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PLATELIA™ Candida Ag Plus

96 62784RILEVAZIONE DELL’ANTIGENE MANNANO DI CANDIDA NEL SIERO O PLASMA UMANO MEDIANTE METODO IMMUNOENZIMATICO

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1- FINALITÀ DEL TESTPlatelia™ Candida Ag Plus è una tecnica immunoenzimatica tipo sandwich in micropiastra per la rilevazione dell’antigene mannano di Candida nel siero o plasma umano.

2- INDICAZIONI PER L’USOLa diagnosi di candidosi invasiva deve essere basata sulla ricerca di anticorpi abbinata alla ricerca di antigeni circolanti. 13

Platelia™ Candida Ag Plus (codice 62784) è un test che, utilizzato unitamente a Platelia™ Candida Ab Plus (codice 62785), contribuisce a migliorare la precocità e la sensibilità di tale diagnosi nell’ambito di una procedura diagnostica completa integrante i fattori di rischio intrinseci e iatrogeni e i dati clinici e micologici 10, 13, 14. Rientra inoltre nella logica di un sistema di sorveglianza bioclinica dei pazienti come aiuto alla decisione terapeutica. 8

3- INTERESSE CLINICOLe infezioni da Candida sono le più frequenti infezioni fungine nosocomiali e le candidemie rappresentano la quarta causa di setticemie di origine nosocomiale. 12, 15, 16

Sul piano clinico, le candidosi invasive rappresentano le infezioni più gravi con un tasso di mortalità che oscilla tra il 30 e il 70% nei pazienti immunodepressi. La formulazione della diagnosi rimane difficile a causa della bassa specificità dei sintomi clinici e della ridotta sensibilità delle tecniche di emocoltura. Nella maggior parte dei casi è un insieme di valutazioni che consente di sospettare una candidosi invasiva e di approntare una terapia idonea 2. In questo contesto, la diagnosi delle candidosi sistemiche deve necessariamente associare le tecniche sierologiche ai metodi micologici diretti. La ricerca di antigeni in circolo nel siero o plasma sembra essere un modo per migliorare questa diagnosi nei pazienti a rischio di candidosi invasiva 10, 13, 14. I principali rischi includono la neutropenia successiva a chemioterapia o trattamento immunosoppressivo (cancerologia, oncoematologia, trapianto) 4, 10, l’antibioticoterapia ad ampio spettro, la presenza di cateteri venosi, la nutrizione parenterale, la dialisi renale, l’impianto di protesi (rianimazione medica e chirurgica). 5, 13, 16

Tra gli antigeni della Candida, il mannano è un polisaccaride legato in modo non covalente alla parete cellulare e rappresenta oltre il 7% del peso secco di C. albicans. Tale antigene sembra costituire uno dei principali marcatori delle candidosi invasive.Un follow-up regolare dei pazienti a rischio, che abbini la rilevazione dell’antigene mannano e degli anticorpi anti-mannano, costituisce un aiuto alla diagnosi delle candidosi invasive. 9, 10, 13

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4- PRINCIPIO DELLA PROCEDURAPlatelia™ Candida Ag Plus è una tecnica immunoenzimatica tipo sandwich, realizzata in una fase, su micropiastra, che consente la rilevazione dell’antigene mannano di Candida circolante nel siero o plasma umano. L’anticorpo monoclonale (Acm) di topo, EBCA-1, diretto contro le α 1-5 oligomannosidi di Candida, caratterizzato nel corso di lavori precedenti 13, 14, viene utilizzato per:• Sensibilizzareipozzettidellamicropiastraelegarsiall’antigenemannano,• Rilevare l’antigene legatoallamicropiastrasensibilizzata (coniugato:Acm

marcato con perossidasi).I campioni di siero o plasma vengono trattati con il calore in presenza di EDTA per dissociare i complessi immuni e precipitare le proteine siericheche potrebbero eventualmente interferire con la reazione immunoenzimatica. I campioni di siero o plasma trattati e il coniugato vengono distribuiti nei pozzetti della micropiastra sensibilizzati con l’anticorpo monoclonale anti-mannano.Dopo l’incubazionea37°C, le strip vengono lavateper rimuovere tuttociòche non viene legato. In presenza di mannano circolante nel campione umano, si forma un complesso: Ac anti-mannano – mannano - Ac anti-mannano/ perossidasi.L’aggiunta di cromogeno contenente il substrato della perossidasi e incubato a temperatura ambiente permette lo sviluppo dei complessi eventualmente formati.La reazione enzimatica viene bloccata attraverso l’aggiunta di acido solforico 1N.La lettura della densità ottica viene effettuata con uno spettrofotometro impostato su 450/620nm.

5- REAGENTILe quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire l’esecuzione di 96 test in un massimo di 9 cicli.Per informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di scadenza dei reagenti, consultare le indicazioni riportate sulla confezione.Prima dell’uso, consentire a tutti i reagenti di raggiungere la temperatura ambiente (+18-30°C). Subito dopo l’uso, riportare tutti i reagenti a +2-8°C. Riporre le strip non utilizzate nell’involucro originario e richiudere con cura. Non rimuovere l’essiccante.

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Componente Contenuto Quantità

R1 Microplate

Micropiastra: - 96 pozzetti (12 strip da 8 pozzetti ciascuna)

sensibilizzati con l’anticorpo monoclonale anti-mannano EBCA-1.

1

R2Concentrated

Washing Solution (20x)

Soluzione di lavaggio concentrata (20 x): - Tampone Tris-NaCl (pH 7,4)- 2 %Tween® 20- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300

1 x 70 ml

R3 Calibrator 0

Calibratore 0 pg/ml (pronto per l’uso):- Tampone Tris-NaCl-Trealosio, non contenente

mannano purificato da Candida albicans- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300

1 x 2,0 ml

R4a Calibrator 62.5

Calibratore 62,5 pg/ml (pronto per l’uso):- Tampone Tris-NaCl-Trealosio- Mannano purificato da Candida albicans- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300

1 x 2,0 ml

R4b Calibrator 125

Calibratore 125 pg/ml (pronto per l’uso):- Tampone Tris-NaCl-Trealosio- Mannano purificato da Candida albicans- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300

1 x 2,0 ml

R4c Calibrator 250


1 x 2,0 ml

R4d Calibrator 500


1 x 2,0 ml

R0Negative Control

Controllo negativo:- Siero umano negativo per il mannano- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300

2 x 1,5 ml

R5Positive Control

Controllo positivo:- Siero umano contenente mannano- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300

2 x 1,5 ml

R6 Conjugate

Coniugato (pronto per l’uso): - Anticorpo monoclonale anti-Mannano, marcato

con perossidasi- Porpora bromocresolo - Conservante: <1,5% ProClin™ 300

1 x 17 ml

R7Sample

Treatment Solution

Soluzione di trattamento dei campioni (pronta per l’uso):-soluzioneacidadiEDTAsenzaconservante

1 x 10,5 ml

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6- NORME D’IGIENE E DI SICUREZZA1. Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.2. Esclusivamente per uso professionale.3. Si raccomanda di non utilizzare il presente test con campioni che non

siano di siero o plasma umano.4. Il controllo negativo (R0) e il controllo positivo (R5) sono preparati con

siero umano analizzato e risultato negativo alla ricerca di anticorpi anti-VIH-1, anti-VIH-2, anti-VHC nonché alla ricerca dell’antigene HBs con test marcati CE. Tutti i reagenti, tuttavia, devono essere manipolati come materiale potenzialmente infettivo. Tutti i test devono essere eseguiti conformemente allo standard OSHA relativo agli agenti patogeni trasmessi per via ematogena, livello 2 di biosicurezza, o conformemente ad altre norme di biosicurezza adeguate.

5. Indossare indumenti protettivi, inclusi un camice da laboratorio, una maschera protettiva per gli occhi e il viso e guanti monouso (si raccomanda l’uso di guanti in materiale sintetico senza lattice) e manipolare i reagenti del kit e i campioni dei pazienti attenendosi alle buone prassi di laboratorio richieste. Lavarsi accuratamente le mani dopo l’esecuzione del test.

6. Non pipettare con la bocca.7. Non fumare, bere o mangiare nelle zone di manipolazione dei campioni o

dei reagenti del kit.8. Evitare schizzi di campioni o soluzioni.9. Pulire accuratamente le superfici contaminate da liquido non contenente

acido utilizzando un disinfettante efficace. I disinfettanti utilizzabili includono (a titolo esemplificativo ma non esaustivo) una soluzione di candeggina diluita al 10% (soluzione allo 0,5% di ipocloruro di sodio), di etanolo al 70% o di Wescodyne Plus™ allo 0,5%. Il materiale utilizzato per la pulizia dovrà essere gettato in un apposito contenitore per rifiuti contaminati.

ATTENZIONE: Non introdurre mai soluzioni contenenti candeggina nell’autoclave.

Componente Contenuto Quantità

R9Chromogen

TMB

Soluzione TMB cromogeno (pronta per l’uso):- Soluzione di 3,3’,5,5’ - tetrametilbenzidina

(< 0,1%), H2O2 (<1,0%)1 x 28 ml

R10Stopping Solution

Soluzione bloccante (pronta per l’uso):- Soluzione di acido solforico 1N

1 x 28 ml

Pellicole adesive 4

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10. Se il liquido contaminante è un acido, pulire o neutralizzare le superfici con bicarbonato di sodio, quindi risciacquare e asciugare la zona; nel caso in cui il liquido contaminante contenga materiale biologicamente pericoloso, lavare la zona con un disinfettante chimico.

11. Eliminare tutti i campioni e i reagenti utilizzati per il test come materiale potenzialmente infettivo. L’eliminazione dei rifiuti chimici e biologici pericolosi deve essere effettuata conformemente alle normative in vigore.

12. ATTENZIONE:Diseguitoèriportatounelencodeipotenzialirischichimicipresentati da alcuni componenti del kit (fare riferimento al capitolo 5 - REAGENTI)

AVVERTENZA: Alcuni reagenti contengono ProClin™ 300 < 1,5%

Per i rischi e le raccomandazioni di sicurezza consultare la tabella alla fine dell’inserto della confezione.

13. Su richiesta è disponibile la scheda dei dati di sicurezza.

7- PRECAUZIONI PER L’USO1.I CAMPIONI DI SIERO O PLASMA CONGELATI E CONSERVATI IN

CONDIZIONI IGNOTE POSSONO FORNIRE FALSI RISULTATI POSITIVIDOVUTIALLACONTAMINAZIONEDAPARTEDIFUNGHIE/OBATTERI.

2. Non utilizzare il kit o uno dei reagenti dopo la data di scadenza. 3. Non mischiare, né combinare reagenti provenienti da kit con numeri di

lotto diversi in uno stesso ciclo.

OSSERVAZIONE: per la soluzione di lavaggio (R2, identificativo* 20x color verde), il Cromogeno (R9, identificativo* TMB color turchese) e la soluzione bloccante (R10, identificativo* 1N color rosso) è possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, a condizione che i reagenti siano strettamente equivalenti e venga utilizzato un unico lotto in uno stesso ciclo di analisi.

OSSERVAZIONE: la soluzione di lavaggio (R2 identificativo* 20X color verde) non può essere mischiata con la soluzione di lavaggio (R2 identificativo* 10X color blu) fornita nei kit reagenti Bio-Rad.

* sull’etichetta del flacone4. Prima dell’uso, attendere 30 minuti per consentire ai reagenti di

raggiungere la temperatura ambiente (+18-30°C).5. Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure elementi in vetro

perfettamente lavati e risciacquati con acqua distillata.6. Verificare l’accuratezza delle pipette e il corretto funzionamento delle altre

strumentazioni. 7. Ricostituire con cura il reagente R2, evitando qualsiasi contaminazione.

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8. La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrinoin contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o la soluzione substrato.

9.Durante il pipettamento dei calibratori, dei controlli e dei campioni,utilizzare sempre un nuovo recipiente per distribuire il siero al fine di evitare qualsiasi contaminazione.

10. Per garantire un lavaggio adeguato dei pozzetti, eseguire il numero di cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una volta riempiti, vengano completamente svuotati. Il lavaggio deve essere eseguito con un sistema di lavaggio per micropiastre.

11. Non fare asciugare la micropiastra nell’intervallo di tempo compreso tra la fine del ciclo di lavaggio e l’aggiunta dei reagenti.

12. Non utilizzare lo stesso contenitore per il coniugato e la soluzione di sviluppo.

13. Evitare di esporre la soluzione di cromogeno o la soluzione di sviluppo ad una luce intensa durante lo stoccaggio o l’incubazione. Evitare che le soluzioni contenenti il cromogeno entrino in contatto con un agente ossidante.

14. Il Cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione blu indica che il reagentenonpuòessereutilizzato,pertantodovràesseresostituito.

15. Evitare che la soluzione bloccante entri in contatto con agenti ossidanti, metallo o ioni metallici.

16. Non reintrodurre nel flacone originario il coniugato in eccesso non distribuito.

8- PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI

Micropiastra (R1)Ogni vassoio contenente 12 strip è confezionato in una bustina. Con un paio di forbici, tagliare la bustina al di sotto della saldatura. Aprire la bustina ed estrarre il vassoio. Riporre il vassoio contenente le strip non utilizzate nella bustina originaria. Richiudere con cura la bustina e conservarla a +2-8°C.Dopol’aperturadellabustinasottovuoto,lestripmantengonolastabilitàfinoa 8 settimane se conservate a +2-8°C nella bustina originaria, richiusa con cura. Verificare la presenza di essiccante.

Soluzione di lavaggio (R2)Diluire in rapporto 1:20 la soluzione di lavaggio concentrata in acquadistillata: 50 ml di R2 in 950 ml di acqua distillata. (Prevedere 400ml di soluzione di lavaggio diluita per una piastra completa da 12 strip al di fuori del volume morto dovuto alla strumentazione utilizzata).

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Dopo la diluizione, la soluzione di lavaggio può essere conservata per 14giorni a +2-30°C.Dopol’apertura,lasoluzionedilavaggioconcentrataconservataa+2-30°C,in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.

Calibratore 0 (R3), Calibratore 62,5 (R4a), Calibratore 125 (R4b), Calibratore 250 (R4c), Calibratore 500 (R4d):I calibratori sono pronti per l’uso.Dopo l’apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a+2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.

Controllo Negativo (R0), Controllo Positivo (R5):Il controllo negativo (R0) e il controllo positivo devono essere trattati con la soluzioneacidadiEDTA(R7)comeicampionideipazientiperfungereancheda prova del trattamento.Dopo l’apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a+2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.

Coniugato (R6), Soluzione di trattamento dei campioni (R7), Soluzione TMB cromogeno (R9):Questi reagenti sono pronti per l’uso.Dopo l’apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a+2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.

Soluzione bloccante (R10):Questo reagente è pronto per l’uso. Dopo l’apertura, questo reagente conservato a +2-8°C, in assenza dicontaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta.

9- CAMPIONI1. I test vengono eseguiti su campioni di siero o plasma raccolto su

anticoagulanteditipoEDTA,eparinaocitrato.2. Per il prelievo, il trattamento e la conservazione dei campioni ematici,

attenersi alle seguenti raccomandazioni:• Prelevareuncampionedisanguesecondoleprecauzioniinuso.• Perilsiero,consentirelacompletacoagulazionedeicampioniprimadi

procedere alla centrifugazione.• Conservareleprovettechiuse.• Dopolacentrifugazione,estrarreilsierooilplasmaeconservarloinuna

provetta chiusa.• Icampionipossonoessereconservatia+2-8°Cacondizionecheiltest

venga eseguito entro 5 giorni.

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• Seiltestnonvieneeseguitoentro5giorni,congelareicampioniadunatemperatura di -20°C (o -80°C).

• Siraccomandadinonprocedereapiùdicinqueciclidicongelamento/ scongelamento. I campioni devono essere accuratamente miscelati (Vortex) dopo lo scongelamento e prima del test.

3. I campioni contenenti 60 g/l di albumina umana o 120 g/l di proteine totali oppure 200 mg/l di bilirubina non coniugata o 200 mg/l di bilirubina coniugata, i campioni lipemici contenenti l’equivalente di 30 g/l di trioleina (trigliceride) o 5 g/l di colesterolo o i campioni sottoposti ad emolisi contenenti 2 g/l di emoglobina non influenzano i risultati.

4. Non riscaldare i campioni.

10- PROCEDURA

Materiale fornitoVedere il capitolo REAGENTI

Materiale richiesto ma non fornito 1. Acqua distillata o demineralizzata sterile, per la diluizione della soluzione di

lavaggio concentrata.2. Carta assorbente.3. Guanti monouso.4. Occhiali di protezione.5. Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.6. Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o

preimpostate per misurare e dispensare da 10 µl a 1000 µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml.

7. Provette per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 ml con tappi a tenuta ermetica, in grado di tollerare una temperatura di 120°C (blocco riscaldante) o 100°C (bagnomaria bollente)• Provettecontappoavite:provetteconicheda1,5ml,Bio-Radrif.224-

0010 o equivalente.OPPURE• Provette con cappuccio di chiusura: EZ Micro Test Tubes, 1,5 ml,

Bio-Rad rif. 223-9480 o equivalente.8.Dispositivi di bloccaggio (VWR rif. 6054001 o equivalente). Questi

dispositivi chiudono ermeticamente le provette con cappuccio di chiusura e impediscono qualsiasi apertura accidentale durante le variazioni di temperatura o di pressione. Una piccola impugnatura permette di togliere la microprovetta dal blocco riscaldante o dal bagnomaria evitando qualsiasi rischio di ustioni.

9. Centrifuga da banco da laboratorio per provette in polipropilene da 1,5 ml in grado di raggiungere 10.000g.

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10.Durantel’utilizzodiunbloccoriscaldanteperiltrattamentodeisieri:• Blocco riscaldante. Si raccomandano i seguenti modelli di blocco

riscaldante: -modellocon1blocco:Grantrif.QBD1(VWRrif.460-0074) -modellocon2blocchi:Grantrif.QBD2(VWRrif.460-0076)• Bloccoperblocco riscaldante: i dueblocchi riscaldanti (QBD1,QBD2)

devono essere utilizzati con il blocco Grant rif. QB-E1 (VWR rif. 460-8517).

Durantel’utilizzodiunbagnomariabollenteperiltrattamentodeisieri:•Supportogalleggianteperprovettedamicrocentrifuga•Bagnomariabollenteconregolazionetermostaticaimpostatasu100°C.

11. Cilindri graduati con capacità di 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1000 ml.12. Contenitore per rifiuti contaminati.13. Agitatore tipo «Vortex».14. Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su

37°C ± 1°C (*).15. Sistema di lavaggio semi-automatico o automatico per micropiastre(*).16. Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 e 620 nm(*).

(*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata, consultare il nostro reparto tecnico.

Trattamento dei campioniIl trattamento del controllo negativo (R0) e del controllo positivo (R5) deve essere effettuato contempo-raneamente al trattamento di tutti i campioni dei pazienti mediante l’aggiunta di 100 µL di soluzione di trattamento R7. I calibratori R3, R4a, R4b, R4c e R4d, che sono pronti per l’uso, non devono essere sottoposti a questo trattamento.1. Distribuire 300 µl di ogni campione da analizzare del controllo negativo

(R0) e del controllo positivo (R5) in provette in polipropilene da 1,5 ml.2. Aggiungere in ogni provetta 100 µl di soluzione di trattamento dei sieri

(R7).3. Omogeneizzare vigorosamente vortexando Chiudere ermeticamente la

provetta per mezzo di un dispositivo di bloccaggio al fine di prevenirne l’apertura accidentale durante il riscaldamento. Non forare il tappo.

4. Blocco riscaldante: Collocare le provette in un blocco riscaldante a 120°C per 6 minuti. Le

provette devono essere collocate nel blocco solamente al raggiungimento della temperatura indicata.(*)

OPPURE

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Bagnomaria: In caso di utilizzo di un bagnomaria: riscaldare le provette per 3 minuti a

100°C.(*)5. Togliere con cura le provette calde dal blocco riscaldante o dal

bagnomaria e collocarle in una centrifuga. Centrifugare le provette a 10.000 g per 10 minuti.

6. Il supernatante viene utilizzato per la rilevazione dell’antigene mannano. Analizzare i supernatanti attenendosi alla seguente procedura. Il test deve essere eseguito entro le due ore successive al trattamento del siero o del plasma.

(*) La stretta osservanza dei valori relativi alla durata e alla temperatura, così come l’utilizzo del materiale raccomandato, sono fattori essenziali per la riuscita del test. È opportuno non fare affidamento sulla temperatura visualizzata dalla strumentazione, ma verificare che la temperatura sia conforme alle specifiche utilizzando una sonda termica che verrà introdotto in una provetta contenente olio minerale: devono essere raggiunti 120°C all’interno della provetta nel blocco riscaldante e 100°C all’interno della provetta nel bagnomaria bollente.

NB : • Tutti i campioni trattati secondo questa procedura possono essere

utilizzati per il test Platelia™ Aspergillus EIA, poiché le procedure di trattamento dei campioni sono identiche per questi due test.

• Non conservare i campioni (controllo negativo, controllo positivo ecampioni) dopo il trattamento.

Procedura EIAAttenersi strettamente al protocollo proposto.Rispettare le buone prassi di laboratorio:• Prima dell’uso, attendere almeno 30 minuti per consentire ai reagenti di

raggiungere la temperatura ambiente (18-30°C).• Adognidosaggio,utilizzaretutti icalibratorieicontrolliperconvalidarei

risultati del test.

Procedere nel modo seguente:1.Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione dei

calibratori, dei controlli e dei campioni, secondo lo schema seguente:- A1: Controllo positivo R5 (supernatante del controllo trattato)- B1: Calibratore 500 pg/ml (R4d)- C1: Calibratore 250 pg/ml (R4c)- D1:Calibratore125pg/ml(R4b)- E1: Calibratore 62,5 pg/ml (R4a)- F1: Calibratore 0 pg/ml (R3)- G1: Controllo negativo R0 (supernatante del controllo trattato)

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2. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall’involucro protettivo. Riporre le strip non utilizzate nell’involucro originario e richiudere con cura l’involucro.

3.Distribuireneipozzetticorrispondenti100 µl di supernatante del campione, del controllo negativo (R0) e del controllo positivo (R5) trattati.

4.Distribuirequindi100 µl di R4d, R4c, R4b, R4a e R3 secondo lo schema della piastra.

NB: A questo stadio della manipolazione può essere controllata la distribuzione della gamma di calibrazione. Infatti, la gamma presenta una tonalità di colore che va dall’arancio (R4d) al giallo chiaro (R3).5. Omogeneizzare il contenuto del flacone R6 capovolgendolo prima

dell’uso. Se si prevede di utilizzare una pipetta multicanale, prelevare solo il volume necessario alla realizzazione del ciclo: utilizzare 2,5 ml per due strip da 8 pozzetti.

6.Distribuireinognipozzetto100 µl di soluzione di coniugato (R6).7. Ricoprire la micropiastra con la pellicola adesiva premendo

adeguatamente su tutta la superficie per assicurarne la tenuta.8. Incubare immediatamente la micropiastra in un incubatore a secco di

micropiastre per 90 ± 10 minuti a 37°C (± 1°C).9. Preparare la soluzione di lavaggio diluita (fare riferimento al capitolo 8).

10. Togliere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto di ogni pozzetto in un contenitore per rifiuti contaminati (contenente ipocloruro di sodio). Lavare la micropiastra 5 volte mediante un sistema di lavaggio per micropiastre (con 800 µl di soluzione di lavaggio diluita). Al termine dell’ultimo lavaggio, capovolgere la micropiastra e picchiettare delicatamente sulla carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso.

11.Distribuire rapidamente inognipozzettoeal riparo dalla luce 200 µl di soluzione di cromogeno TMB (R9).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A R5 S2 S10

B R4d S3 S11

C R4c S4

D R4b S5

E R4a S6

F R3 S7

G R0 S8

H S1 S9

103

12. Incubare la micropiastra al buio a +19-25°C per 30 ± 5 minuti. Non utilizzare la pellicola adesiva durante questa fase di incubazione.

13. Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante (R10) in ogni pozzetto, osservando la stessa sequenza e lo stesso ritmo di distribuzione utilizzati per l’aggiunta della soluzione di sviluppo. Miscelare adeguatamente.

14. Asciugare accuratamente il fondo di ogni piastra.15. Leggere la densità ottica di ogni pozzetto a 450 nm (filtro di riferimento a

620 nm) entro i 30 minuti successivi all’aggiunta della soluzione bloccante (le strip devono sempre essere conservate al riparo dalla luce prima della lettura).

16. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la lettura e il piano di distribuzione delle piastre.

11- CONTROLLO DI QUALITÀ (CRITERI DI VALIDITÀ)Utilizzare i calibratori e i controlli su ogni micropiastra per ciascun saggio. Per la convalida del test, è necessario soddisfare i seguenti criteri:

• Valori della densità ottica:DOR4a>0,280DOR0<DOR4a

• Rapporti:DOR4a/DOR3>1,25DOR4b/DOR4a>1,15DOR4c/DOR4b>1,15DOR4d/DOR4c>1,20

• Concentrazione di mannano nel controllo positivo R5:La concentrazione di R5 deve essere pari alla concentrazione indicata sul flacone ± 30%.

12- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Tracciato della curva di calibrazioneLa curva di calibrazione viene realizzata con i 5 punti gamma (calibratori) 0 pg/ml, 62,5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml e 500 pg/ml.Tracciarelacurvadicalibrazione[DO=funzione(pg/ml)]riportandosull’asseverticale (asse delle Y) le DO dei calibratori R3, R4a, R4b, R4c e R4d, eriportando sull’asse orizzontale (asse delle X) la rispettiva concentrazione di pg/ml.Optare per un tracciato punto per punto che colleghi i vari punti gamma.

104

Determinazione della concentrazione di mannano (pg/ml) dei campioni analizzatiDalla curva precedentemente tracciata, è possibile determinare, per ognicampione analizzato, la concentrazione di mannano, espressa in pg/ml.

Interpretazione dei risultati• I campioni con concentrazioni inferiori a 62,5 pg/ml (C < 62,5) vengono

considerati «negativi» per la presenza dell’ antigene mannano.• I campioni conconcentrazioni comprese tra62,5e125pg/ml (62,5 ≤ C

< 125) vengono considerati «intermedi» per la presenza dell’ antigene mannano.

• I campioni con concentrazioni pari o superiori a 125 pg/ml (C ≥ 125) vengono considerati «positivi» per la presenza dell’ antigene mannano.

• I calibratori utilizzati per il tracciato della curva di calibrazione nonpermettono una titolazione delle concentrazioni superiori a 500 pg/ml.

Per conoscere in modo più preciso la concentrazione dei sieri fortemente positivi, sarà opportuno ripetere il test dopo la prediluizione in rapporto 1:5 del supernatante del campione trattato (nuovo trattamento) con la soluzione di lavaggio (R2) diluita (fare riferimento al capitolo 8) . La concentrazione così ottenuta dovrà essere moltiplicata per un fattore 5.

I risultati «intermedi» potranno essere confermati con un nuovo campione prelevato dal paziente nelle settimane successive alla data del prelievo che ha fornito una concentrazione intermedia.

13- LIMITI DI UTILIZZO1.Un test negativo non può escludere la diagnosi di candidosi invasiva in

quanto i risultati potrebbero essere determinati da una concentrazione estremamente ridotta dell’antigene nel corso dell’infezione e dalla rapida eliminazione del mannano.

La diagnosi di candidosi invasiva può essere stabilita solo dopo avereconfrontato tutti gli aspetti clinici, terapeutici, radiologici, citologici, micologici diretti e sierologici, interpretando con oculatezza ogni elemento a sè stante.

2. La negatività dell’antigenemia deve inoltre essere confrontata con il risultato della ricerca degli anticorpi anti-mannano: anche in caso di candidosi invasiva, l’antigene è più difficilmente rilevabile nei pazienti positivi alla ricerca di anticorpi anti-mannano (fare riferimento al paragrafo 15- Efficacia).

3. L’efficacia della rilevazione del mannano nel siero o plasma è correlata alla frequenza dei test realizzati sui pazienti. Al fine di migliorare la sensibilità e la precocità della positività del test, è auspicabile un follow-up regolare dei pazienti a rischio, così come la ricerca di anticorpi anti-mannano.

105

4. Attenersi alla procedura e all’interpretazione dei risultati descritte per il test Platelia™ Candida Ag Plus quando i campioni vengono analizzati per la presenza dell’antigene mannano. Si consiglia all’utente del kit di leggere attentamente il manuale prima di procedere alla realizzazione del test. In particolare, attenersi scrupolosamente al protocollo indicato per il pipettamento dei campioni e dei reagenti, il lavaggio della micropiastra e la durata delle fasi di incubazione.

5. Un risultato falsamente negativo potrà essere ottenuto qualora i campioni e i reagenti non vengano aggiunti secondo la procedura indicata nel manuale. In caso di sospetta candidosi invasiva o di errore di procedura, dovrà essere analizzato un nuovo campione del medesimo paziente.

6. I pozzetti contenenti campioni di pazienti negativi possono essere contaminati da pozzetti contenenti il controllo positivo, i calibratori o i campioni di pazienti qualora il contenuto di un pozzetto entri accidentalmente in contatto con un altro a causa di una maldestra manipolazione della micropiastra o di un’errata tecnica di pipettamento durante l’aggiunta dei reagenti.

7. L’efficacia di Platelia™ Candida Ag Plus non è stata valutata con campioni di siero o plasma provenienti da neonati o pazienti pediatrici.

8. L’efficacia di Platelia™ Candida Ag Plus non è stata stabilita per una lettura manuale e/o una determinazione visiva dei risultati.

9. Nel corso di uno studio esterno, è stata osservata una reazione crociata nei pazienti sottoposti a perfusione con determinati lotti di liquidi di riempimento, composti da idrossietilamido (tipo Hestéril 6%), utilizzati nel trattamento delle insufficienze circolatorie: ipovolemia, shock emorragico, shock settico.

10. Sono stati osservati risultati falsamente positivi quando i campioni contenevano un tasso di gammaglobuline umane ≥ 60 g/l nonché con alcuni campioni analizzati e risultati positivi alla ricerca di anticorpi anti-Toxoplasma.

14- VALORI ATTESILa prevalenza dell’antigene mannano specifico di Candida misurata mediante il test Platelia™ Candida Ag Plus è stata valutata su un pannello di 613 campioni provenienti da 51 pazienti olandesi (Sito 1 – Paesi Bassi) ospedalizzati per il trattamento di un tumore (emopatia maligna per 49 pazienti e tumore non ematologico per 2 pazienti) mediante chemioterapia intensiva.

106

Su 613 campioni, 88 sono risultati positivi e 51 intermedi, pari ad una prevalenzadi88/613=14,4%[IC95%:11,7-17,4%]considerandonegativii risultati intermedie139/613=22,7%[IC95%:19,4-26,2%]considerandopositivi i risultati intermedi. In termini di pazienti, su 51 analizzati, 23 hanno presentato almeno un campione positivo e 14 hanno presentato almeno un campione intermedio e nessuno positivo, pari ad una prevalenza di 23/51 = 45,1% [IC 95%: 31,1-59,7%] considerando negativi i risultati intermedie 37/51 = 72,6% [IC 95%: 58,3-84,1%] considerando positivi i risultatiintermedi.Su questi 51 pazienti, 30 (388 campioni) non presentano alcuna candidosi invasiva documentata. Tra questi, 20 sono colonizzati da lieviti (12 da Candida albicans, 7 da Candida albicans associato ad un’altra specie di Candida e 1 colonizzato da almeno una specie di Candida non albicans). Quattro di questi pazienti presentano sintomi clinici e un’infezione superficiale da Candida dimostrata microbiologicamente. In 24 di questi pazienti sono presenti gravi danni delle barriere mucose. Sui 388 campioni corrispondenti, 41 sono risultati positivi e 43 intermedi, pari ad una prevalenza di 41/388 = 10,6% [IC 95%: 7,7-14,1%] considerandonegativi i risultati intermedi e 84/388 = 21,7% [IC 95%: 17,7-26,1%]considerando positivi i risultati intermedi. In termini di pazienti, su 30 analizzati, 10 hanno presentato almeno un campione positivo e 11 hanno presentato almeno un campione intermedio e nessuno positivo, pari ad una prevalenza di 10/30 = 33,3% [IC 95%: 17,3-52,8%] considerando negativii risultati intermedi e 21/30 = 70,0% [IC 95%: 50,6-85,3%] considerandopositivi i risultati intermedi.

15- EFFICACIA

A. Studi di riproducibilità •Precisioneintra-saggio(ripetibilità):Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, i cinque campioni positivi (due negativi e tre positivi) sono stati analizzati 32 volte durante lo stesso ciclo. Per ciascun campione è stata determinata la concentrazione di pg/ml. La tabella riportata di seguito fornisce la media delle concentrazioni, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascuncampione:

107

Precisione intra-saggio (ripetibilità)

•Precisioneinter-saggio(riproducibilità):Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, i cinque campioni (due negativi e tre positivi) sono stati analizzati in duplicato, in due cicli al giorno, per un periodo totale di 20 giorni. Per ciascun campione è stata determinata la concentrazione di pg/ml. La tabella riportata di seguito fornisce la media delleconcentrazioni,ladeviazionestandard(DS)eilcoefficientedivariazione(%CV) per ciascun campione:

Precisione inter-saggio (riproducibilità)

N=32Campione negativo

Campione fortemente

negativo

Campione debolmente

positivo

Campione mediamente

positivo

Campione fortemente

positivo

Media delle concentrazioni

(pg/ml)25,1 54,8 63,7 154,1 261,8

DS 4,11 5,20 4,27 8,01 16,93

% CV 16,3% 9,5% 6,7% 5,2% 6,5%

N=80Campione negativo

Campione fortemente

negativo

Campione debolmente

positivo

Campione mediamente

positivo

Campione fortemente

positivo

Media delle concentrazioni

(pg/ml)24,1 55,0 70,0 161,6 264,9

DS 6,99 11,47 14,50 30,07 38,62

% CV 29,0% 20,8% 20,7% 18,6% 14,6%

108

B. Reattività crociata

C. LinearitàIl range di linearità del test Platelia™ Candida Ag Plus è stato stabilito tra 20 e 470 pg /ml sulla base di studi su diluizioni condotti su 4 campioni positivi.

D. Studi cliniciL’efficacia del kit Platelia™ Candida Ag Plus è stata valutata in 3 siti con un totale di 852 campioni provenienti da 505 pazienti.

SENSIBILITÀ La sensibilità del kit Platelia™ Candida Ag Plus è stata determinata su un pannello di 436 campioni provenienti da 89 pazienti ospedalizzati in 2 siti situati nei Paesi Bassi e in Francia. La ripartizione dei campioni è la seguente: • Sito 1 (Paesi Bassi): 225 campioni provenienti da 21 pazienti olandesi

ammessi in un reparto di oncoematologia per il trattamento di un’emopatia maligna (19 casi) o di un tumore non ematologico (2 casi) mediante chemioterapia intensiva, seguita, a seconda dei casi, da un innesto di cellule staminali ematopoietiche. Tutti questi pazienti hanno presentato una candidosi invasiva microbiologicamente dimostrata sulla base di almeno una coltura positiva a Candida (emocoltura o coltura di prelievo tissulare normalmente sterile). 17

• Sito 2 (Francia): 211 campioni provenienti da 68 pazienti francesiospedalizzati in vari reparti di rianimazione o di oncoematologia e aventi una candidosi invasiva microbiologicamente dimostrata sulla base di almeno una emocoltura positiva a Candida spp.

NB: I pannelli di campioni utilizzati nel corso di questi due studi provengono da pazienti i cui campioni sanguigni sono stati prelevati tra il 1999 e il 2007. La stabilità relativa dell’antigene mannano e dell’anticorpo anti-mannano in questi campioni durante il periodo di congelamento, nonché al termine

PatologiaNumero di campioni

analizzatiPositivi Intermedi

Aspergillus 10 0 1

Anticorpi anti-ds-ADN 10 0 0

ANA positivi 10 0 0

IgG e IgM Mieloma 20 0 1

IgG anti-Toxoplasma 10 3 1

Anticorpi umani anti-topo

10 0 0

Fattore reumatoide 10 0 0

109

di ogni ciclo di congelamento e scongelamento, rende i risultati presentati dipendenti dalle condizioni di conservazione del pannello analizzato. I valori di sensibilità del test determinati nell’ambito di studi clinici retrospettivi possono quindi essere inferiori a quelli ottenuti nel corso di studi clinici prospettici, realizzati su campioni prelevati in tempi più recenti.

Risultati del Sito 1I 21 pazienti olandesi inclusi in questo studio sono stati ammessi in ospedale per il trattamento di un’emopatia maligna (leucemia mieloblastica acuta, leucemia linfoblastica acuta, leucemia linfoide cronica, mieloma, sindrome mielodisplasica, anemia aplasica o linfoma non Hodgkin) o di un tumore non ematologico mediante chemioterapia intensiva seguita eventualmente da un innesto di cellule staminali ematopoietiche 17. Questi 21 pazienti hanno sviluppato una candidosi invasiva microbiologicamente dimostrata sulla base di almeno una coltura positiva a Candida spp. (emocoltura o coltura di prelievo tissulare normalmente sterile). Lo stato di questi pazienti, per la presenza dell’antigene mannano specifico di Candida, rilevato con il test Platelia™ Candida Ag Plus, viene considerato positivo se almeno uno dei campioni del paziente è positivo. In assenza di campione positivo, lo stato viene considerato intermedio se almeno uno dei campioni del paziente è intermedio e negativo quando tutti i campioni del paziente sono negativi. 17

Parallelamente al test Platelia™ Candida Ag Plus, questi stessi campioni sono stati analizzati per la presenza di anticorpi anti-mannano con il kit Platelia™ Candida Ab Plus 9. Lo stato del paziente per la presenza dell’antigene mannano o di anticorpi anti-mannano specifici di Candida viene considerato positivo se almeno uno dei due test è positivo. In assenza di test positivo, lo stato viene considerato intermedio se almeno uno dei due test è intermedio e negativo quando entrambi i test sono negativi.

Categorie di pazienti

Risultati con Platelia™ Candida Ag Plus

Numero di pazienti (numero di campioni)

Sensibilità (intermedi considerati

negativi)


positivi)21 pazienti (225 campioni) presentanti almeno una coltura

positiva a Candida spp.

Positivo Intermedio Negativo

13 (47) 3 (8) 5 (170) 61,9 % 95%IC[38,4-81,9%]

76,2 % 95%IC[52,8-91,8%]


Combinazione dei risultati con Platelia™ Candida Ag Plus e Platelia™ Candida Ab Plus



negativi)


positivi)21 pazienti (225 campioni) presentanti almeno una coltura

positiva a Candida spp.

Positivo Intermedio Negativo

15 (98) 4 (34) 2 (93) 71,4 % 95%IC[47,8-88,7%]

90,5 % 95%IC[69,6-98,8%]

110

Risultati del Sito 2I 68 pazienti francesi inclusi in questo studio sono stati ammessi in vari reparti di rianimazione (chirurgia, trapianto, ustioni, traumatologia, pneumologia, ecc.) o di oncoematologia (emopatia maligna). Tutti hanno sviluppato una candidosi invasiva microbiologicamente dimostrata sulla base di almeno un’emocoltura positiva a Candida (albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei o tropicalis) 6, 7, 14 nei giorni precedenti o successivi il prelievo sanguigno studiato. I campioni di sangue sono stati prelevati in media 6 giorni dopo la prima emocoltura positiva a Candida (minimo 61 giorni prima, massimo 67 giorni dopo). Lo stato di questi pazienti per la presenza dell’antigene mannano specifico di Candida, rilevato con il test Platelia™ Candida Ag Plus, viene considerato positivo se almeno uno dei campioni del paziente è positivo. In assenza di campione positivo, lo stato viene considerato intermedio se almeno uno dei campioni del paziente è intermedio e negativo se tutti i campioni del paziente sono negativi.

* : L’intervallo di confidenza del 95% non ha potuto essere calcolato a causa delle dimensioni insufficienti dei campioni.





negativi)


positivi)Positivo Intermedio Negativo

68 pazienti (211 campioni) presentanti almeno un’emocoltura

positiva a Candida spp.35 (86) 7 (14) 26 (111) 51,5%

95%IC[39,0-63,8%]61,8%

95%IC[49,2-73,3%]

- di cui 34 a C. albicans (113 campioni)

22 (55) 6 (12) 6 (46) 64,7% 95%IC[46,5-80,3%]

82,5% 95%IC[65,5-93,2%]

- di cui 15 a C. parapsilosis (37 campioni)

2 (3) 1 (1) 12 (33) 13,3% 95%IC[1,7-40,5%]

20,0% 95%IC[4,3-48,1%]

- di cui 12 a C. glabrata (32 campioni)

7 (13) 0 (0) 5 (19) 58,3% 95%IC[27,7-84,8%]

66,7% 95%IC[34,9-90,1%]

- di cui 4 a C. tropicalis (19 campioni)

4 (15) 0 (1) 0 (3) 100,0% * 100,0% *

- di cui 2 a C. krusei (8 campioni) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% *

- di cui 1 a C. norvegensis (2 campioni)

0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% *

111

Parallelamente al test Platelia™ Candida Ag Plus, questi stessi campioni sono stati analizzati per la presenza di anticorpi anti-mannano con il kit Platelia™ Candida Ab Plus 9. Lo stato del paziente per la presenza dell’antigene mannano o di anticorpi anti-mannano specifici di Candida viene considerato positivo se almeno uno dei due test è positivo. In assenza di test positivo, lo stato viene considerato intermedio se almeno uno dei due test è intermedio e negativo quando entrambi i test sono negativi.

*: L’intervallo di confidenza del 95% non ha potuto essere calcolato a causa delle dimensioni insufficienti dei campioni.

SPECIFICITÀLa specificità è stata determinata su un pannello di 416 campioni, provenienti da 2 siti situati in Francia, suddivisi nel modo seguente: • Sito 1: 200 campioni provenienti da 200 pazienti francesi sottoposte a

monitoraggio sierologico della toxoplasmosi durante le loro gravidanze e non presentanti alcun sintomo clinico d’infezione da Candida.

• Sito 2: 216 campioni provenienti da 216 pazienti francesi donatori disangue.


Combinazione dei risultati con Platelia™ Candida Ag Plus e Platelia™ Candida Ab Plus



negativi)


positivi)Positivo Intermedio Negativo

68 pazienti (211 campioni) presentanti almeno un’emocoltura

positiva a Candida spp.48 (122) 8 (40) 12 (49) 70,6%

95%IC[58,3-81,0%]82,4%

95%IC[71,2-90,5%]

- di cui 34 a C. albicans (113 campioni)

28 (74) 2 (22) 4 (17) 82,4% 95%IC[65,5-93,2%]

88,2% 95%IC[72,6-96,7%]

- di cui 15 a C. parapsilosis (37 campioni)

5 (7) 6 (15) 4 (15) 33,3% 95%IC[11,8-61,6%]

73,3% 95%IC[44,9-92,2%]

- di cui 12 a C. glabrata (32 campioni)

11 (24) 0 (3) 1 (5) 91,7% 95%IC[61,5-99,8%]

91,7% 95%IC[61,5-99,8%]

- di cui 4 a C. tropicalis (19 campioni)

4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0% * 100,0% *

- di cui 2 a C. krusei (8 campioni) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% *

- di cui 1 a C. norvegensis (2 campioni)

0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% *

112

16- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORETutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società Bio-Rad sono preparati conformemente ad un Sistema di qualità dal ricevimento delle materie prime fino alla commercializzazione dei prodotti finali. Ogni lotto è sottopostoaduncontrollodiqualitàepuòesserecommercializzatosoloseconforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La documentazione relativa alla produzione e al controllo di ogni singolo lotto è conservata dal produttore.




Specificità (intermedi considerati

positivi)

Specificità (intermedi considerati

negativi)Positivo Intermedio Negativo

200 donne incinte (200 campioni) sottoposte a monitoraggio

sierologico della toxoplasmosi3 2 195 97,5%

95%IC[94,3-99,2%]98,5%

95%IC[95,7-99,7%]

216 donatori di sangue (216 campioni)

1 1 214 99,1% 95%IC[96,7-99,9%]

99,5% 95%IC[97,5-100%]

17- BIBLIOGRAPHY1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U. 2007. Comparative evaluation of

(1,3)-beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candida species-specific snPCR in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103): p. 1-9.

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4- Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U. 2009. Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candida infections in patients with neutropenic fever. Journal of Medical Microbiology 58(5): p. 606-615.

5- Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M., Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J. 2009. Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p. 55-62.

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8- Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F., Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D. 2009. Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p. 503-535.

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10- Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O. 2005. Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and anti-mannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p. 95-101.

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15- Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R. 2004. Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p. 317-322.

16- Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E. 2009. Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p. 289-292.

17- Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E. 2009. Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p. 380-386.

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