MECCANISMO DI TRASCRIZIONE

Sintesi di RNA - DNA dipendente in procarioti

ESPRESSIONE DEL GENE

1909 Un GENE Errore congenito del metabolismo A.GARROD (Alcaptonuria nell’uomo)

Enzima G.BEADLE, E.TATUM

(Mutanti nutrizionali della neurospora Peptide V.M. Ingram (Emoglobinopatie: Hbs)

FLUSSO DELL’INFORMAZIONE

DNA RNA PROTEINA

Studio di proteine non enzimatiche (cheratina, insulina, emoglobina

UN GENE UNA CATENA UN POLIPEPTIDICA

1941

1963

Il promotore e’ il sito di attacco dell’ RNA polimerasi 2. Inizia a valle delle sequenze del PROMOTORE 3. A valle della sequenza codificata c’e’ la sequenza di TERMINAZIONE per la fine del processo di trascrizione 4. Negli eucarioti ogni trascritto inizia da un promotore

Sintesi di RNA

1. Il promotore e’ il sito specifico di attacco dell’ RNA polimerasi 2. La sintesi inizia a valle delle sequenze del PROMOTORE 3. Alla fine della sequenza genica c’è il segnale di TERMINAZIONE 4. Negli eucarioti ogni gene ha un suo promotore da cui inizia la trascrizione 5. La direzione di sintesi è 5’ 3’, per ogni gene è trascritto un solo filamento

RNA in allungamento 5’-3’

SINTESI DI MOLECOLE DI RNALe molecole di RNA sono trascritte dal DNA in base all’appaiamento delle basi complementari come nella duplicazione del DNA con significative differenze

Per la trascrizione di un gene/regione un solo dei due filamenti di DNA è letto : il filamento stampo. Il filamento di DNA non utilizzato come stampo viene definito filamento codificante, perché ha la stessa sequenza dell’RNA trascritto

Nella trascrizione l’ADENINA (A) ha come base complementare l’URACILE (U) al posto della Timina, che è assente nella molecola di RNA perché:

La timina assicura fedeltà di replicazione. Una comune mutazione, la deaminazione della citosina in uracile, è riconosciuta dalla DNApolimerasiI gruppi metilici hanno un ruolo chiave nell’espressione/silenziamento dei geni

Il metile coopera alle attrazioni idrofobiche tra le basi azotate

CARATTERISTICHE della struttura dell’ RNA

Periodo di emivita molto breve: minuti/ore per mRNA, giorni per rRNA e tRNA

Tre diverse molecole di RNA per tre diverse applicazioni : mRNA, tRNA rRNA che assumono complesse forme tridimensionali

La struttura bi/tridimensionale comprende regioni con basi appaiate, gli “steli” a doppi elica, connessi ad “anse” a filamento singolo

La molecola di RNA contiene coppie di basi non convenzionali e basi azotate modificate, utilizzate come siti di riconoscimento per proteine e altri RNA

L’enzima che polimerizza una molecola di RNA è l’RNA polimerasi autonoma nell’iniziare la sintesi e l’allungamento della catena, ma quasi incapace di correzione di errori

RNA polimerasi battericaLe cellule batteriche hanno un solo tipo di RNA polimerasi per la sintesi

di tutti i tipi di RNA: mRNA, rRNA, tRNA

Il “core” enzimato è costituito da 4 subunità: 2α, 1β, 1β’. Al “core” enzimatico si unisce il fattore σ: proteina che riconosce e si lega al promotore e dà inizio alla trascrizione. Senza fattore σ il processo inizierebbe a caso.

Modello molecolare

Dopo aver innescato il processo di inizio il fattore σ si distacca dal core enzimatico

PROCESSO DI TRASCRIZIONE

PROCARIOTI

1.Promotore: elemento regolatore con regioni a -35 e -10 specifico per

2. l’RNA polimerasi: oloenzima che mediante la subunità σ riconosce il sito di inizio, l’elica stampo e la direzione 5’-3’

3.Bolla di trascrizione l’RNApol catalizza il legame fosfodiestere mediante l’energia dei nucleotidi trifosfati4. La terminazione: indotta da sequenze G≡C specifiche con struttura a forcina o mediata dalla proteina ρ (rho)

TRASCRIZIONE IN PROCARIOTI

Nei Batteri un promotore può regolare la trascrizione di più geni

L’RNApol deve riconoscere esattamente l’inizio del gene

L’enzima si associa debolmente lungo il DNA, ma si aggancia strettamente solo a livello del PROMOTORE

Il FATTORE SIGMA (σ) svolge il ruolo di riconoscere il promotore e permettere l’ attacco della RNApol

L’RNApol sintetizza un RNA di 10 nucleotidi, il fattore σ si distacca e la polimerasi può continuare autonomamente

La doppia elica del promotore presenta una asimmetria, lega la polimerasi solo in un orientamento e, poiché la sintesi procede da 5’→ 3’, un solo filamento di DNA /gene viene trascritto

TRASCRIZIONE-TRADUZIONE PROCARIOTI

Elica di DNA NON stampo

Elica di DNA trascritta

Nei batteri è assente la membrana nucleare; NON avviene “maturazione” dei trascritti; il processo di traduzione inizia prima del completamento della trascrizione ; i due processi sono simultanei

POLISOMA (POLIRIBOSOMA)

E’ costituito da una serie di ribosomi ognuno con le rispettive molecole di polipeptide nascente che si sposta lungo la molecola di mRNA dall’estremità 5’ (la prima sintetizzata) alla 3’ (ancora in sintesi)

Immagine al microscopio elettronico di polisoma batterico

La simultaneità del processo di trascrizione e traduzione nei batteri è visualizzata dal POLISOMA

Meccanismo di TRASCRIZIONE e sua REGOLAZIONE in

EUCARIOTI

In che modo l’ informazione conservata nel nucleo arriva al citoplasma?

Una volta che l’informazione è uscita dal nucleo non può più tornare indietro (F. Crick)

Contenuto cellulare di RNA EUCARIOTICO

Classi di RNA presenti nei diversi sistemi cellulari: procarioti e eucarioti. Alcune molecole sono presenti solo all’interno del nucleo: small nuclear (sn) e small nucleolar (sno)

I microRNA sono costituiti da 18-25 nucleotidi, sono presenti in tutti gli eucarioti. A oggi sono stati identificati 12 geni per miRNA nelle cellule staminali.

CLASSIFICAZIONE degli RNA EUCARIOTICISigla Prodotto Funzione

mRNA proteina Trasferimento dell’informazione specifica codificata ai ribosomi

rRNA NO proteina Struttura ribosomi per la sintesi delle proteine

tRNA NO proteina Trasporto degli aminoacidi per la sintesi delle proteine

scRNA NO proteina Nell’apparato per smistamento delle proteine in sintesi

snRNA NO proteina Nell’apparato per maturazione degli mRNA

MicroRNA NO proteina Regolazione dell’espressione genica

Struttura del gene eucariotico e maturazione mRNA

Introne 2 3

(900 geni / 106 di bp nei procarioti rispetto a 9 geni / 106 di bp nell’uomo)

La complessità del genoma eucariotico ha reso più complicato il processo di trascrizione a causa di:

Una prima soluzione è rappresentata dall’uso di tre diverse RNA polimerasi con ruoli specifici e lavori differenziati

1. presenza della membrana nucleare; 2. organizzazione del genoma in cromatina; 3. struttura del gene “in pezzi”.

Gli eucarioti hanno un numero maggiore di geni, ma dispersi in una enorme quantità di DNA non codificante: la densità genica è 100 volte più bassa

GENI DISCONTINUI: gli INTRONI

1. Il prodotto della trascrizione è un RNA PRECURSORE (preRNA) che ha la stessa lunghezza del gene

2. Geni e trascritti primari hanno sequenze non codificanti : INTRONI

3. Le sequenze NON codificanti interrompono quelle codificanti

4. Le sequenze NON codificanti sono rimosse mediante RNA SPLICING

5. Le sequenze codificanti, ESONI, sono saldate tra loro nell’mRNA

6. Lo splicing è controllato da molecole snRNP = SPLICEOSOMA e da RIBOZIMI = molecole di RNA con funzione catalitica

RUOLO EVOLUTIVO del GENE DISCONTINUO: 1. splicing alternativo; 2. evoluzione di domini proteici(dominio= esone); 3. possibile aumento di ricombinazione; 4. proteine con nuovi assortimenti funzionali

Trascrizione e livelli di controllo PREtrascrizionali

La trascrizione può essere considerato un insieme di livelli di regolazione dell’espressione del gene

Pol I (nel nucleolo)→ pre-rRNA (28S, 5.8S, 18S) Pol III →tRNA e rRNA 5S e altri piccoli RNA (U6, 7S) Pol II → mRNA trascritto genico per le proteine. Ha un dominio

carbossi-terminale per la fosforilazione che determina attività enzimatica

I.

Cambiamenti nella conformazione della cromatina mediante fosforilazione, metilazione, deacetilazione,…. I fattori che rimodellano la cromatina partecipano all’attivazione dei promotori ( p.e. elicasi e altri implicati nell’assemblaggio dei complessi di inizio) Repressione mediata dalla struttura dell’eterocromatina che inibisce l’espressione genica in corrispondenza dei telomeri e di regioni compattate (eterocromatina , eucromatina ipoacetilate)

II.

Transito nella fase S del ciclo cellulare e riparazione cotrascrizionale dei danni al DNA sotto il controllo di fattori di espressione come TFIIH che

attiva la protein-chinasi necessaria

III.

LA TRASCRIZIONE IN EUCARIOTI

DNA a DOPPIA ELICA: un solo filamento stampo

MONOMERI costituiti da RIBONUCLEOTIDI TRIFOSFATI

Tre RNA polimerasi DNA dipendenti nucleari e una RNA polimerasi mitocondriale

Sito di inizio a monte di ogni gene: TATA box + fattori proteici di inizio

Direzione di sintesi: 5’ 3’⇨

Allungamento della catena : legame fosfodiestere

Assenza di attività di correzione delle bozze

Terminazione della sintesi con sequenze segnale specifiche :

RNA I ►18 nucleotidi ; RNA II ►10-35 nucleotidi a valle di AAUAAA

RNA III ►sequenze UUUU…

Inizio trascrizione eucarioti

TFIID = fattore di trascriz. specifico di Pol II, si lega a TBP e al DNA

L’RNApol II di mammifero ha una coda CTD: Dominio Carbossi-Terminale di 52 ripetizioni di un eptapeptide

TFII A,B,E,F: fattori trascrizionali costituenti l’oloenzima

TFII H: attività elicasica per aprire la doppia elica ( bolla di trascrizione)e di fosforilazione di CTD

La Pol II inizia a trascrivere, si allontana dal promoter - gli altri fattori vengono rilasciati - TBP resta sulla TATA box con altri TF che restano legati al promotore per attirare un’altra RNA pol II

RNA

TATA box: sede del 1° evento

TBP: TATA binding protein, attira gli altri GTF la RNApolII al promotore

RNApolII eTFIIF completano il complesso pre-iniziale PIC che adatta l’enzima nella precisa posizione di start

bolla di trascrizione

RNApol.II

Maturazione cotrascrizionale di RNA eucariotiNegli eucarioti il trascritto primario viene modificato durante il processo di maturazione ad opera del CTD: 1. aggiunta di un cappuccio all’estremità 5’; 2. aggiunta di una coda di poliA al 3’ (poliadenilazione); 3. meccanismo di splicing per la saldatura degli esoni dopo rimozione degli introni

Maturazioni delle estremità *5’: Durante l’allungamento dell’RNA proteine specifiche interagiscono con CTD aggiungendo al 5’ il cap(capping), residuo 7-metilguanosidico, di protezione e necessario per la traduzione *3’: alla fine della sintesi un enzima riconosce la sequenza AAUAAA , taglia l’estremità 3’ 20 basi dopo la sequenza e aggiunge un segmento di 150-200 Adenine

Splicing di RNA trascritto primario Rimozione di sequenze non codificanti dei geni eucariotici, gli introni, e saldatura delle sequenze codificanti, gli esoni. Dopo lo splicing l’mRNA ha una sequenza del tutto colineare con la sequenza primaria del polipeptide codificato. Grande quantità di DNA dei mammiferi codifica introni. Gene DMD: 79 esoni, 78 introni in 2,5x106 bp

CTD

1. L’ultimo fosfato dell’ultimo nucleotide 5’ trifosfato del preRNA viene rimosso e trasformato in difosfato

2. Aggiunta Guanosina monofosfato (GMP) 5’ con orientamento invertito

3. Formazione di un ponte trifosfato 5’-5’

CAP al 5’

4. Metilazione in posizione 7 della guanosina e metilazione del penultimo nucleotide in posizione 2 del ribosio

Meccanismo di splicing

Sequenze evolutivamente conservate

Particelle nucleari ribonucleoproteiche (snRNP) Small nuclear RiboNucleoprotein Particles

Legami H tra snRNA e sequenze complementari dli introni allineano i siti di splicing

Formazione del cappio

GU A

AG

Appaiamento complementare snRNA e sequenze introniche

Splicing alternativoDiversi tipi di splicing del gene α-tropomiosina nei vari tipi cellulari: 9 diverse proteine da un solo trascritto primario

Verde= introne Non verde=esoni A=Poliadenilazione

= regioni rimosse

Maturazione post-trascrizionale dell’mRNA eucariotico RNA precursore, copia esatta del gene, subisce modifiche strutturali prima

di uscire dal nucleo

1. Aggiunta del cap al 5’

2. Aggiunta della coda di poliA al 3’

3. Splicing degli esoni

4. Uscita dal nucleo come mRNA (maturo)

SIGNIFICATI DEI MECCANISMI POST-TRASCRIZIONALI

1. Aggiunta del cap al 5’ Protegge l’estremità 5’ dall’attacco delle esonucleasi

Favorisce il trasporto dell’RNA fuori dal nucleo

Svolge un ruolo nell’inizio della traduzione

2. Aggiunta della coda di poliA al 3’

situata 15 nucleotidi a valle di AAUAAA è il sito di riconoscimento per l’assemblaggio del complesso proteico che compie, in associazione con la RNApol, la maturazione dell’estremità 3’. Una endonucleasi taglia il pre-RNA a valle e la poli(A)polimer aggiunge 250 adenosine senza necessità di stampoUUU

Protegge l’estremità 3’ da una prematura degradazione da parte delle esonucleasi e identifica l’RNA come un messaggero

Sequenze regolatrici dei geni eucarioticiGli intensificatori (enhancer), lunghi 100-200 bp, possono essere localizzati fino a decine di migliaia bp a monte o a valle del promotore, all’interno di un introne o a valle dell’esone finale. Inducono un over-trascriction del gene. Mutazioni a livello di enhancer provocano diminuzione del prodotto genico

I repressori inibiscono l’espressione di un gene a livelllo della trascrizione. Proteine a tipica azione repressoria sono gli oncosoppressori. La mutazione di un sito di legame con il repressore provoca un aumento dell’espressione del gene. Il gene WT1 mutato → induzione del tumore di Wilms neonatale

Gli elementi di regolazione sono spesso specifici per tipo cellulare e attivi in relazione al differenziamento.Il gene TTR (transtiretina= proteina di trasporto nel sangue dell’ormone tiroideo) si esprime nell’epatocita e in cellule del cervello secernenti il liquido cerebrospinale. Sono stati identificati elementi di controllo di trascrizione alternativi, specifici per i due tessuti.

CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE

Regolatori della trascrizione a livello della struttura della cromatina mediante fosforilazione, metilazione, iperacetilazione e ipoacetilazione degli istoni, microRNA

Nelle cellule umane il TFIIH è anche un regolatore del ciclo cellulare necessario per attivare la protein-chinasi richiesta per il transito in fase S del ciclo cellulare e per la riparazione co-trascrizionale dei danni al DNA.

Gli elementi che controllano la trascrizione sono tessuto-specifici e responsabili del DIFFERENZIAMENTO cellulare

In trans: Proteine di legame affini al DNA ⇨ eterodimeri ► Intensificatori (enhancer):inducono livelli massimi di trascrizione► Repressori: p.e. la proteina del gene WT1(oncosoppressore), espresso nel

rene durante lo sviluppo, blocca l’espressione del gene EGR1

In cis: il PROMOTORE con la TATA BOX (-25) a cui si legano i fattori di base della trascrizione (TF)

TRASCRIZIONE e RETROTRASPOSONII trasposoni sono elementi genetici mobili che possono spostarsi all’interno di un genoma anche lasciando una propria copia nel sito originario.

1. trascrizione del DNA del trasposone con RNApol.

2.Trascrizione inversa di DNA RNA dipendente e sintesi di cDNA

Trasposizione attraverso intermediario di RNA

Integrazione in un diverso sito del DNA del trasposone. Possibili mutazioni per inserzione

Le sequenze umane LINE (long interspersed sequence: 3000 bp) e le SINE (100-400bp) sono retrotrasposoni capaci di spostamenti autonomi; sono il 20% del genoma umano. Tra le LINE le sequenze L1hanno una ORF per trascrittasi inversa. Caso di Emofilia in bambini per insrzione di L1nel gene fattore VIII (OMIM 306700)