Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica Tesi di
Laurea di: Serena Diana Ghezzi Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Silvia
DE BIASI Correlatore: Chiar.mo Prof. Giacomo P. COMI Internato di
tesi svolto presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche,
Universit degli Studi di Milano Fondazione IRCCS CA GRANDA Ospedale
Maggiore Policlinico
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tipo di SLAgeneclasse geni mendeliani SLA1SOD1enzima
detossificante SLA2ALS2signali GEF SLA4SETXmetabolismo del DNA e
dell RNA SLA5SPG11recettore o trasportatore di membrana
SLA6FUSlegame al RNA, silenziamento e riparo del DNA
SLA8VAPBtraffico vesciculare SLA9ANGneovascolarizzazione
SLA10TARDBPlegame allRNA ed exon skipping SLADCTN1trasporto
assonale SLA- FTDP MAPTassemblamento dei microtubuli e loro
stabilit loci mendeliani SLA3IgnotoIgnota SLA7IgnotoIgnota
SLA-XIgnotoIgnota SLA-FTD1IgnotoIgnota SLA-FTD2IgnotoIgnota
Sclerosi Laterale Amiotrofica INTRODUZIONE La Sclerosi Laterale
Amiotrofica (SLA) una patologia neurodegenerativa fatale, risultato
del preminente interessamento dei motoneuroni superiori e
inferiori. La durata di malattia dal momento dellesordio dei
sintomi in media di 3-5 anni con un decorso pi rapido nelle forme
ad esordio bulbare. La diagnosi essenzialmente clinica, non esiste
infatti un test diagnostico specifico. 5-10% familiari (SLAf)
90-95% sporadici (SLAs) Dati familiari ed epidemiologici indicano
che i fattori genetici contribuiscono alla sua patogenesi. Lexitus
avviene generalmente in seguito a paralisi della muscolatura
respiratoria
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INTRODUZIONETARDBP La proteina TAR DNA binding protein (TDP43)
il principale componente delle inclusioni citoplasmatiche neuronali
ubiquitino-positive presenti nella maggior parte dei casi SLAs e di
SLAf negativi per mutazioni di SOD1 Nel tessuto nervoso dei
pazienti SLA, TDP43 iperfosforilata, ubiquitinata e clivata in modo
anomalo. Si ipotizza che in condizioni patologiche la proteina sia
eliminata dal nucleo e si accumuli a livello del citoplasma
innescando la degenerazione motoneuronale
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1p36 1.regolazione della trascrizione 2.regolazione dello
splicing 3.stabilit dellmRNA INTRODUZIONE TARDBP (TDP43)
ex1ex2ex3ex4ex5ex6 RRM1RRM2GRR NLS 414 aa, 43 KDa sito di
interazione hnRNP siti di interazione con lmRNA segnale di
localizzazione nucleare Sito di clivaggio (aa86-89)Sito di
clivaggio (aa216-219)
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caratterizzare geneticamente Lo scopo del nostro studio stato
quello di caratterizzare geneticamente lampia coorte di pazienti
SLA afferenti allAmbulatorio Malattie del Motoneurone Dipartimento
di Scienze Neurologiche Policlinico di Milano. SCOPOOBIETTIVI
modello cellulare Tale studio ci ha permesso di individuare la
mutazione A382T risultata essere la variante pi comune sul
territorio nazionale. Abbiamo quindi costruito un modello cellulare
che permettesse di studiare in vitro gli effetti di tale
mutazione.
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SCREENING GENETICO La frequenza mutazionale risultata pertanto
essere del 2.3% calcolata sullintera coorte di pazienti (1.6% nelle
forme sporadiche e 7.7% in quelle familiari). Pazienti SLASoggetti
SANI numero di soggetti213181 casi familiari26 genere
(M/F)122/91102/79 et di insorgenza (anni)58.3 12.8 et al prelievo
(anni)60.8 12.567.4 8.8 insorgenza bulbare21.4% durata della
malattia (mesi)31.6 29.4 SOD1, VAPB e ANG positivinessuno 4
mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3 sporadici)
RISULTATI
c.1144G>A p.Ala382Thr Costruzione del modello cellulare
ficol mRNA cDNA AB AB 820bp 965bp 820bp 521bpNdeI RISULTATI
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Validazione del modello cellulare hHEK hSK-N-SH mES actina
hHEKhSK-N-SHmES 45 KDa NTWTA382T NTWTA382T NTWTA382T Western-Blot
TDP43DAPIMERGE NT WT A382T Immunocitochimica RISULTATI
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Validazione del modello cellulare GAPDH TDP43 RISULTATI
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Costruzione del modello con GFP hHEK DAPITDP43MERGE wt A382T
TDP43 WT GFP TDP43 A382T GFP RISULTATI
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CONCLUSIONI SOD1 E interessante notare come, per quanto
riguarda le forme di SLA a trasmissione autosomica dominante, la
rilevanza mutazionale di TARDBP sia paragonabile, se non superiore,
a quella di SOD1, nel nostro come in altri studi. frequenza
mutazionale La frequenza mutazionale del gene TARDPB nella nostra
coorte di paziente risultata pari al: 1.6% nei casi sporadici
(sovrapponibile a quanto riportato in letteratura) 7.7% nei casi
familiari (maggiore di quanto descritto, circa il 5%). quadro
clinico Il quadro clinico della SLA10 analogo a quello della
malattia classica, con qualche variabilit interfamiliare per quanto
riguarda et e sito di esordio GENETICA DISCUSSIONE
Pazientegenerepaese dorigine ereditarietTDP43insorgenzadurata
(mesi) etsede A, V:3MBelgioADG348C50spinale36 a A,
V:1MBelgioADG348C53spinale- A, III:3FBelgioADb67spinale36-48 A,
III:4MBelgioADb39spinale36 A, III:5MBelgioADb36spinale- a A,
III:6FBelgioADb54spinale36 A, IV:1MBelgioADb66spinale48 A,
IV:3MBelgioADb58spinale48 A, IV:6FBelgioADb53spinale60 B,
III:2MItaliaADA382T50spinale con crampi agli arti inferiori60 a B,
II:5MItaliaADb50spinale con debolezza allarto superiore sinistro 36
CMItaliasporadicaA382T54spinale con paresi alla mano sinistra-
DFItaliasporadicaG294V73spinale con debolezza progressiva agli arti
inferiori 36 EMItaliasporadicaG295S64spinale con debolezza e
atrofia agli arti superiori 36 a
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CONCLUSIONI due modelli cellulari Per poter studiare gli
effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due
modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type
che quella mutata. ANALISI FUNZIONALE DISCUSSIONE actina hHEK 45
KDa NTWTA382T hSK-N-SH 45 KDa NTWTA382T mES 45 KDa NTWTA382T
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CONCLUSIONI due modelli cellulari Per poter studiare gli
effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due
modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type
che quella mutata. ANALISI FUNZIONALE DISCUSSIONE mRNA non
tradottoproteina degradata 231231 231 45 KDa HEK non trasfettateHEK
TDP43 WT HEK TDP43 A382T
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PROSPETTIVE 1.Proseguire la caratterizzazione genetica
2.Approfondire lo studio dei meccanismi di degradazione proteica
3.Verificare leventuale regolazione dei livelli di trascritto
4.Confermare i dati fin qui ottenuti anche con i modelli esprimenti
la proteina legata alla GFP 5.Replicare gli esperimenti validati
nelle HEK anche in un modello neuronale (es. SK-N-SH) 6.Valutare i
meccanismi di neurogenesi nei modelli cellulari fin qui descritti
DISCUSSIONE