello del citoplasma innescando la degenerazione motoneuronale

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1p36 1.regolazione della trascrizione 2.regolazione dello splicing 3.stabilit dellmRNA INTRODUZIONE TARDBP (TDP43) ex1ex2ex3ex4ex5ex6 RRM1RRM2GRR NLS 414 aa, 43 KDa sito di interazione hnRNP siti di interazione con lmRNA segnale di localizzazione nucleare Sito di clivaggio (aa86-89)Sito di clivaggio (aa216-219)

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caratterizzare geneticamente Lo scopo del nostro studio stato quello di caratterizzare geneticamente lampia coorte di pazienti SLA afferenti allAmbulatorio Malattie del Motoneurone Dipartimento di Scienze Neurologiche Policlinico di Milano. SCOPOOBIETTIVI modello cellulare Tale studio ci ha permesso di individuare la mutazione A382T risultata essere la variante pi comune sul territorio nazionale. Abbiamo quindi costruito un modello cellulare che permettesse di studiare in vitro gli effetti di tale mutazione.

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SCREENING GENETICO La frequenza mutazionale risultata pertanto essere del 2.3% calcolata sullintera coorte di pazienti (1.6% nelle forme sporadiche e 7.7% in quelle familiari). Pazienti SLASoggetti SANI numero di soggetti213181 casi familiari26 genere (M/F)122/91102/79 et di insorgenza (anni)58.3 12.8 et al prelievo (anni)60.8 12.567.4 8.8 insorgenza bulbare21.4% durata della malattia (mesi)31.6 29.4 SOD1, VAPB e ANG positivinessuno 4 mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3 sporadici) RISULTATI

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I:1 I:2 II:1II:2II:3II:4II:5II:6II:7II:8 III:1III:2III:3III:4III:5III:6III:7III:8III:9 IV:1 IV:2IV:3 p.Ala382Thr RISULTATI SLAf SLAs G294VG295S G348CA382T c.881G>T p.Gly294Valc.883G>A p.Gly295Ser c.1144G>A p.Ala382Thr I:1I:2 II:1 II:2II:3II:4 III:1III:2III:3III:4III:5III:6III:7III:8 IV:1IV:2IV:3IV:4IV:5IV:6IV:7IV:8IV:9IV:10 V:1V:2V:3V:4V:5V:6V:7V:8V:9 VI:1 VI:2VI:3 VI:4 VI:5VI:6VI:7VI:8 p.Gly348Cys SCREENING GENETICO

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c.881G>T p.Gly294Valc.883G>A p.Gly295Ser SCREENING GENETICO p.Ala382Thrp.Gly348Cys ex1ex2ex3ex4ex5ex6 RRM1RRM2GRR NLS c.1144G>A p.Ala382Thr RISULTATI

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c.1144G>A p.Ala382Thr Costruzione del modello cellulare ficol mRNA cDNA AB AB 820bp 965bp 820bp 521bpNdeI RISULTATI

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Validazione del modello cellulare hHEK hSK-N-SH mES actina hHEKhSK-N-SHmES 45 KDa NTWTA382T NTWTA382T NTWTA382T Western-Blot TDP43DAPIMERGE NT WT A382T Immunocitochimica RISULTATI

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Validazione del modello cellulare GAPDH TDP43 RISULTATI

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Costruzione del modello con GFP hHEK DAPITDP43MERGE wt A382T TDP43 WT GFP TDP43 A382T GFP RISULTATI

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CONCLUSIONI SOD1 E interessante notare come, per quanto riguarda le forme di SLA a trasmissione autosomica dominante, la rilevanza mutazionale di TARDBP sia paragonabile, se non superiore, a quella di SOD1, nel nostro come in altri studi. frequenza mutazionale La frequenza mutazionale del gene TARDPB nella nostra coorte di paziente risultata pari al: 1.6% nei casi sporadici (sovrapponibile a quanto riportato in letteratura) 7.7% nei casi familiari (maggiore di quanto descritto, circa il 5%). quadro clinico Il quadro clinico della SLA10 analogo a quello della malattia classica, con qualche variabilit interfamiliare per quanto riguarda et e sito di esordio GENETICA DISCUSSIONE Pazientegenerepaese dorigine ereditarietTDP43insorgenzadurata (mesi) etsede A, V:3MBelgioADG348C50spinale36 a A, V:1MBelgioADG348C53spinale- A, III:3FBelgioADb67spinale36-48 A, III:4MBelgioADb39spinale36 A, III:5MBelgioADb36spinale- a A, III:6FBelgioADb54spinale36 A, IV:1MBelgioADb66spinale48 A, IV:3MBelgioADb58spinale48 A, IV:6FBelgioADb53spinale60 B, III:2MItaliaADA382T50spinale con crampi agli arti inferiori60 a B, II:5MItaliaADb50spinale con debolezza allarto superiore sinistro 36 CMItaliasporadicaA382T54spinale con paresi alla mano sinistra- DFItaliasporadicaG294V73spinale con debolezza progressiva agli arti inferiori 36 EMItaliasporadicaG295S64spinale con debolezza e atrofia agli arti superiori 36 a

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CONCLUSIONI due modelli cellulari Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata. ANALISI FUNZIONALE DISCUSSIONE actina hHEK 45 KDa NTWTA382T hSK-N-SH 45 KDa NTWTA382T mES 45 KDa NTWTA382T

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CONCLUSIONI due modelli cellulari Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata. ANALISI FUNZIONALE DISCUSSIONE mRNA non tradottoproteina degradata 231231 231 45 KDa HEK non trasfettateHEK TDP43 WT HEK TDP43 A382T

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PROSPETTIVE 1.Proseguire la caratterizzazione genetica 2.Approfondire lo studio dei meccanismi di degradazione proteica 3.Verificare leventuale regolazione dei livelli di trascritto 4.Confermare i dati fin qui ottenuti anche con i modelli esprimenti la proteina legata alla GFP 5.Replicare gli esperimenti validati nelle HEK anche in un modello neuronale (es. SK-N-SH) 6.Valutare i meccanismi di neurogenesi nei modelli cellulari fin qui descritti DISCUSSIONE

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RINGRAZIAMENTI