Ruolo degli Agenti Demetilanti

in Ematologia

Metilazione del DNA e Repressione della Trascrizione

Trascrizione attiva Repressione

POLII

C C C

TF

TF

C C C

XCH3 CH3 CH3

X

MeCP

DNA-non metilato DNA metilato

• Le “CpG islands” : 200 bp-5000 bp. Si trovano principalmente nei promotori dei geni e negli introni. • Sono normalmente non-metilate nei geni “house-keeping”• Sono metilate nei geni tessuto-specifici. La demetilazione determina il differenziamento cellulare (es: geni del differenziamento mieloide, HbF)

Metilazione nel genoma umano

Herman et al, NEJM, 2003

MBP

Rimodell

HDACDNMT

Silenziamento trascrizionale epigenetico

DNMT1, 3a, 3b

Istone metilasi

Silenziamento genico

TF

C C C

XCH3 CH3CH3

X

Ipermetilazione

siRNA

L’ ipermetilazione globalee’ frequente nelle LMA

Costello et al, Nature Genetics, 2000

Ipermetilazione di geni oncosoppressori

L’ipermetilazione contribuisce alla trasformazione e alla progressione neoplastica mediante l’inattivazione di geni oncosoppressori

L’ ipermetilazione di diversi geni si trova gia’ nelle lesioni pre-cancerose del colon, indicando il possibile ruolo dell’ipermetilazione durante la iniziazione della tumorigenesi. Elevata frequenza di ipermetilazione anche nelle MDS. Analogamente al colon, le MDS rappresentano spesso la fase pre-neoplastica delle AML

Il 68% delle t-MDS/t-AML presenta ipermetilazione di p15, che correla con la presenza di 7q-, allo stadio della t-MDS, e alla percentuale di blasti midollari (Christiansen, Leukemia 2003).

Crescita autonoma

“The Hallmarks of Cancer”

Blocco dell’

Apoptosi

Ridotta sensibilita’ ai segnali inibitori della

proliferazione

Angiogene

si

Replicazione Incontrollata

Angioinvasivita’ e

Metastasi

U

M

Cancro

Funzione Gene Mieloide Linfoide

Ciclo cellulare

p15, p16(Inib-Kinasi-CD)

MDS, AML, CML

ALL, NHL, MM

Trasduzione segnale

RAR AML ALL, NHL, MM

Estrogen receptor

AML, CML ALL, NHL, MM

Apoptosi

P73 (p53-like)

transcr.factor ALL, NHL, MM

DAP-kinasi AML-MDS ALL, NHL, MM

Contatto cell. Metastasi

E-Caderina(Ca++/adesione cell.)

CML (Cadherin-13), AML

ALL, NHL (Cadherin-13),

MM

Geni ipermetilati in Ematologia

Meccanismi di ipermetilazionenelle LMA

Diretto: Iperespressione di DNMT1, 3a, 3b

Mizuno et al, Blood 2001

Nella APL PML/RAR lega DNMT3a e interferisce con HDAC,bloccando l’espressionedi geni “RAR-dependent”(Di Croce et al, Science 2002)

Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA

Indiretti

AML1/Eto lega HDAC e reprime la trascrizione

(Amman et al, MCB 2001)

Geni importanti per la leucemogenesi,

regolati dalla metilazione del promotore

BRCA-1: e’ un gene di riparazione/ricombinazione del DNA, importante nel mantenimento

dell’integrita’ genomica. E’ metilato nel 65% dei tumori ovarici e nel 10% di quelli mammari non-

ereditari.

GSTP1: e’ un gene di detossificazione.

DAP-chinasi: è una serin/treonina chinasi, regolata da calcio e calmodulina, con una funzione pro-apoptotica.

MGMT(O6-metilguanina-metiltransferasi): è un gene di riparazione del DNA che rimuove agenti alchilanti e citotossici dalla posizione 06 della

guanina.

Methylation-Specific PCR (MSP)

100 bp DNA

Ladder

Unmethylated Methylated

Frequenza di ipermetilazionenelle LMA (n=150)

0

20

40

60

80

100

DAP-KINASI

MGMT BRCA-1 GSTP1

UnmethylatedMethylated

0

20

40

60

80

0

20

40

60

80

BRCA-1p= 0.06

GSTP-1p= 0.2

DAP-Kp= 0.01OR 2.8(1.3-6.3)

MGMTP= 0.04OR 5(1.2-22)

Therapy-related

De novo

Therapy-related

De novo

13/17

50/100

7/25

18/111

15/30

40/154

4/25

4/111

Ipermetilazionee leucemie therapy-related

Ipermetilazione e Prognosi

Overall Survival

T-MDS

Christiansen et al, Leukemia 2003

Roman-Gomez-J, n=251 pts, Blood 2004

Leucemia linfoblastica acuta

DFS

OS

Roman-Gomez-J, n=251 pts, Blood 2004

ALL

MGMT e Prognosi:84 pts con B-DLCL

Esteller et al, JNCI 2001

Agenti demetilanti

Trascrizione attiva

TF

C C C

CH3 CH3 CH3

Demetilanti: Azacitidina, Decitabina,Pseudoisocitidina,5-Fluorodeoxicitidina,Zebularina, Procainamide (?)Inibitori dell’ Istone Deacetilasi:

Acido Valproico, sodio-fenil-butirato,Tricostatina,Depsipeptide

DNMT1, 3a, 3b

MBP

Rimodell

HDACDNMT

Meccanismo di azione dell’Azacitidina

Herman et al, NEJM, 2003

0

1

2

3

4

5

t=0 1 2 3 4

Tc

Aza 0,5μM

Aza 1μM

Days of culture

Treatment of Jurkat cell line

Cells (

10

6/m

l)

Azacitidina Decitabina10

Ac.Ac

0

1

2

3

0 1 4

Dec 1μM

Tc

Ac.Ac

5 aza-2’-deoxicytidine Treatment Raji cell line

Demethylation MSP DAP-Kinasi

0 1 2 3 1 2 3 1 2 3 J -

200 nM DAC1 μM DAC mock

days

Unmethylated reaction

Methylated reaction

DAP-KINASE

5 aza-2’deoxicytidine Treatment Raji cell lineExpression

GAPDHM

0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 1 2 3 4 + -days

200 nM DAC 1 μM DAC mock

Demethylation of DAP-KINASEand Apoptosis (HL-60 cells)

0

4

8

12

Day 0 1 4

Tc

Aza 1μM

Ac.Ac

100 101 102 103 104

CD33 PE

4.5%Day 0

100 101 102 103 104

CD33 PE

2.3%

Ac.Ac

100 101 102 103 104

CD33 PE

14%

Aza

Day 4%

5-azacytidine TreatmentN= 191 pz with MDS

75 mg/m2 per 7 gg, ogni 28 gg

Silverman et al, JCO 2002

N=37 pz no CR/PR

At 4 months:Aza 60% response

CR 7%PR 16%Improved 37%

Supp. Care 5% improved

Silverman et al, JCO 2002

Time to AML transformation or Death

N=191 MDS pzOS in relazione all’IPSS

Leucopenia grado 3-4: 59%Neutropenia: 81%

Trombocitopenia 70%Infezioni 20%

Nausea e vomito 4%

Median Time to Progression Aza : 21 mesi

Supp. Care: 12 mesi

Van den Bosch et al, Leukemia 2004

Decitabine Treatment N=162 pz IPSS>Intermedio 1

PLTs stabili

PLTs dopo 1 ciclo

PLTs

Decitabine – Escalating dosesN=48, 35 AML, 7 MDS, 5 CML, 1 ALL

Issa et al, Blood 2004

Non-hematological side-effects

Decitabine – Bu/Cy for BMT(N = 43 pz)

Overall Survival

Decitabine 400 mg/m2

600800

Days -10 e -11 De Lima et al, Cancer 2003

Rischi della demetilazione

Attivazione di proto-oncogeniInstabilita’ cromosomica

Mutazioni

• Topi con ridotta DNMT1 presentano “ipometilazione” diffusa con ridotta stabilita’ genomica e presentano un’elevata incidenza di linfomi T (Gaudet et al, Science 2003)

• La sindrome ICF (immunodeficit, instabilita’ dei centromeri e anomalie faciali) e’ dovuta a una mutazione della DNMT3B e si caratterizza per una diffusa ipometilazione del DNA satellite. Incidenza di tumori non aumentata.

• La demetilazione farmacologica e’ transiente e reversibile entro 2 settimane (Yang AS, Science 2003)