Risposta Adattativa Indotta da Esposizioni a Radiofrequenza in Linfociti Umani Coltivati in vitro...

Risposta Adattativa Indotta da Esposizioni a Radiofrequenza

in Linfociti Umani Coltivati in vitro

Anna Sannino1, Olga Zeni1, Stefania Romeo1,Rita Massa1,2, Vijayalaxmi3, Maria Rosaria Scarfì1

[email protected]

1ICEmB c/o CNR, IREA - Via Diocleziano, 328 – 80124 Napoli; 2ICEmB c/o Università Federico II, Dipartimento di Scienze Fisiche, CMSA, Via Cintia, 80126 Napoli; 3University of Texas, Department of

Pathology, Health Science Centre, San Antonio, TX 78229, USA

Pisa, 30-31 maggio 2012

mailto:[email protected]

RISPOSTA ADATTATIVACapacità di una dose estremamente bassa di un agente mutageno

fisico o chimico (dose adattante) di ridurre l’effetto di un successivo trattamento a dosi maggiori dello stesso agente o di un agente

diverso (dose challenge)

Agenti induttori – radiazioni ionizzanti & mutageni chimici

Endpoints

Ben documentata in radiobiologia in vitro & in vivoE. Coli, cellule di mammifero e vegetali, roditori, lavoratori


FATTORI CHE INFLUENZANO LA AR MECCANISMI SUGGERITI Dose usata per l’adattamento (AD) Dose rate (RI) Intervallo di tempo tra la AD e la CD Fase del ciclo cellulare in cui viene

data la AD

Dose usata per l’adattamento (AD) Dose rate (RI) Intervallo di tempo tra la AD e la CD Fase del ciclo cellulare in cui viene

data la AD

Efficiente riparo del DNA Regolazione del ciclo cellulare Induzione di apoptosi Efficiente detossificazione dei

radicali liberi

Efficiente riparo del DNA Regolazione del ciclo cellulare Induzione di apoptosi Efficiente detossificazione dei

radicali liberi

Fenomeno eterogeneo – il 75% della popolazione esibisce RA, (tratti costituzionali e non fenomeni fisiologici transitori)

NON c’è un meccanismo di azione universalmente riconosciuto

NON c’è un meccanismo di azione universalmente riconosciuto


RISPOSTA ADATTATIVA

La maggior parte della letteratura indica cheEsposizioni a RF non sono in grado di indurre

danno diretto al DNA in vitro

La possibilità che esposizioni a RF inducano danno al DNA è stata ampiamente valutata a causa della correlazione diretta

tra effetti genotossici e cancerogenesi

Meltz ML, Bioelectromagnetics Suppl. 6: S196 - S213 (2003) Vijayalaxmi and Obe, Radiat Res 162: 481 – 496 (2004) Verschaeve L. Toxicol. Appl.Pharmacol. 207: S336 – S341 (2005) Moulder et al., Int J Radiat Biol. 81: 189 - 203 (2005) Vijayalaxmi and Prihoda, Radiat Res, 169: 561 – 574 (2008) Juutilainen et al., ICNIRP 16/2009: 103 – 118 (2009)

Meltz ML, Bioelectromagnetics Suppl. 6: S196 - S213 (2003) Vijayalaxmi and Obe, Radiat Res 162: 481 – 496 (2004) Verschaeve L. Toxicol. Appl.Pharmacol. 207: S336 – S341 (2005) Moulder et al., Int J Radiat Biol. 81: 189 - 203 (2005) Vijayalaxmi and Prihoda, Radiat Res, 169: 561 – 574 (2008) Juutilainen et al., ICNIRP 16/2009: 103 – 118 (2009)

Radiofrequenze e danno al DNA


Group 1: "Carcinogenic to humans" There is enough evidence to conclude that it can cause cancer in humans.

Group 2A: "Probably carcinogenic to humans" There is strong evidence that it can cause cancer in humans, but at present it is not conclusive.

Group 2B: "Possibly carcinogenic to humans" There is some evidence that it can cause cancer in humans but at present it is far from conclusive.

Group 3: "Unclassifiable as to carcinogenicity in humans" There is no evidence at present that it causes cancer in humans.

Group 4: "Probably not carcinogenic to humans" There is strong evidence that it does not cause cancer in humans.

Definizione IARC :

Categoria di agenti per i quali c’è una limitata evidenza di cancerogenesi nell’uomo e una insufficiente evidenza di

cancerogenesi negli animali da esperimento

IARC Classification of Radiofrequency Electromagnetic Fields (IARC Monographs Series, Vol. 102)

Associazione positiva per gliomi in utilizzatori di telefoni cellulari da più di 7 anni. Risultati simili per il neurinoma acustico ma su un

numero minore di casiPisa, 30-31 maggio

2012

La maggior parte degli studi in letteratura è stata eseguita impiegando radiazioni ionizzanti come AD

e/o CD per indurre RA

Campi a RF per determinare se radiazioni non ionizzanti sono in grado di indurre risposta

adattativa in linfociti umani da sangue periferico

Induzione di AR valutata come danno al DNA applicando il test del micronucleo (MN) col blocco della citodieresi

nel nostro laboratorio


S phase

anaphase

Cyt-B

MICRONUCLEUS ASSAY


Protocollo Sperimentale

Frequenza di MN su 2000 cellule/trattamento

t=0 t=0 t=24h t=24h t=48h t=48h t=72h t=72h

PHA PHA Cyt-B Cyt-B CD-MMC CD-MMC Cell harvest Cell harvest

t=44h t=44h

S phaseS phase

RFRF

20h in fase S

Colture da 3 ml (sangue periferico da donatori sani)

ControlloControllo 1 ng/ml MMC a 24h (AD)1 ng/ml MMC a 24h (AD) 100 ng/ml MMC a 48h (CD)100 ng/ml MMC a 48h (CD) 1+100 ng/ml MMC (AD+CD)1+100 ng/ml MMC (AD+CD)

ControlloControllo 1 ng/ml MMC a 24h (AD)1 ng/ml MMC a 24h (AD) 100 ng/ml MMC a 48h (CD)100 ng/ml MMC a 48h (CD) 1+100 ng/ml MMC (AD+CD)1+100 ng/ml MMC (AD+CD)

ShamSham RF (AD)RF (AD) Sham + MMC (100 ng/ml) (CD)Sham + MMC (100 ng/ml) (CD) RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD)RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD)

ShamSham RF (AD)RF (AD) Sham + MMC (100 ng/ml) (CD)Sham + MMC (100 ng/ml) (CD) RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD)RF + MMC (100 ng/ml) (AD+CD)

Esposizioni a RF (20 h) come dose adattante (AD)MMC (100 ng/ml) come dose challenge (CD)

Controlli positivi: colture trattate con MMC sia come AD (1 ng/ml) sia come CD (100 ng/ml)


Analisi dei risultati

*danno atteso (MN) nei trattamenti combinati (AD + CD) calcolato come la somma di MN nei due trattamenti individuali

meno il numero di MN nelle colture non trattate (controllo)

% Decremento del danno al DNA% Decremento del danno al DNA[(danno atteso* – danno osservato)/atteso] x 100

Analisi StatisticaAnalisi StatisticaLa significatività statistica della riduzione del danno osservato

rispetto a quello atteso è stata calcolata per ogni soggetto esaminato col test z a coppie; nell’insieme i trattamenti sono stati

analizzati col t di Student per dati appaiati


Attività sperimentale


I° studio –I° studio – valutazione dell’induzione di RA in seguito a esposizioni a 900 MHz, GSM, SAR 1.25 W/kg in fase S del ciclo cellulare

II° studio –II° studio – ruolo della dalla fase del ciclo cellulare dell’induzione di Risposta Adattativa da RF

III° studio –III° studio – valutazione della dipendenza dai parametri elettromagnetici nell’induzione di RA da RF

IV° studio – IV° studio – valutazione della dipendenza dal meccanismo di azione dell’agente challenge nell’induzione di RA da RF

In corso di svolgimento – In corso di svolgimento – valutazione della dipendenza dal tipo cellulare e meccanismo di azione coinvolto nella RA da RF

Applicatore: Wire Patch Cells900 MHz (GSM), SAR medio 1.25 W/kg

Due piastre parallele, cortocircuitate agli angoli da quattro cilindri

Piccole dimensioni (15x15x3cm)

Alloggiamento in incubatori standard per colture cellulari (controllo delle condizioni ambientali)

Per evitare interferenze radiative con il sistema di controllo elettronico dell’incubatore, le WPC sono ospitate in gabbie schermanti rivestite da pannelli assorbenti

Esposizioni simultanee di 4 Petri ( 3.5 cm) nelle stesse condizioni di esposizione

I° studio


Sistema di esposizioneSistema a due canali, controllato da remoto per il monitoraggio delle

potenze nelle WPCs per garantire la procedura in cieco

Due spiraline sulle facce esterne delle WPC con acqua circolante a 36.8 °C per garantire nelle Petri esposte 36.8-37.1°CT° misurata in colture dummy durante le 20 h di esposizione

INCUBATOR

VSWR METER 1

SIGNAL GENERATOR 1

SIGNAL GENERATOR 2

AMPLIFIER 1

AMPLIFIER 2

VSWR METER 2

Feedback

Net power (?)

FIBER OPTIC THERMOMETER


I° studio

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

0 200 400 600 800 1000 1200

time (min)

Te

me

pe

ratu

re (

°C)

T1(exposed)

T2(sham)

DosimetriaDosimetria numerica – Computer Simulation Technology (CST) (tecnica

dell’integrazione finita) per determinare i valori di SAR e la distribuzione nel campione

4 Petri ( 3.5 cm) Caratteristiche dei materiali:

sangue ’= 61; =1.54 S/m; terreno: ’= 61; =1.54 S/m Altezza della miscela 3 mm Risoluzione del modello: 1 mm size cells

Dosimetria sperimentale- 4 Petri con 3 ml di terreno posizionate come per la simulazione. Misure di temperatura in cinque punti per ogni Petri. SAR medio valutato per ogni Petri

Efficienza media della WPC: 0.35 W/kg/W ± 28% tra le misure

Set up del sistema di esposizione e dosimetria approvati dalla FDA (progetto CRADA, in collaborazione con l’ENEA – Casaccia)

Scarfì et al., Rad. Res. 165, 655-663 (2006)


I° studio

*P<0.01*P<0.01

20 h di esposizione a RF nella fase S/G2 del ciclo cellulare inducono un significativo decremento del danno al DNA indotto da MMC (AR)


RISULTATI I° studio

0

30

60

90

120

150

180

#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11

donors

MN

fre

qu

en

cy

/ 20

00

ce

lls

expected

observed

*

**

*

**

*

*

*

L’entità della RA variava tra i donatori (decremento di danno al DNA compreso tra 35-56%)

0

10

20

30

40

50

#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11

donors

MN

fre

qu

en

cy

/20

00

ce

lls Sham-exposed

RF-exposed

I linfociti di tutti i donatori esaminati hanno una frequenza di MN simile nelle colture esposte e sham-esposte (p=0.453)


RISULTATI I° studio

L’esposizione a RF non induce effetti genotossici

assenza di effetti genotossici e citotossici in linfociti umani

Produzione di un “trigger” in grado di indurre RA: protezione da un successivo trattamento con una dose challenge di un agente

genotossico (MMC)

20h di esposizione (900 MHz, GSM, SAR 1.25 W/kg)


I° studio

ScopoConfermare le osservazioni precedenti su un

maggior numero di individui verificare l’induzione di RA in differenti fasi del

ciclo cellulare


II° studio

6-8 h 24-30 h

dopo 45 h mitogeno

Ciclo cellulare in linfociti umani

Preston et al., Mut Res 189: 175-183 (1987)Bender et al., Mut Res 196: 103–159 (1988)

in G0: prima della stimolazione con mitogeno

in G1: da 4 a 24 h dopo la stimolazione

in fase S: da 24 a 44 h dopo la stimolazione (= studio I)

20 h di esposizione

t=0 t=0 t=4h t=4h t=24h t=24h t=48h t=48h t=72h t=72h

PHA PHA Cyt-B Cyt-B CD-MMC CD-MMC Cell harvest Cell harvest

GG11 phase phase

t=44h t=44h

S phaseS phase

RFRF

RFRF

G0 phase

RF

(900 MHz, GSM, average SAR 1.25 W/kg)


II° studio

0102030405060708090

#1 #2 #3 #4MN

fre

qu

en

cy/2

00

0 C

B c

ells

donors

expected

observed

RISULTATIEsposizioni a RF in fase S inducono un significativo

decremento del danno al DNA indotto da MMC (AR)

Validazione dei risultati precedenti su un maggior numero di individui


II° studio

Esposizioni a RF in fase G0 o G1 non proteggono da un successivo trattamento genotossico

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

#1 #2 #3 #4

MN

fre

qu

en

cy

/20

00

CB

ce

lls

Donors

expected

observed


II° studioRISULTATI

Significativo decremento del danno indotto da MMC (adattamento) in cellule esposte a RF in fase S (24-44h)

Nessun effetto della RF in fase G0 (prima della stimolazione) o G1 (da 4 a 24 h dalla stimolazione)

Nessun effetto della sola esposizione a RF

Conferma delle osservazioni precedenti su un maggior numero di individui

Relazione tra la fase del ciclo cellulare in cui avviene l’esposizione e l’induzione di RA


II° studio

Estendere la caratterizzazione della RA indotta da RF in linfociti umani valutando l’induzione dell’adattamento

in differenti condizioni di esposizione(frequenza, modulazione, SAR)

AD: 20 h RF in fase S; CD: 100 ng/ml MMC a 48 h

f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 1.25, 0.6, 0.3, 0.15 W/kg

AD: 20 h RF in fase S; CD: 100 ng/ml MMC a 48 h

f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 1.25, 0.6, 0.3, 0.15 W/kg


III° studioScopo

Sistema di esposizione e dosimetriaSistema di esposizione e dosimetria

Guida d’onda cortocircuitata alloggiata in un incubatore a

CO2 per colture cellulari

Modulazione WCDMA, in accordo con le specifiche 3GPP 3.5 2001-03 (cinque canali di dati + un canale di

controllo)

In condizioni di campo elettrico parallelo, elevata efficienza (fino a 80 %) e limitata disuniformità di SAR (meno del 30 %)In condizioni di campo elettrico parallelo, elevata efficienza (fino a 80 %) e limitata disuniformità di SAR (meno del 30 %)


III° studio

0.6 W/kg

0.6 W/kg

0.15 W/kg

0.15 W/kg

1.25 W/kg

1.25 W/kg

0.3 W/kg

0.3 W/kg

Inserendo 4 Petri (colture da 3ml), si ottiene un SAR più elevato nelle posizioni centrali rispetto alle posizioni esterne e, fissando opportunamente la distanza il centro dei campioni si ottiene un rapporto di 1:4 tra i valori di SAR interno ed esterno

Misure a intervalli di 5 sec

La variazione di T° non ha mai superato l’accuratezza dello strumento (± 0.3 °C). Cinque misure indipendenti

Ulteriori misure di T° a intervalli regolari durante la fase sperimentale

Controllo della Temperatura

Sham esposizioni in un applicatore identico, alloggiato nello stesso incubatore, ma senza segnale

Sham esposizioni in un applicatore identico, alloggiato nello stesso incubatore, ma senza segnale

Esperimenti preliminari per monitorare l’andamento della T° durante le 20 h di esposizione al SAR maggiore (1.25 W/kg) mediante un termometro a fibra ottica inserito in orizzontale nella coltura


III° studio

L’entità dell’adattamento variava al variare degli otto donatori esaminati

0

10

20

30

40

50

60

70

0.15 0.3 0.6 1.25

MMC SAR (W/ kg)

MN

fre

qu

ency

/2

00

0 C

B c

ells

#1 Expeted

#1 Observed

*

*

Nessun effetto della sola RFRF data come AD induce un significativo decremento

del danno indotto da MMC (AR) solo con 0,3 W/kg

*P<0.01-44%

-52%


III° studioRISULTATI

20h di esposizione a RF (1950 MHz, modulazione UMTS)

nessun effetto della sola RF; induzione di AR – protezione da un successivo trattamento con MMC; effetto dipendente dal SAR; effetto simile a quello osservato in linfociti esposti a 900 MHz (GSM)


III° studio

Verificare se la RA indotta da esposizioni a RF è dipendente dal meccanismo di azione con cui l’agente

utilizzato come challenge induce danno al DNA

AD: 20 h RF in fase S; CD: 1 o 1.5 Gy RX a 48 h

f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 0.3 W/kg

AD: 20 h RF in fase S; CD: 1 o 1.5 Gy RX a 48 h

f = 1950 MHz; UMTS; SAR: 0.3 W/kg


IV° studioScopo

MMC - induttore di crosslinks (legami crociati tra le eliche del DNA)

Raggi X - induttori di rotture dirette al DNA


IV° studioRISULTATI

Nessun effetto della sola RFL’esposizione a RF induce un significativo decremento

del danno indotto da 1.5 Gy di RX Nessun effetto sul danno indotto da dosi minori (1 Gy)

Risultati ottenuti da colture di linfociti da quattro donatori

Progetto INFN – ARCAICA (2010 -2011)

CNR – IREA & Dipartimento di Scienze Fisiche, Università Federico II

(G Gialanella, GF Grossi, L Manti, P Scampoli)

Manoscritto in corso di stesura

a. impiego di tipi cellulari differenti per valutare la RA da RF in dipendenza dal tipo cellulare

(fibroblasti di roditore)

b. valutazione dei meccanismi alla base della RA da RF (apoptosi, ciclo cellulare, enzimi di riparo del DNA)

c. Valutazione di altre condizioni sperimentali in grado di indurre RA

(durate dell’esposizione, campi statici, campi ELF, ….)


attività in corso

Pre-esposizioni di topi a 900 MHz (GSM), 120 µW/cm2 1 h/g per 14 gg e poi a una dose letale di raggi gamma (8 Gy) inducevano un significativo incremento di sopravvivenza rispetto ad animali esposti solo ai raggi gamma. (Cao et al., 2011).

Recentemente, due gruppi di ricerca indipendenti hanno riportato che pre-esposizioni a RF inducono AR in roditori esposti ad alte dosi di

radiazioni ionizzanti




Pre-esposizioni di topi a 900 MHz at 120 µW/cm2 per 4 h/g per 1, 3, 5, 7 e 14 gg e poi esposti a una dose acuta di raggi gamma (3 Gy) inducevano un significativo decremento del danno al DNA (comet) rispetto ad animali esposti solo ai raggi gamma. (Cao et al., 2012).

Jiang B, Nie J, Zhou Z, Zhang J, Tong J, et al. (2012) Adaptive Response in Mice Exposed to 900 MHz Radiofrequency Fields: Primary DNA Damage. PLoS ONE 7(2): e32040. doi:10.1371/journal.pone.0032040

Pre-esposizioni di topi (6 h/g per 5 gg) a 900 MHz (GSM, SAR 1.2 W/kg) e ratti per 6 gg e poi esposti a una dose letale di raggi gamma (8.8 Gy) inducono aumento di sopravvivenza rispetto alle esposizioni con soli raggi gamma (Mortazavi et al., 2011)






CONCLUSIONI

La resistenza indotta da pre-esposizioni a RF da comuni sorgenti quali i telefoni cellulari potrebbe interferire con la risposta a

successivi trattamenti terapeutici

La caratterizzazione di RA da RF potrebbe aprire nuove prospettive verso l’uso delle radiazioni non ionizzanti per la

protezione dell’uomo dall’azione genotossica di trattamenti per scopi diagnostici (rischio di trasformazione cellulare dovuto

alle conseguenze di esposizioni protratte a basse dosi di RI)


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