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Ruolo della risposta al danno al DNA nella carcinogenesie nello sviluppo di terapie tumorali

Dr.ssa Daniela Barilà

Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno

Difetti nella risposta al danno del DNAed instabilità genomica

Patologie genomiche associate ad instabilità genomica:alcuni esempi

Ruolo della disposta al danno del DNA nello sviluppo didi terapie tumorali

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Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno

Danno al DNA di origine endogena: processi metabolicireplicazione del DNAriarrangiamenti DNA nel sistema immunitario (VDJrecombination, class switch)

Danno al DNA di origine esogena: radiazioni ionizzanti (IR)radiazioni ultravioletto (UV)diversi agenti chimici

Scopo principale della risposta di danno al DNA:prevenire la replicazione del DNA in presenza di un danno del DNA e la conseguente instabilità genomica

1) Attivazione dei checkpoint cellulari per arrestare il ciclo cellulare

2) Attivazione dei meccanismi di riparo del DNA

3) Riparo del danno e ripresa del ciclo cellulare… oppure…il dannonon è riparabile e si attiva la risposta apoptotica

Riparo del DNAApoptosi

Dannoal DNA

Arresto del ciclo cellulare

Sopravvivenza

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From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev

Diversi tipi di danno al DNA e diversi meccanismi di riparo

From R. Hakem, 2008, EMBO J

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Direct reversal: a differenza delle altre risposte non richiede L’attivazione di complessi multiproteici. Un esempio: O6-alkylguanina.L’alchilazione impedisce l’appaiamento con la citosina. Viene rimossagrazie all’azione di un singolo enzima, Ada in E. coli corrispondente aO6-methyltransferase, MGMT in cellule di mammifero.

MMR pathway: Mismatch Rapair, presente in eucarioti e procariotiviene utilizzata per il riparo di mismatches, ossia piccole inserzionio delezioni.

NER pathway: Nucleotide Excision Repair,presente in eucarioti eprocarioti viene utilizzata per il riparo di diverse lesioni tra cuilesioni causate da UV, mutageni chimici e chemioterapici che inducanola formazione di dimeri di pirimidina e addotti sproporzionati.3 proteine (UvrA, UvrB, UvrC) in procarioti, piu’ di 30 in mammifero.

BER pathway: Base Excision Repair, viene utilizzata in procariotied eucarioti per rimuovere basi danneggiate.

HR pathway: Homologous Recombination, viene utilizzata in procariotied eucarioti per risolvere rotture a doppio filamento (DSB). Viene utilizzata in circa il 90% dei casi di DSBs nei batteri edin lievito, e solo nel 10% dei casi di DSBs in cellule di mammifero,in cui si preferisce l’attivazione della NHEJ. Richiede l’attivazione di una serie di complessi proteici e di una cascata di eventi di trasduzione del segnale. E’ molto accurata.

NHEJ: Non Homologous End Joining, viene utilizzata in procariotied eucarioti per risolvere rotture a doppio filamento (DSB). Viene utilizzata solo in circa il 10% dei casi di DSBs nei batteri edin lievito, e nel 90% dei casi di DSBs in cellule di mammifero.Richeiede l’attivazione di una serie di complessi proteici e di unacascata di eventi di trasduzione del segnale. Non e’ molto accuratabensi error prone.

Danno al DNA su entrambi i filamenti:Double Strand Breaks (DSBs)

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From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev

Double Strand Breaks (DSBs): NHEJ or HR and cell cycle

From S. Takeda et al., 2007, Mol Cell

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La risposta cellulare attivata da DSBs è molto bencaratterizzata a livello molecolare

Una cascata di eventi coordinata da:1) Sensori del danno

2) Trasduttori 3) Effettori

Tale risposta deve essere rapida ereversibile: modifiche post-traduzionaliquali fosforilazioni ed ubiquitinazioni

svolgono un ruolo centralenella trasduzione del segnale di risposta.

From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev

From Su, T.T, 2006, Annu Rev Genet

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La risposta cellulare attivata da DSBs è molto bencaratterizzata a livello molecolare

In seguito al DSBs il complesso MRN (MRE11/RAD50/NBS1) vienereclutato ai siti di rottura del DNA dove media a sua volta il reclutamentoe l’attivazione della Ser/Thr chinasi ATM. Inoltre altre due Ser/Thr chinasi,ATR e DNA-PK sono attivate e partecipano attivamente alla risposta DSBs.

In pochi minuti dalla formazione di DSBs ATM, ATR e DNA-PK si attivanoe fosforilano a loro volta altri trasduttori ed effettori necessari sia ad attivare il riparo del DNA che ad attivare i checkpoints cellulari

Il complesso MRN promuove anche grazie all’attività esonucleasica di MRE11la resezione che porta alla formazione di DNA a singolo filamento,il quale a sua volta promuove l’attivazione di ATR.

Il complesso MRN (MRE11/RAD50/NBS1)

MRE11: è una proteina che lega il DNA e possiede attività esonucleasica3’-5’ oltre ad attività endonucleasica.Promuove quindi la resezione e la formazione di ssDNA necessariaper la ricombinazione omologa. Promuove inoltre l’attivazione di ATR.

RAD50: è un membro della famiglia SMC (Structural Maintenanceof Chromosomes) e forma omodimeri che si associano con due molecoledi MRE11 per formare complessi tetramerici MRE11-RAD50 che possono inserirsi tra le estremità libere del DNA oppure tra i cromatidi fratellipromuoveno la ricombinazione omologa.

NBS1 : presenta un dominio di legame con ATM ed è quindi necessaria perIl reclutamento di ATM ai siti di rottura del DNA e per la sua attivazione.

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Il complesso MRN

Le PI3-like Ser/Thr chinasi svolgono un ruolo centralecome trasduttori della risposta di danno al DNA

ATM

ATR

ATX/SMG1

DNA-PK

mTOR/FRAP

TRRAP

1

1

1

1

1

1

3056

2644

3031

4128

2549

3830

FAT FATCPI3-K

Tali proteine sono altamente conservate nell’evoluzione.

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ATM

ATR

ATX/SMG1

DNA-PK

mTOR/FRAP

TRRAP

1

1

1

1

1

1

3056

2644

3031

4128

2549

3830

FAT FATCPI3-K

Ruolo centrale nella risposta DSBs.L’attività chinasica è finemente regolata da un complessodi interazioni intra ed intermolecolare.Induzione dell’ attività chinasica in risposta a DSBs ed attivazionedi una cascata di fosforilazioni con conseguente amplificazione del segnale.

From Bakkenist and Kastan, 2003, Nature

ATM è presente nella cellula come dimero inattivo.In seguito a danno del DNA ATM subisce un cambio conformazionaleche ne induce l’attività chinasica e l’autofosforilazione in Ser1981che determina il rilascio dal dimero di due molecole di monomeroautofosforilate ed attive in grado di mediare la fosforilazione di substratisia in prossimità dei DSBs che piu’ genericamente nel nucleo.

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Ruolo di ATM nel riparo del DNA

ATM colocalizza ed induce la fosforilazione dell’istone H2AXin Ser139 ai siti di rottura del DNA.

Tale evento promuove la formazione degli IRIF (Ionizing RadiationInduced Foci).

Agli IRIF vengono reclutati e fosforilati diversi fattori tra cui: MDC1,53BP1, RNF8, BRCA1, CHK2 e p53. Inoltre RAD51 e RAD52 direttamentecoivolte nel riparo vengono fosforilate.

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Formazione dei foci in seguito ad IR

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Ruolo di ATM nel controllo del ciclo cellulare

From Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev

From Rotman and Shiloh, 1999, Oncogene

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Sono patologie genetiche autosomiche recessive associate a mutazioni acarico di geni codificanti per proteine importanti nella risposta al dannodel DNA.Tali patologie sono generalmente associate ad instabilità cromosomica,aberrazioni del sistema nervoso ed immunitario ed ipersensibilità dellecellule agli agenti che inducono il tipo di danno la cui risposta è nonfunzionante.Inoltre spesso tali patologie sono anche associate ad una maggiorefrequenza di sviluppo tumorale, spesso ma non solo di tumori del sistemaimmunitario.

Patologie genomiche associate ad instabilità genomica:alcuni esempi

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Xeroderma Pigmentosum (XP): e’ una sindrome generata da mutazioniIn uno o più geni XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG.E’ caratterizza da ipersensibilita’ agi UV e da altissima incidenza ditumori della pelle.

Cockayne syndrome: e’ una sindrome associata a mutazioniin CSA o CSB, proteine richieste per NER.E’ una patologia Caratterizzata da malformazioni e ritardo mentale grave. Si osserva in alcuni casiun’alta incidenza di tumori della pelle comeper XP.

Tricothiodystrophy: TTD. e’ una sindrome associata a mutazioninelle proteine XPB e/o XPD. Ritardo mentale e fotosensibilita’.Non si osservano correlazioni con lo sviluppo di tumori della pelle.

3 sindromi associate a difetti nella risposta NER

Bloom’s syndrome (BS): e’ una sindrome rara causata da mutazioni della proteina BML una DNA elicasi importante nella risposta HR a DSBs. Maggiore possibilita’ di sviluppare vari tumori.

Werner’s syndrome (WS):WS e’ un’ altra RECQ elicasi. Le mutazionidi WS sono associate ad una patologia in cui si riscontramaggiore propensione allo sviluppo di tumori

Rothmund-Thompson syndrome (RTS): RTS e’ generata damutazioni di un’altra RECQ elicasi. Anche questa patologia si associaad un aumentato rischio di sviluppare tumori della pelle edosteosarcomi.

Fanconi’s anemia (FA): E’ una patologia molto eterogeneaCaratterizzata da anemia aplastica.Ci sono almeno 8 diversi “FA genes”.

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Ataxia Telangiectasia (A-T): rara patologia genetica, causata da mutazioni del gene atm. E’ caratterizzata da neurodegenerazione,Telangiectasia, immunodeficienza e da un’alta incidenzadi linfomi e leucemie.

Nijmegen Breakage Syndrome (NBS):mutazioni a carico dellaproteina NBS1 che impediscono il corretto funzionamento.PatologiaCaratterizzata da neurodegenerazione e da alta incidenza diB/T linfomi.

Ataxia Telangiectasia Like Disease (ATLD): Mutazioni a carico diMRE11. Alta incidenza di tumori.

Diverse sindromi da instabilità genomica sono correlate tra loroIn quanto le proteine codificate dai geni mutati sono funzionalmentecorrelate e partecipano alle stesse vie di trasduzione del segnale

A-T and NBS: ATM viene attivato e a sua volta fosforila NBS1

A-T and Fanconi Anemia: ATM fosforila FANCD2

A-T and Bloom’s Syndrome: ATM fosforila BLM

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From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev

From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev

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Inoltre molte mutazioni di geni della risposta a DSBs sono associateAd alta incidenza di tumori anche in eterozigosi, quando cioe’ nonsi sviluppa la patologia genetica.

Attivazione della risposta DSBs nelle lesioni pretumorali:Possibile ruolo di barriera anti-tumorale.

Ruolo della disposta al danno del DNA nello sviluppo didi terapie tumorali

La terapia tumorale ha come scopo fondamentale cercare di colpireSelettivamente le cellule tumorali e non quelle sane.

Pertanto tutti gli approcci di sviluppo di nuove terapie si basanosulla comprensione delle differenze tra cellule tumorali e non

Una differenza fondamentale è che le cellule tumorali proliferanomaggiormente. Pertanto molti approcci sono mirati a colpireil ciclo cellulare.

Un approccio molto utilizzato si basa sull’uso di sostanza cheinducono danno del DNA. Infatti le cellule tumorali in presenza didanno al DNA non arrestano il ciclo. Ciò rende tali sostanzeparticolarmente tossiche per le cellule che continuando a replicarsihanno maggiori probabilità di andare incontro a morte.

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From Helleday et al., 2008, European J of Cancer

From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev

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From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev