Ruolo dei linfociti T regolatori nella risposta immunitaria di cani affetti da Leishmaniosi Progetto/anno IZSAM 05/06 RC Auditorium del Parco della Scienza (TE) 9 Luglio 2012

Dr Michele Podaliri Vulpiani/ Dr Flavio Sacchini

Ruolo dei linfociti T regolatori nella risposta immunitaria di cani affetti da Leishmaniosi

Le leishmaniosi canina è una zoonosi causata da un protozoo, Leishmania infantum, la cui trasmissione avviene mediante insetti vettori (flebotomi), è responsabile della leishmaniosi viscerale. .

La conoscenza dei meccanismi immunopatogenetici nella specie canina è ancora oggi lacunosa. Importanti informazioni, sui meccanismi immunitari associati allo stato di progressione o di resistenza nelle infezioni sostenute da Leishmania spp, derivano da modelli sperimentali d’infezione su animali da laboratorio

In particolare è stato osservato che nel topo:

il controllo dell’infezione è associato a una risposta di tipo Th1

una risposta di tipo Th2 è invece associata a ipergammaglobulinemia e sintomatologia clinica

Ruolo dei linfociti T regolatori nella risposta immunitaria di cani affetti da Leishmaniosi

Negli ultimi anni, l ’ immunologia ha focalizzato l ’ attenzione su una nuova popolazione di linfociti i linfociti T regolatori (Treg), caratterizzati da attività di tipo regolatrice e in grado di modificare e controllare il tipo di risposta immunitaria mediante interazioni dirette cellula-cellula o mediante il rilascio di mediatori quali le citochine anti-infiammatorie (IL-10)

Valutare la risposta immunitaria nella sua componente umorale e cellulo mediata, in cani affetti da leishmaniosi e sottoposti a trattamento terapeutico;

Caratterizzare la popolazione di linfociti T regolatori nella specie canina e investigare il loro possibile coinvolgimento nella Leishmaniosi;.

Obiettivi del progetto

Valutare l’efficacia di due differenti protocolli terapeutici e l’evoluzione di alcuni parametri immunitari ed emato-biochimici a seguito del trattamento farmacologico.

9 animali adulti, meticci, maschi e femmine, di peso compreso tra 11 e 33 kg, naturalmente infetti da Leishmania infantum. Un gruppo di 3 animali, trattato con Glucantime® ed Allopurinolo Teva® Un gruppo di 6 animali trattati con Milteforan ® ed Allopurinolo Teva®

7

.

Durante il periodo di sperimentazione gli animali sono stati sottoposti:

ad esame clinico,

a prelievo di sangue intero e siero ogni 15 giorni per gli esami relativi a immunofenotipo linfocitario, esame emocromocitometrico, profilo biochimico-clinico, elettroforesi siero-proteica e valutazione del titolo anticorpale anti-leishmania mediante IFI.

Tutti gli animali sono stati sottoposti a trattamento periodico con Advantix® da Aprile ad Ottobre al fine di prevenire la diffusione della malattia ed eventuali re-infezioni.

Materiali e Metodi

Identificazione dei linfociti Treg nel cane

Le attività di ricerca mirate all ’ identificazione e caratterizzazione morfologica e funzionale dei linfociti T regolatori nel cane, sono state svolte in collaborazione con il Regulatory T Cell Laboratory, Department of Veterinary Clinical Sciences, The Royal Veterinary College, London, UK. Questi studi sono stati condotti su una popolazione canina residente in Inghilterra (Pinheiro et al., 2011).

Risultati

A seguito del trattamento è stata osservata una regressione della sintomatologia clinica e non sono state osservate differenze nei due gruppi di animali infetti trattati con due distinti protocolli terapeutici.

Risultati Analisi di gruppo dei parametri immuno-ematici con

variazioni significative nel tempo e/o tra i due gruppi

*

* **

**

**

* * *

*

a b c d

e f g h

Risultati

nel sangue e nei linfonodi periferici del cane è presente una popolazione di linfociti T regolatori caratterizzati dal fenotipo CD4+CD25highFOXP3highHelios+ sovrapponibile a quella osservata nel topo e nell’uomo

(c)

Caretterizzazione fenotipica dei Treg nel cane

Pinheiro et al. Phenotypic and functional characterization of a CD4(+) CD25(high) FOXP3(high) regulatory T-cell population in the dog. Immunology. 2011 Jan;132(1):111-22.

Risultati

I linfociti T CD4+ CD25high sono in grado di inibire la proliferazione delle cellule T CD4+ attivate; al contrario, le cellule T CD4+ CD25- non hanno evidenziato attività soppressiva (a). Una soppressione della proliferazione pari a circa il 70% è stata osservata in un totale di 9 esperimenti eseguiti sia su cellule ottenute da sangue periferico che da linfonodi (b).

Caratterizzazione funzionale in vitro dei Treg nel cane

Pinheiro et al. Phenotypic and functional characterization of a CD4(+) CD25(high) FOXP3(high) regulatory T-cell population in the dog. Immunology. 2011 Jan;132(1):111-22.

Legenda: 1 Linfociti T CD4+ non stimolati 2 Linfociti T CD4+ coltivati con linfociti T CD4+ CD25 high 3 Linfociti T CD4+ coltivati con linfociti T CD4+ CD25 neg 4 Linfociti T CD4+ CD25 high coltivati da soli 5 Linfociti T CD4+ CD25 high coltivati in presenza di IL-2 6 Linfociti T CD4+ CD25 neg coltivati da soli 7 Linfociti T CD4+ CD25 neg coltivati in presenza di IL-2

(a) (b)

Risultati

Le prove di stimolazione linfocitaria in vitro con Ag Leishmania non hanno evidenziato cellule CD4+ FOXP3high.

Le stesse prove hanno però dimostrato come l’Ag Leishmania sia in grado di promuovere la secrezione della citochina anti-infiammatoria IL-10 da parte dei linfociti (Treg?).

Studio del possibile ruolo dei Treg in corso di Leishmaniosi

Conclusioni

Sulla base dei risultati ottenuti, possiamo quindi affermare che entrambi i protocolli terapeutici sono stati efficaci nel trattamento della leishmaniosi canina. Dal punto di vista pratico, l’impiego di due farmaci da

somministrare per via orale (miltefosina e allopurinolo) si presenta più agevole come modalità di somministrazione.

Conclusioni

L’analisi dei parametri emato-biochimico impiegati

per monitorare l’evoluzione della malattia a seguito del trattamento, indica che i due protocolli terapeutici inducono variazioni di diverso grado ma con tendenze simili nel tempo, ad eccezione dei linfociti T nei quali si osservano andamenti opposti della sottopopolazione T CD3+CD8+ e del rapporto CD4/CD8 il cui significato richiede ulteriori studi.

Conclusioni

Nel sangue e nei linfonodi periferici della specie canina sono presenti linfociti Treg CD4+CD25highFOXP3highHelios+ fenotipicamente e funzionalmente sovrapponibili a quelli osservati nel topo e nell’uomo.

Conclusioni

In base ai risultati ottenuti non è possibile affermare

un coinvolgimento diretto dei linfociti Treg in corso di Leishmaniosi. Le prove in vitro su colture di linfociti, dimostrano che l’antigene Leishmania è in grado di promuovere l’attivazione di cellule con attività regolatoria, il rilascio di IL-10 e la modulazione in senso negativo della risposta immunitaria.

Conclusioni

Le analisi del profilo citochinico in vitro hanno inoltre evidenziato, nei singoli individui, una capacità variabile dell’antigene di promuovere la produzione di IFN-γ. Nel complesso tali risultati lasciano ipotizzare il possibile ruolo di IFN-γ e IL-10 nell’evoluzione della risposta immunitaria e dell’eventuale eliminazione o sopravvivenza del parassita.

Ruolo dei linfociti T regolatori nella risposta immunitaria di cani affetti da Leishmaniosi

GRAZIE PER L’ATTENZIONE