DIAGNOSTICA MOLECOLARE: identificazione di mutazioni nel menoma mediante l’analisi di

dna o rna. Vengono ricercate malattie genetiche ereditarie o acquisite, gnomiche o mitocondriali,

poligeniche, multifattoriali o mendeliane.

- DNA nucleare 2,91 x 10^9 bp; 4% sono esoni, 21% sono introni; i geni sono 80000; le regioni

intergeniche sono il 75%

il 7 % del genoma è specifico umano, mentre la restante parte è omologo a quello di altre specie.

Esistono nel genoma dei cluster:

- geni per RNA organizzati in tandem

- geni fisicamente separati, con pseudogeni, ma regolati da un’unica regione (alfa e beta

globulina)

- cluster composti: geni non correlati (sul cluster hla c’è anche la 21 idrossilasi)

esistono poi geni all’interno di altri geni (negli introni); esistono preudogeni: copie non funzionali

di geni che derivano da duplicazioni. Si suddividono in NON PROCESSATI (tutta la sequenza): in

questo caso possono essere funzionali o meno, e PROCESSATI (derivati da integrazione di cDNA

nel genoma): anch’essi possono essere funzionali o no (sequenze Alu).

- DNA mitocondriale: 16,6 kb, 33 geni; 2 geni x rRNA, 22 geni x tRNA, 13 geni x proteine della

fosforilazione ossidativi.

DIAGNOSI MOLECOLARE

Si esegue su dna, rna o proteine estratti da sangue, tessuti, amniociti o villi coriali.

Talvolta sul materiale genetico estratto da sangue è possibile studiare anche trascritti tessuto

specifici illegittimamente presenti anche in circolo, anche se il loro processing non è

necessariamente uguale a quello subìto nel tessuto.

Per fare diagnosi molecolare si esegue innanzitutto una consulenza genetica, si informa il paziente

dei rischi implicati nella propria riproduzione e nello sviluppare malattie genetiche. Al paziente

viene richiesta l’anamnesi e la storia familiare per costruire se è possibile un albero genealogico.

Molto importante è la diagnosi prenatale, che si può eseguire in prima istanza sul sangue materno

andando a dosare hCG, AFP e VE3 (estriolo no coniugato).

AFP VE3 hCG

Trisomia 21 ↓ ↓ ↑

Trisomia 18 ↓ ↓ ↓

Tecniche per diagnosi prenatali:

- anomalie cromosomiche: cellule fetali vitali

- livelli ormonali o enzimi: cellule o fluidi

- mutazioni puntiformi: DNA

AMNIOCENTESI

Liquido amniotico prelevato con un ago. Da questo campione si ricava liquido (20-30 ml) usato per

indagini biochimiche, cellule per indagini citogenetiche e o molecolari. C’è una percentuale di

rischio aborto (0,5%). Quando è necessaria una quantità > di DNA si tengono gli amniociti in

coltura.

VILLOCENTESI

Tessuto dal coron (placenta fetale); si fa x via transcervicale o transaddominale a seconda di dove si

trova la placenta. Si fa in 10-12 settimana, le cellule vengono usate per indagini citogenetiche o

molecolari; è importante la pulizia dei villi: si fa manualmente al microscopio per evitare

contaminazioni dalla madre. Il rischio di aborto con questa metodica è 1%; tuttavia si preferisce

questa metodica all’amniocentesi quando il rischio di patologie è più alto.

FUNICOLOCENTESI

Condocentesi: 19-21 settimane dall’ultima mestruazione; diagnosi in tempi rapidi; rischio aborto 2-

3%.

DIAGNOSI PREIMPIANTO

Viene eseguita su una singola cellula da un blastomero di 6-10 cellule ottenuto mediante

fecondazione in vitro. Può essere eseguita anche sui corpi polari (prodotto della prima divisione

mitotica nella oogenesi quando i cromosomi materni e paterni sono separati). Solitamente si fa PCR

e FISH.

Tecnologie emergenti mirano a isolare cellule o dna fetali dal sangue materno, dal momento che

quest’ultimo ha una breve emivita e quindi non c’è il rischio di confusione con gravidanze

precedenti.

TECNICHE CITOGENETICHE

Studiano le caratteristiche dei cromatidi, visti al microscopio e trattati con varie procedure.

MUTAZIONI GENICHE

Le mutazioni geniche , come dice la parola stessa, si verificano all’interno di un gene e possono

essere di varia natura: mutazioni puntiformi(a livello del singolo nt), traslocazioni (tipo cromosoma

Philadelfia), duplicazioni, delezioni . Le tecniche diagnostiche utilizzate per individuare queste

mutazioni, che sono causa di malattie, possono essere analisi di citogenetica(tra cui la FISH),

southern blot , PCR e altre ancora.

Per una maggiore chiarezza suddividiamo le mutazioni geniche in due gruppi ed analizziamo le

tecniche usate nell’uno e nell’altro gruppo.

Il primo gruppo comprende le DELEZIONI o le DUPLICAZIONI. Questo tipo di mutazioni

possono coinvolgere l’intero gene , gruppi di nt(inframe o outframe), uno o più esoni di un gene.

L’approccio diagnostico può essere DIRETTO, nel caso in cui sappiamo quali sono i geni o parte di

essi che vengono maggiormente interessati da quel tipo di mutazione e le andiamo a trovare

direttamente tramite analisi di southern blot e PCR quantitativi.(il gold standard per l’analisi

molecolare diretta è il sequenziamento del gene).Altro approccio è quello INDIRETTO(analisi di

linkage )al quale si ricorre spesso, ma non sempre, per lo studio delle malattie ereditarie non note.

La scelta di un sauthern o di una PCR quantitativa scaturisce dal fatto che in moltissimi casi è

necessaria una quantizzazione del materiale genetico, ad esempio nel caso di mutazioni nelle donne,

soprattutto per i geni sull’X, viene sempre effettuata perché sappiamo che la donna va incontro ad

un fenomeno di in attivazione dell’X casuale e la quantizzazione può aiutarci a capire quanto di

quel gene mutato è ancora funzionale. Una quantizzazione la possiamo fare anche nel caso di

duplicazioni a carico di geni che mappano sull’X, negli uomini ecc. Il secondo gruppo comprende

le mutazioni puntiformi(con esse comprendiamo anche le mutazioni che modificano siti di splicing

ecc.), in questi caso vengoo utilizzate altri tipi di tecniche diverse dal southern e dalla PCR il cui

utilizzo però non si esclude completamente.

Detto questo possiamo analizzare le tecniche singolarmente.

SOUTHERN BLOT QUANTITATIVO

Prima di tutto bisogna dire che in qualsiasi caso, qualsiasi tecnica stiamo utilizzando è sempre

necessario un controllo che sia interno o esterno non importa l’importante è che ci sia, tale controllo

o standard diventa fondamentale nel caso di una quantizzazione perché ci servirà come riferimento,

inoltre ci vuole anche un normalizzatore che ci consenta di essere sicuri che abbiamo la stessa

quantità di campione di partenza per ogni campione.

Quindi quando allestiamo un southern abbiamo bisogno di una sonda che ibridizzi con il target di

cui vogliamo attestare la presenza e non solo , ma vogliamo anche quantizzarlo, ed una sonda che

ibridizzi con un gene che sia egualmente espresso in tutte le cellule , che sia costante e non soggetto

a mutazioni(ex la β-tubulina).la figura riassume tutte le fasi salienti di un southern.

Una volta trasportato il contenuto del gel sul filtro del suothern avremo che tutte le bande del gel

sono passate sul filtro dove faremmo avvenire la reazione di ibridazione. Dopo la ibridizzazione

andremo ad effettuare una lettura densitometrica delle bande dei soggetti in esame, del controllo e

del normalizzatore.

Fatta la lettura, otterremo dei valori relativi ai controlli e ai campioni che avremo normalizzato. Per

sapere di quanto varia la dose genica del soggetto analizzato rispetto al o ai controlli usati dobbiamo

fare un semplice rapporto tra il valore ottenuto dal campione normalizzato fratto la media tra i

valori normalizzati ottenuti dai 2 controlli(se usiamo due controlli ovviamente).

Ex la lettura densitometrica del campione 1 ci dà 0,72, i due controlli ci danno 0,5 e 0,4 la media

è0,45. Facciamo il rapporto tra 0,72/0,45 =1,6. 1,6 rispetto ad una dose genica (che in un soggetto

normale è doppia , dato che per ogni gene abbiamo sempre due copie) pari ad 1 avrà una copia di

quello stesso gene in più(se 1 indica normale dose genica cioè 2 copie dello stesso gene 1,6

indicherà una copia in più e così via) . Tale quantizzazione è RELATIVA , infatti noi valutiamo la

dose genica di un paziente in relazione a quella di un soggetto che noi sappiamo essere un soggetto

normale con dose genica nota. Possiamo anche effettuare una quantizzazione ASSOLUTA se

creiamo una retta con varie concentrazioni di DNA ed estrapoliamo dalla retta il valore di

concentrazione del DNA del soggetto in esame.

densitometro

PCR QUANTITATIVA

Di PCR credo che tutti ne abbiamo la pancia e la testa piena ma cmq ci tocca riascoltare sempre le

stesse cose. Quindi cerchiamo di farle bene.

La PCR quantitativa si basa sul principio di una normalissima PCR solo che precedentemente

facciamo una serie di prove per vedere quale ciclo della PCR rappresenta la fase log cioè la fase di

crescita esponenziale del numero di amplificato. Una volta fatte queste innumerevoli prove sapremo

perfettamente quando stoppare la nostra PCR. Ma perché stoppare la PCR in fase log? Perché ,

prima di tutto sappiamo che la PCR ha una sua cinetica, nel senso che con l’avanzare dei cicli

avremo una variazione nella quantità di DNA di partenza che come volume è uguale per tutti i

campioni(generalmente si mette 1μL di DNA di ogni i campioni, ma non sappiamo in quel micro

litro quanto DNA effettivamente c’è come concentrazione), la quantità di DNA che sarà

ovviamente amplificata aumenterà con l’aumentare dei cicli fino a raggiungere una fase di plateau

dove, pur continuando con i cicli non ci darà altre copie di DNA . Ciò si verifica perché magari

sono finiti i primers, la Taq non funziona più bene, sono finiti i dNTPs ecc.

Se considerassimo la fase di palteau non vedremmo nessuna differenza tra un campione e l’altro o

cmq sarebbero poco apprezzabili, se invece la PCR la stoppiamo alla fase log avremo copie di

DNA in più in quei campioni che partivano da una concentrazioni maggiore e viceversa.(logico

no?)Anche la PCR prevede dei controlli interni e controlli esterni. I controlli interni sono utili per

valutare la dose genica di un soggetto relativamente a quella di un gene che è costante nella sua

espressione e validato sperimentalmente(la solita β-actina),, questo controllo viene amplificato nello

stesso tubino di reazione usando una diversa coppia di oligont. Il controllo esterno , amplificato in

una reazione parallela , effettuata con le stesse condizioni e contemporaneamente, viene usato come

parametro per la quantizzazione assoluta. E’ necessario, come sempre, un normalizzatore che mi

indichi che la reazione di amplificazione stia procedendo bene (il normalizzatore potrebbe fungere

sia da normalizzatore che da controllo interno tranquillamente). Introduciamo , quindi, una coppia

di oligont che amplifichi una regione differente del gene target, deve essere una regione che non sia

soggetta a mutazioni e compagnia cantante. Nel caso del famosissimo gene della distrofina , come

normalizzatore viene usato l’esone 10 che codifica per una piruvato chinasi (PK), tale esone sta su

un autosoma quindi sarà perfetto sia se il paziente è una donna sia se è un uomo.

I prodotto di PCR devono essere separati con opportune tecniche di separazione che possono essere

rese più efficienti e veloci se marchiamo uno dei due primers con un fluorocromo(tecnica che viene

usata soprattutto nella separazione dei prodotti di multiplex PCR), anche i controlli sono marcati

con dei fluorocromi, che sono differenti da quelli dei campioni per distinguerli, vuoi che la ciorta fa

che un campione co-migri col controllo , noi ce ne freghiamo perché il fuolcroomo è differente e li

possiamo differenziare tra loro . Andiamo poi a quantificare la bande ed avremo dei valori per i

singoli soggetti e per i controlli(sia i campioni che i controlli devono essere normalizzati).

Rx= valore del picco dell’esone da quantizzare nel paziente/picco della PK nel paziente

Rc= valore del picco dell’esone da quantizzare nel controllo/picco della PK nel controllo

ID(indice diagnostico)= Rx/Rc

Normali con rapporto uguale a 1 Normali con rapporto di 0,55

Deleta con rapporto pari a 0,55 Deleto con rapporto pari a 0

Duplicate con rapporto pari a 1,5 Duplicato con rapporto di 1

Preciso che questi valori sono quelli di riferimento che si ottengono in patologie X-linked perché

per mutazioni autosomiche dovremmo avere valori uguali indipendentemente se si tratta di un uomo

o di una donna. Le tecniche di separazione sono anch’esse molto variegate, dalla classica

elettroforesi su gel d’agarosio(in cui il Dna migra essenzialmente in base alla massa, al PM .Infatti

per individuare il nostro frammento tra tanti usiamo un marker di PM che facciamo correre in un

pozzetto accanto ai campioni) alla più precisa e sofisticata elettroforesi capillare su gel.

Ma vediamola più nel dettaglio.

Elettroforesi capillare

Non è difficile intuire che questo tipo di elettroforesi avviene all’interno di un capillare dove il

rapporto volume/superficie è tale da favorire la dissipazione del calore quindi si può effettuare

anche ad alti voltaggi(essendo capillari molto sottili e molto lunghi il calore viene dissipato lungo

tutta la lunghezza del capillare).

Tramite l’elttroforesi capillare è possibile diagnosticare anche piccole delelzioni, a carico del

singolo nt perché ogni frammento, in base alla sua lunghezza, avrà un suo tempo di eluzione, ed in

base a quello possiamo fare diagnosi(anche se parziale , ci possono essere casi in cui quella piccola

variazione di tempo non è significativa di malattia, dipende).

La figura rappresenta il classico apparecchio elettroforetico(nella realtà è tutto molto più

coreografico). Ci sono 2 vaschette una contiene l’elettrodo positivo, l’altra quello negativo. Il

capillare va da una vaschetta all’altra e quando applichiamo la differenza di potenziale il tampone

va da una parte all’altra trascinando con sé il campione, che avremo precedentemente caricato nel

capillare, separandolo. Cosa molto sorprendente il rivelatore è posto verso il polo negativo. Questa

immagine mette alla prova l’esame di biochimica generale e le nostre conoscenze, ci chiediamo ma

il DNA non è negativo? Ma mi ricordo bene che migra verso il polo positivo? Se viaggia verso il

polo positivo, il rivelatore, per logica, non dovrebbe stare al polo positivo? Non vi preoccupate il

vostro voto di biochimica è salvo, il DNA è per noto un polianione e migra verso il polo positivo

però il capillare è rivestito da gruppi SiOH(definiti silanonici) che sono carichi negativamente ,

queste cariche negative si liberano quando il pH>4. una volta libere queste cariche saranno attratte

dalle cariche positive e attrarranno cariche positive, presenti nel tampone, creando un flusso di

corrente elletroendosmotica dotato di una forza tale da vincere la naturale attrazione del DNA verso

l’anodo e sarà trasportato di peso verso il polo negativo(catodo). Però nonostante questo flusso di

corrente, il DNA sarà sempre attirato dall’anodo e quindi sarà frenato nella sua corsa, e sarà frenato

proporzionalmente alla carica che porta ed anche , in misura però quasi irrilevante , dalla massa.

L’elettroforesi che utilizziamo generalmente in laboratorio però non è come questa analizzata ma

leggermente differente. La struttura è del tutto simile, ma aiutiamoci con una immagine.

Vediamo sempre due vaschette con due elettrodi , uno positivo e l’altro negativo. Il capillare è

immerso nelle due vaschette della cameretta elettroforetica, la prima differenza che notiamo è la

disposizione del rivelatore. Questo infatti è posto verso l’anodo(polo positivo), questo ci indica che

il campione viaggerà verso il polo positivo, in linea con le nostre conoscenze, il DNA è negativo e

migra verso il polo positivo in base al rapporto carica/massa. Questo si verifica perché il tubicino

capillare è rivestito di una guaina che isola i gruppi SiOH che generavano il flusso

elettroendosmotico forzando la migrazione del DNA verso il polo negativo. In assenza di questi

gruppi , il flusso non si crea e quindi il DNA è libero di migrare in base alla carica.

Questo particolare tipo di elettroforesi capillare prende il nome di elettroforesi capillare su gel.

Conserva il vantaggio di usare alti voltaggi con un’ottima efficienza di separazione.

La fase principale della elettroforesi capillare è il caricamento del capillare. Il capillare può

avvenire in diversi modi:

Applicando pressione ad una della estremità del capillare

Con il vuoto

Effetto sifone

Elettrocinetico. E’ il metodo che abbiamo analizzato più nel dettaglio. Il capillare viene

immerso in una cameretta contenente il campione e viene applicata una differenza di

potenziale , per un determinato tempo(dipende dalla quantità di campione che vogliamo

caricare), dopo di cui prendiamo il capillare e lo immergiamo nel tampone, in questo modo

quando applicheremo la differenza di potenziale il tampone, migrando ,trascinerà con sé

anche il campione caricato.

Quello ke si ottiene è un diagramma con diversi picchi ke rappresentano gli spettri di emissione dei

campioni marcati con specifici fluorocromi.

Il metodo deve essere standardizzato facendo correre con il campione, ma marcato con un

fluorocromo differente , un marker di peso molecolare. Il diagramma può essere convertito in un

grafico logaritmico in cui sull’asse delle ascisse abbiamo la corsa dei campioni in cm e sulle

ordinate il log del pm. I due parametri sono inversamente proporzionali (come possiamo vedere dal

grafico).

Pm

corsa in cm

MAPH(multiple amplifiable probe hybridization)

L’amplificazione viene preceduta dall’ibridazione con delle sonde che vengono sintetizzate in

modo tale da avere la stessa sequenza al 3’e al 5’. Ci sono due modi per ottenere queste sonde:

Preparare le sonde che ibridizzino con tutti i singoli esoni di un gene(ex nel caso del gene

della distrofina prepariamo 79 sonde), di lunghezza differente. Le sonde vengono clonate in

un plasmide(79 plasimdi tutti uguali) , al clonaggio segue l’escissione della sonda

utilizzando opportuni enzimi di restrizione(uguali per tutti i plasmidi clonati) che taglino un

po’ a monte e un po’ a valle della nostra sonda in modo da avere stessa sequenza in tutte le

sonde per amplificare con la stessa coppia i oligont.

Amplifichiamo la sonda usando dei primers che al 3’e al 5’ presentano una appendice , in

modo tale da poter ottenere delle sonde di differente lunghezza con una eguale sequenza al

3’ e 5’ A questo punto deve avvenire la reazione di ibridazione sonda /DNA(è una

interazione tra catene di nt), per fare questo spottiamo il campione di DNA sul filtro di

nylon e dopo aggiungiamo la sonda che andrà a legarsi dove è presente il corrispettivo

esone. Dopo una notte di incubazione provvediamo con una serie di lavaggi molto stringenti

per eliminare tutto quello che non ha avuto modo di legarsi e posizioniamo il filtro in un

tubino insieme con la mix della PCR, all’interno posizioneremo come primers una sola

coppia,(praticamente un solo oligont perché le due estremità sono uguali) che amplificherà ,

in un numero ridotto di cicli, la sonda che si era legata e che ora si è staccata dal filtro

durante la reazione di PCR.

Quando i cicli impostati terminano

preleviamo una aliquota del

prodotto di PCR e la mettiamo in

un altro tubino dove allestiremo

una normale PCR quantitativa che

fermeremo in fase log, metteremo

tutti i reagenti per la PCR ed uno

dei due primers sarà marcato in

modo da seguire la corsa

elettroforetica e per distinguere i

campioni dal marcatore di peso

molecolare che sarà marcato con

un fluorocromo differente.

Dalla MAPH si è evoluta un’altra tecnica : la MLPA

MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)

Anche la MLPA prevede l’ibridazione con sonde di oligont che vengono costruite a partire da due

frammenti di oligont che poi formeranno la sonda completa:

Porzione breve con una sequenza al 5’ uguale per tutte le sonde ed una sequenza specifica

per ogni sonda(dove quindi suppongo risieda la omologia con l’esone che dovrà legare);

Porzione lunga formata da una sequenza uguale per tutte le sonde, posizionata a 3’, una

sequenza specifica per ogni sonda ed una sequenza stuffer, che vari nella sua lunghezza da

sonda a sonda in modo da distinguerle.

Le due porzioni di oligont vengono fatti ibridare con il DNA, posto sempre sul filtro. Le due

porzioni sono fatte in modo tale da legarsi in posizione vicine, adiacenti. Alla ibridizzazione segue

l’azione dell’enzima LIGASI che lega le due estremità (estremità 3’ della sonda breve con quella 5’

della sonda lunga). La sonda , in modo del tutto analogo alla MAPH viene amplificata con la stessa

coppia di oligont innesco di cui uno è marcato. Il prodotto di amplificazione potrà essere separato in

vario modo e i frammenti sono distinguibili dato che avranno lunghezza differente.(si può

analizzare tutto il gene della distrofina, ma 79 esoni sono tanti e quindi si preferisce allestire due

reazioni differenti, infatti la tecnica conserva tutte le sue caratteristiche se si analizzano, al massimo

40 sequenze contemporaneamente ). Un piccolo inconveniente è legato al fatto che la presenza di

una mutazione puntiforme o un polimorfismo possono essere erroneamente scambiate per una

delezione esonica . Nel caso in cui ci fosse una mutazione puntiforme o un polimorfismo nel punto

in cui vanno ad appaiarsi una delle due estremità della sonda(nel punto in cui la ligasi va ad agire)

la ligasi non potrà agire e quindi non avremo amplificazione della sonda. Se non abbiamo

l’amplificazione non avremo banda e quindi faremo diagnosi di delezione esonica, ma non è questo

il caso quindi dobbiamo fare molta attenzione. Basta fare un semplice ragionamento: se troviamo

una sola delezione in tutto il gene , andiamo a fare una analisi più attenta perché potrebbe trattarsi di

una mutazione puntiforme o di un polimorfismo, se troviamo più esoni interessati possiamo essere

quasi sicuri che si tratti di una delezione.

La MLPA viene usata per la diagnosi di delezioni ed inserzioni, per anomalie cromosomiche, ed

anche per valutare lo stato di attivazione e silenziamento genico per la presenza di isole metilate.

Basta far denaturare il campione di DNA e poi far seguire la ibridizzazione con le due porzioni

della sonda che vengono legate per azione della ligasi. Effettuiamo una digestione con un enzima di

restrizione che non taglia in presenza di CH3 . Se si ha digestione questo vuol dire che non c’è

metilazione se non c’è digestione vuol dire che il filamento con cui la sonda si è appaiata è metilato.

Verrà amplificato tutto quello che non è metilato, perché se la sonda viene tagliata non potrà essere

amplificata se la sonda viene amplificata vuol dire che la digestione non è avvenuta.

Per effettuare una quantizzazione relativa si quantizzano le sonde amplificate rispetto ai controlli:

RPA (Relative Peak Area): area del picco/area del controllo interno (si usano 5 controlli interni)

RPA 100%: media di RPA di 3 controlli esterni di soggetti senza mutazioni

RPA ratio: RPApaziente/ RPA100%

MASCHIO: assenza di picco=0 copie=delezione; RPA ratio 90-110%=1 copia=normale; RPA ratio

150-250%=2 copie=duplicazione

FEMMINA: RPA ratio 35-55%=1 copia=delezione; RPA ratio 90-100%=2 copie=normale; RPA

ratio 150-250%=3 copie=duplicazione

Vantaggi MLPA:

Possono essere determinate ben 45 regioni esoniche in un solo tubino di reazione e con una

sola corsa;

Bastano solo 20ng di genomico;

Risultati in 24 ore;

Costa meno di 15 euro per reazione;

Discrimina anche sequenze che differiscono per un nt

Svantaggi:

La qualità del campione dev’essere buona, per cui per campioni derivati da liquido

amniotico conviene usare i lisati cellulari per ottenere il Dna da analizzare.

PCR TOUCH AND DAWN

Protocollo secondo il quale solo se c’è un match del 100% si ha amplificazione. Si parte da una

temperatura di 4-5° C in più rispetto alla temperatura ottimale di reazione e ad ogni ciclo

abbassiamo la temperatura di 0,5°C . Così facendo avremo che la temperatura di annealing dei

primi cicli, essendo abbastanza alta (generalmente è di 4-5 gradi al di sotto della Tm) sarà

favorevole solo ad appaiamenti perfetti, poi abbassandola nei cicli successivi faciliteremo

l’amplificazione di ciò che è stato amplificato nei primi cicli, molto stringenti.

Le tecniche che abbiamo visto ci consentono di effettuare una quantizzazione relativa perché

abbiamo sempre confrontato la sequenza in esame con una sequenza costante e non soggetta a

mutazioni. Ma è possibile anche effettuare una quantizzazione assoluta.

QUANTIZZAZIONE ASSOLUTA

Avere un controllo è fondamentale, senza controllo non possiamo ottenere delle quantizzazioni,

perché manca un riferimento. Il controllo è utile, inoltre, per valutare che la reazione proceda nel

migliore dei modi.

Possiamo avere quindi un controllo interno o esterno per quantizzare

CONTROLLO ESTERNO

Possiamo ottenere un controllo da RNA o da DNA, spiegheremo quello ottenuto da RNA perché è

più difficile , quello da DNA è molto più semplice.

Partendo dall’RNA dobbiamo sintetizzare il cDNA e lo facciamo utilizzando una coppia di oliognt

che ibridizzino con una specifica sequenza o con la coda di poly A(così riusciamo a pescare l’RNA

che codifica per il gene di nostro interesse tra i tanti RNA cellulari).

Il cDNA viene amplificato utilizzando una coppia di oligont dotati di una codina con sequenza

riconosciuta dalla RNA pol. Infatti dal cDNA amplificato andremo a sintetizzare l’RNA, che sarà

l’RNA della sola sequenza di interesse ed amplificato opportunamente.

Del prodotto di amplificazione e di trascrizione prenderemo 3 estratti(un determinato volume) , che

conterranno RNA, facciamo una RT-PCR che va stoppata in fase log. Il prodotto di PCR viene

separato e quantizzato otterremo dei valori di lettura che corrisponderanno a determinati valori di

concentrazione. Utilizzando lo stesso metodo di lettura per il nostro campione da quantizzare

potremo valutare la sua concentrazione, in quanto, con i campioni che abbiamo prelevato prima

abbiamo costruito una retta di taratura in base alla quale, a ogni valore di lettura corrisponde una

determinata concentrazione. In realtà si otterebbe una curva, che sarebbe di difficile interpetrazione,

ma valutando il logaritmo della concentrazione, invece che quest’ultima, possiamo ottenere una

retta la cui lettura e interpetrazione sono dirette e immediate.

valore lettura

log []

Il controllo esterno è sicuramente molto più affidabile perché essendo amplificato parallelamente

ma in un tubino di reazione differente non subirà interferenze dovute ad eventuali impurità del

campione. Tuttavia la presenza di impurità che in questo caso influiscono solo sul campione e non

anche sul controllo costituisce un limite per la quantizzazione.

CONTROLLO INTERNO

Si basa sul principio ella competizione tra campione e standard dato che la reazione di

amplificazione è contemporanea e nello stesso tubino di reazione.

Può essere di due tipi:

Omologo(quello più utilizzato): una sequenza che differisce da quella del campione per una

singola mutazione che abolisce o crea il sito per un enzima di restrizione, oppure una

modifica che rende la sequenza controllo più lunga di quella del campione in modo da

distinguerle. Per la sintesi partiamo sempre dall’RNA, sintetizziamo il cDNA con un oligo

che ci consenta di selezionare l’mRNA(con coda di polit oppure che ibridizzi con una

specifica sequenza). Fatto ciò in due reazioni parallele sintetizziamo il nostro standard

utilizzando in una reazione un oligo(che chiameremo C) dotato di una appendice di

sequenza (tail 1)+ un oligo A con il promotore al 5’, nell’altra reazione utilizziamo un altro

oligo (l’oligoD) che contiene il tail 2 complementare al tail1+ un oligo B. mescoliamo i

prodotti delle due reazioni e facciamo denaturare i frammenti e poi rinaturare lentamente.

Alla fine avremo i due amplificati di partenza + un frammento proveniente dall’appaiamento

delle due tails che sono complementari. Inseriamo all’interno della mix gli oligo A e B. il

risultato saranno dei frammenti perfettamente identici alla sequenza del paziente ma

leggermente più lunghi.

Eterologo. Sequenza diversa da quella del campione che viene amplificata con la stessa

coppia di oligo che amplificano anche la sequenza del campione(anche la composizione di

G e C deve essere simile). Mescoliamo una quantità fissa di mRNA target e duna quantità

scalare di mRNA standard che farà da competitore . eseguiamo una RT-PCR e separiamo i

frammenti dove avremo due bande perfettamente equivalenti vuol dire che le concentrazione

di standard e campione sono le stesse.

La real time PCR ci consente di stimare la quantità di amplificato ad ogni ciclo della PCR

consentendoci di monitorare ad ogni ciclo come varia la quantità.

La valutazione istantanea momento per momento è possibile grazie all’utilizzo di sonde oligont

fluorescenti. Ci sono varie sonde che possiamo utilizzare e si dice che la prima sonda è stata la

Taqman(nn è assolutamente vero però) . questo tipo di sonda , che tra l’altro è una delle più costose

che ci siano, sfrutta l’attività 5’-3’ esonucleasica della polimerasi. Quello che succede è questo: la

sonda Taqman si appaia al DNA a singolo filamento e quanto la pol comincia la sintesi del

filamento complementare allo stampo la sonda viene spazzata via , viene degradata consentendo la

rivelazione di fluorescenza. La sonda è costituita da due gruppi , il REPORTER al 5’ ed il

QUENCER al 3’. Il QUENCER è in grado di assorbire la fluorescenza emessa dal REPORTER

quindi quando sono vicini non si ha emissione di fluorescenza, ma durante la fase di sintesi si ha la

degradazione della sonda per cui QUENCER e REPORTER si allontanano e quindi viene emessa

la fluorescenza. Per quanto ho appena detto è evidente che la quantizzazione viene effettuata nella

fase di sintesi del DNA perché p nella fase di sintesi che la sonda emette fluorescenza. La

specificità della sonda è molto alta , non vengono considerati prodotti aspecifici grazie alla natura

della sonda.

Fare ed allestire una real time, per esperienza personale, è una cosa molto semplice ragazzi il grosso

problema è l’interpretazione dei dati. Anche nel caso della real time , come in tutte le PCR, ma in

generale per tutti gli esperimenti, bisogna inserire nella reazione anche un reference in base al quale

andiamo a fare tutti i nostri calcoli.

Avremo:

Rn = intensità della fluorescenza emessa dal fluorocromo normalizzata in rapporto alla fluorescenza

emessa da un reference passivo che sta nel tampone.

Rn+ = Rn ad un determinato ciclo in una reazione che contiene il DNA stampo.

Rn- = Rn ai cicli iniziali prima che si abbia un significativo aumento della fluorescenza.

∆Rn = (Rn+)-(Rn-).

Maggiore è la concentrazione del campione di partenza più velocemente si ha l’aumento della

fluorescenza e più precocemente si raggiungerà il ciclo soglia, vale a dire il ciclo a cui si inizia a

rilevare un aumento significativo di fluorescenza. Se definiamo AVE Rn la Rn+ media ai primi cicli

+/- DS, il ciclo soglia CT sarà uguale a AVE Rn +/- 10 DS.

ΔRn

Cicli

Se facciamo il log della concentrazione in funzione del CT, avremo una retta, più facile da

consultare.

40

CT

15

Log[DNA]

Il ciclo soglia(CT) è il parametro che viene utilizzato per la quantizzazione.

Lo strumento, prima della misurazione, deve essere tarato con uno standard interno (ex si aggiunge

nello stesso tubo di reazione un controllo interno omologo e una sonda marcata con un fluorocromo

differente che ibridizza con la sequenza diversa sul controllo) o esterno. La sonda viene scelta con

un programma e deve avere una temperature di 5-10°C maggiore rispetto alla Tm dell’oligont

innesco ed inoltre non deve presentare una G al 5’. Possiamo agire su diversi parametri per

ottimizzare la PCR, come la concentrazione dei dNTPs (> [dNTPs], < specificità della reazione), la

concentrazione dell’innesco, la concentrazione della sonda, MgCl2.

Ligth cycler

Sono simili alle Taqman nella struttura ma funzionano nella maniera opposta. Sono complementari

a due regioni adiacenti dello stampo. Quando le due sonde sono vicine si verifica un trasferimento

di energia e si ha emissione di fluorescenza . Quindi, mentre per le sonde taqman la fluorescenza

veniva emessa nella fase di sintesi,utilizzando le sonde light cycler la fluorescenza si ha nella fase

di ibridizzazione con lo stampo di DNA.

Molecular Beacons

Sono presenti sempre il quencer ed il reporter . la sonda è strutturata in maniera tale da potersi

ripiegare su sé stessa formando una struttura secondaria di tipo stam and loop. Nell’ansa si trova la

regione di appaiamento con lo stampo . se la sonda è ripiegata nella struttura secondaria con Q e R

vicini, per lo stesso principio della Taqman non si ha emissione di fluorescenza, se la sonda si

linearizza ibridizzando con lo stampo , Q e R si allontanano e si ha fluorescenza. Anche con questo

tipo di sonda abbiamo fluorescenza nella fase di ibridizzaione e quindi in seguito alla denaturazione

dello stampo.

Scorpion primers

Sono dotate sia della sequenza che funziona come sonda sia di una sequenza che fa da innesco. La

struttura è del tutto simile a quella delle molecular beacons , l’unica differenza è la repsenza di

questa sequenza legata alla sonda tramite un linker.

La reazione avviene in questo modo:

1. Fase 1 della PCR: denaturazione del doppio filamento di DNA e dello scorpione primers.

Entrambe si denaturano

2. Fase 2 della PCR: annealing del primers, dello scorpion primes , allo stampo con successiva

polimerizzazione dello stampo. Inoltre la porzione dello scorpion primers che funge da

sonda si riavvolge su sé stessa.

3. Fase 3 della PCR.: seconda denaturazione. Si denatura il doppio filamento neosintetizzato e

si denatura anche lo scorpion primers .

4. Fase 4 della PCR: si ritorna alla temperatura di annealing , in questa fase la sequennza sonda

si andrà ad appaiare con la sequenza a cui è complementare. Di conseguenza si formerà un

ibrido molecolare con quencer e reporter abbastanza lontani da consentire l’emissione di

fluorescenza.

Si sono fatte delle prove poiché è possibile che lo scorpion primer possa fungere solo da sonda ,

proprio come una molecular beacons, ma si è visto anche che la duplice funzionalità è favorita.

Si sono allestite due reazioni di PCR in cui in una veniva messe la coppia di oligont innesco

necessari per l’amplificazione e lo scorpion primer, nell’altra reazione abbiamo messo un oligont

innesco e lo scorpion primero come secondo oligo. Nella reazione dove lo scorpion primer

funzionava solo da sonda si aveva una fluorescenza inferiore rispetto all’altro tubino di reazione.

Questo vuol dire che la reazione di legame del primer è favorita.

Altro punto a favore è la non interferenza con l’attività esonucleasica 5’-3’ della polimerasi. Lo

scorpion primers non interferisce.(con gli scorpion primers possiamo allestire anche un ARMS)

Sybr green

È la tecnica maggiormente utilizzata perla real time. Si tratta di una molecola intercalante il DNA

che si inserisce nel solco minore. Emette quindi fluo0rescenza nella fase di appaiamento non di

sintesi né di denaturazione. Si perde ovviamente di specificità, perché la formazione di ibridi

molecolari aspecifici ha messione di fluorescenza cmq. Possiamo però ovviare a questa aspecificità

facendo denaturare il campione , dopo i cicli della PCR, e facendo rinaturare lentamente e il

risultato viene rappresentato su un sistema di assi cartesiani.

d∆F/d∆T

Tm T

Il picco più piccolo è la chiara espressione di dimeri di primers. Se non ci sono picchi più piccoli

allora vuol dire che non ci sono stati appaiamenti aspecifici se ci sono non li dobbiamo considerare

come segnale.

Un esempio è la LMC(leucemia mieloide cronica) in cui noi possiamo vedere la quantità di

trascritto derivante dal gene ibrido tramite una RT- real time PCR. Il prodotto di amplificazione

viene poi paragonato(quantizzazione raltiva) con un gene HOUSE KEEPING, un gene espresso

costantemente che funge da controllo interno.

Tecniche per la ricerca di mutazioni puntiformi note.

RFLP

Polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione. Si tratta di mutazioni puntiformi che

aboliscono o creano o spostano un sito per un enzima di restrizione. La tecnica è abbastanza

semplice basta digerirei il frammento con l’appropriato enzima di restrizione e vediamo se c’è o

meno la digestione. Ci possono però essere delle impurità che non consentono all’enzima di

lavorare correttamente ma questo lo vediamo perché la banda risulterà meno intensa, però possiamo

essere sicuri di no sbagliare se amplifichiamo anche una regione più grande che contiene anche un

altro sito di restrizione , no mutato, oltre a quello che stiamo analizzando. Se questo frammento

viene digerito allora vuol dire che l’enzima sta funzionando bene. Quando una mutazione crea un

sito di restrizione è abbastanza facile identificarla perché noi sappiamo perfettamente quali sono le

sequenze riconosciute dai vari enzimi di restrizione, quando la mutazione abolisce un sito di

restrizione non sappiamo precisamente che tipo di sostituzione abbiamo avuto.

ES: SMA (atrofia muscolo spinale): patologia autosomica recessiva determinata da una mut sul cro

5 (duplicazione invertita) che causa nel 95% dei casi la delezione del gene SMN1 e nel 5% dei casi

mut puntiformi in questo gene. È presente un gene SMN2 ripetuto e invertito ma la sua presenza

non è sufficiente in quanto presenta in una sostituzione in terza base di un codone, che causa uno

splicing alterato. Dal momento che sull’esone 7 SMN2 ha un sito riconosciuto dall’enzima di

restrizione Dra1 che SMN1 non ha, e sull’esone 8 SMN2 ha un sito riconosciuto dall’enzima di

restrizione Dde1 che SMN1 non ha, si può fare un’analisi di RFLP per identificare soggetti malati,

mentre per i portatori è necessaro allestire un’analisi di tipo quantitativo.

ARMS

In parole povere una reazione di PCR allele specifica.

Allestiamo due reazioni di PCR separate usando un oligont che sia uguale nelle due reazioni(quello

che ibridizzerà con l’allele sano) ed un allele specifico per la forma mutata e per la forma non

mutata dello stesso allele che volgiamo sapere se porta o meno la mutazione(questo oligont

specifico al 3’ porta in nt nelle due forme mutata e wt). Se nello stampo c’è il nt complementare

all’innesco avremo appaiamento e quindi amplificazione. Andiamo poi a veder eche cosa è

successo. Separiamo i prodotti di PCR. Se abbiamo segnale dove c’era l’oligont sonda mutato allora

vuol dire che il soggetto ha l’allele mutato, se abbiamo segnale dove c’era l’oligont sonda wt il

soggetto non ha la mutazione .

Inoltre viene utilizzato un oligont sonda che 2-3 nt prima del 3’ ha un mismatch in modo tale che la

complementarietà del nt al 3’ sia essenziale e fondamentale per il corretto appaiamento. Si

utilizzano di solito basse [primers] per aumentare la specificità di reazione. Il controllo è

rappresentanto da un’altra coppia di oligo che amplifica un’altra sequenza.

OLA

Vengono utilizzate una coppia di sonde che ibridizzano in regione vicine . una delle due sonde è

uguale per le due reazioni ed una è allele specifica. Dopo l’ibridizzazione facciamo avvenire la

reazione di ligasi e poi separiamo i frammenti ottenuti. Se c’è un mismatch le due sonde non

saranno correttamente appaiate e abbastanza vicine da poter fa avvenire la reazione e quindi non si

avrà visualizzazione della banda corrispondente alla sonda ligata.

ASO

La mutazione deve essere inserita in maniera tale da rendere instabile il prodotto di ibridizzazione. .

il DNA amplificato e viene trasportato su un filtro di nitrocellulosa e viene fatta avvenire la

reazione di ibridizzazione. Su un filtro il DNA viene fatto ibridizzare con la forma wt della sonda e

sull’altro filtro con la forma mutata, entrambe marcate (radioattivo). Vengono effettuati lavaggi per

togliere tutto quello che non si è legato ,per cui quello che si è legato molto debolmente si staccherà.

Andiamo a visualizzare con autoradiografia e vedremo segnale solo dove c’è stata ibridazione. Se

abbiamo segnale solo sul filtro wt il soggetto è omozigote wt se abbiamo segnale solo sul filtro con

la mutazione il soggetto è omozigote mutato, se abbiamo doppio segnale il soggetto è eterozigote .

Reverse dot plot

Sul filtro sono legate le sonde, e la rivelazione è cromogenica, non si ricorre all’utilizzo di sostanze

radioattive.

Discriminazione allelica

Possiamo allestire una semplice reazione di PCR all’end point.

Vengono costruite due sonde che ibridizzano con la forma mutata e con la forma wt dell’allele e le

sonde vengono, ovviamente ,marcate con due fluorocromi differenti. Facciamo la PCR facciamo

avvenire l’ibridizzazione e quello che otteniamo è raffigurato qui sotto:

Fluor

T

Facendo la derivata negativa del rapporto tra variazione di fluorescenza e ∆T abbiamo le curve più

facili da interpretare.

In nero abbiamo l’omozigote mutato;

In verde l’eterozigote;

-d∆F/d∆T in arancio l’omozigote wt .

T

Possiamo anche individuare il tipo di mutazione usando delle sonde che ibridizzino nella specifica

regione e sito di mutazione.

SONDA TaqMan MGB

Sono state introdotte proprio per la discriminazione allelica. Sono strutturate alla stessa maniera

della TaqMan e funzionano allo stesso modo ma sono dotate di una porzione in più, la porzione

MGB, che si intercala nel solco minore conferendo maggiore stabilità alla struttura. Il gruppo MGB

è generalmente un gruppo antibiotico. Il gruppo MGB consente una maggiore stabilità anche se la

sequenza può essere più corta, e ciò vuol dire maggiore specificità di legame ma uguale stabilità di

una sequenza più lunga. Quando la sequenza è più piccola anche un singolo mismatch rende

l’appaiamento debole e quindi avremo minore fluorescenza perché non c’è una match del 100%.

(queste sonde vengono utilizzate molto per la quantizzazione dei geni SMN1 e 2).

Ricerca di mutazioni puntiformi non note

Non sapendo che mutazione cercare dobbiamo interrogare l’intero gene che però deve essere noto.

Dobbiamo sapere quale gene veicola la mutazione causa della malattia; ostacoli a questo tipo di

analisi sono l’eterogeneità genetica (+ geni che danno uno stesso fenotipo) e l’eterogeneità all’elica

(più mutazioni danno lo stesso fenotipo). Una volta noto il gene, possiamo analizzarlo tutto o parte

di esso con varie tecniche. Molti di questi metodi si basano sulla PCR. Generalmente si amplifica il

gene più una cinquantina di nt a monte e a valle, oppure si amplificano gli esoni con i nt intronaci

adiacenti. Se è possibile analizzare il cDNA è sicuramente meglio perché più piccolo e contiene

solo gli esoni, ma non sempre è possibile ottenere l’RNA e poi ci sono tutta una serie di problemi

collegati alla tessuto-specificità ecc.

SSCP

E’ una elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native. Prima di tutto denaturiamo il

campione variano la concentrazione salina o il valore del pH. Dopo la denaturazione, tramite un

repentino trattamento con ghiaccio, sfavoriamo la rinaturazione del campione e lo facciamo

migrare sul gel . Durante la migrazione i frammenti assumeranno delle strutture secondarie dettate

dalla sequenza primaria quindi un frammento che presenta una o più mutazioni assumerà una

conformazione differente dal wt che farà in modo tale che migri in maniera differente. Una volta

individuato il frammento o i frammenti che contengono una mutazione abbiamo solo informazioni

qualitative, solo facendo una analisi di ricerca della mutazione possiamo dare un nome ed una

identità alla mutazione. Cmq con questa tecnica siamo riuscititi a restringere il campo di analisi per

la ricerca della mutazione.

E’ inevitabile effettuare delle corse elettroforetiche di prova con condizioni differente per valutare

quale è la migliore. Tutto ciò è valido per frammenti che vanno dalle 150 alle 250 coppie di basi

perché oltre questa grandezza il singolo evento mutazionale non influenza la struttura secondaria e

la migrazione del frammento. In questi casi possiamo ricorrere all’utilizzo di oligont marcati oppure

colorare con nitrato d’argento.

Durante una PCR è normale che si formino degli ETERODUPLEX tra frammenti che presentano un

mismatch (sempre che la mutazione sia in eterozigosi). Se però la mutazione è in omozigosi non la

vediamo così facilmetne allora dobbiamo fare in modo che si formino gli eteroduplex per

individuarla e come facciamo? Fatta la PCR separiamo il prodotto di amplificazione su gel

d’agarosio e dopo mescoliamo il prodotto di amplificazione del campione con quello di un

controllo. Si formeranno degli omoduplex e degli eteroduplex tra il frammento del controllo (sano)

e quello del campione(con la possibile mutazione).

E’ ovvio che gli eteroduplex si comporteranno in maniera differente rispetto agli omoduplex perché

sono più instabili.

Il controllo deve essere un soggetto che , in quella specifica sequenza, ovviamente quella usata

come controllo, non contenga mutazioni e nemmeno polimorfismo(SNPs) altrimenti è ovvio che si

formeranno mismatch se c’è un polimorfismo e alla fine andremo ad analizzare un frammento che

in realtà è perfettamente sano.

DGGE

Con gradiente di denaturazione. Si denatureranno prima gli eteroduplex, perché sono più instabili.

L’eteroduplex denaturato sarà rallentato nella migrazione . Il gradiente è formato da

urea/formaldeide.

TGGE

Con gradiente di temperatura (uguale ragionamento).

DHPLC

La separazione avviene su una matrice idrofobica di polistirene. Tale matrice interagirà debolmente

con il DNA, che avremo precedentemente denaturato. L’interazione è garantita da un controione

anfipatico che interagisce con la matrice e con il DNA , tale controione è il TRI ETIL AMMONIO

ACETATO(TEAA). La colonna viene equilibrata con TEAA 0,1M e acetonitrile. Dopo aver

equilibrato la colonna carico il DNA e facciamo avvenire le interazioni. Dopo un po’ di tempo ,

quanto basta per far avvenire l’interazione, eluiamo il campione con una concentrazione crescente

di acetonitrile. L’acetonitrile serve per staccare le interazioni tra DNA e TEAA è ovvio che dove

c’è un mismatch il legame è più debole ed il campione sarà eluito prima e ad una concetrazione di

acetonitrile inferiore. Equilibrare la colonna è fondamentale per capire a quale tempo esce il picco.

Possiamo anche far avvenire la reazione ad una temperatura tale da far formare una bolla

nell’eteroduplex, più sensibile, senza intaccare l’omoduplex, possiamo fare avvenire la reazioni in

condizioni di parziale denaturazione e così via per ottimizzare l’ analisi. La temperatura da

utilizzare si sceglie prima e in maniera molto accurata. Quando facciamo la PCR , dopo analizziamo

l’amplicone con un software che traccia il profilo di denaturazione termica. Ci indica anche ad ogni

temperatura quale è la percentuale di DNA denaturato e non. Per avere una buon risultato la

denaturazione non deve superare il 20%.

NB: spesso bisogna ricorrere a più temperature.

Generalmente non si fa tutto il gradiente di concentrazione di acetonitrile altrimenti ci vorrebbero

30 minuti per ogni campione. Il software , in base alla sequenza, traccia il profilo di denaturazione

termica e calcola anche il tempo che ci vuole per eluire un frammento di una determina lunghezza e

quale è la concentrazione di acetonitrile ottimale (+/- deviazione standard). Con queste infomrazioni

traccia una finestra di concentrazioni di acetonitrile che ci consente di vedere quel frammento,

allarghiamo leggermente la finestra per essere più sicuri e una volta stabilita la finestra ci vogliono

appena 7 minuti per fare l’analisi. Potremmo anche aumentare il flusso con cui viene rilasciato

l’acetonitrile, ma questo vorrebbe dire ridurre la sensibilità della tecnica. Nella migliore delle

ipotesi dovremmo vedere 4 picchi, 2 dell’omoduplex e due per l’eteroduplex. Gli eteroduplex vanno

mandati a sequenziare. L’unico limite è rappresentato dai polimorfismi però non potremo mai

sapere se si tratta di un polimorfismo o meno quindi dobbiamo sempre sequenziare nel dubbio. La

DHPLC è una tecnica molto sensibile e quindi la PCR deve essere molto controllata per non avere

interferenza, tipo contaminazioni di frammenti con uguale PM dei nostri. Inoltre è una tecnica

completamente automatizzata , rapida, molto sensibile per mutazioni puntiformi (più del 97%),

analizza frammenti da 100 a 700 bp(i frammenti vengono raggruppati per temperatura).

L’inconveniente è dato dalla frequente presenza di picchi aggiunti o piccole spalle, o differenze di

geometria del picco

PTT

È il protein truncation test , quindi dobbiamo far esprimere la proteina codificata dal gene che ci

interessa studiare. Il frammento viene clonato in un vettore di espressione con il quale un batterio

viene trasformato. Il vettore di espressione contiene una sequenza sensibile all’induzione da parte di

una determinata sostanza, molto spesso IPTG (induzione lac-like). Aggiungendo questa sostanza al

mezzo di coltura batterico si ha la trascrizione e la traduzione della proteina I prodotti di traduzione

vengono marcati (ex metionina con S35

). Bisogna sempre far correre un controllo senza la

mutazione e clonato nello stesso tipo di vettore.

Il campione viene fatto correre e vediamo la lunghezza della proteina in analisi rispetto al controllo.

Si possono evidenziare mutazioni non sense(che producono un codone d stop quindi una proteina

tronca), mutazioni dei siti di splicing, delezioni e duplicazioni. Individuata la proteina anomala si

procede con il sequenziare il frammento da cui è stata tradotta, per capire che tipo di mutazione c’è

stata..

DNA CHIPS

Rappresenta l’attuale metodo più automatizzato e veloce per lo studio del genotipo e per la ricerca

di SNPs, sostituzioni e mut puntiformi, trascrittomica, proteomica. È una metodica complessa,

costosa, quantitativa e qualitativa.

Il chip è una superficie solida di nylon o di vetro dove sono adese(in maniera perfettamente

ordinata) delle sonde, che legheranno il target .

Il vetro generalmente si preferisce perché non si deforma e non essendo poroso il DNA non penetra

, quindi la ibridizzazione è più efficiente e veloce. Ci sono due tipologie di sonde:

I TIPO: sonde di cDNA frammentate (fino a 10000 cloni in 1,6cm2);

II TIPO: sonde di oligont (65000-400000 oligont che rappresentano fino a 9000geni su una

superficie di 1,6 cm2) sensibilità 95%; specificità 95%, mut in omozigosi

>specificità98%; mut in eterozigoti: sens 88%.

La tecnica generale prevede la sintesi dell’oligont e poi il trasporto sul chip, ma si sono trovate delle

tecniche per sintetizzare la sonda direttamente sul chip consentendo una max miniaturizzazione.

In vivo la sintesi del DNA è diretta in modo 5’-3’ in vitro avviene nella direzione opposta 3’-5’. La

reazione viene direzionata in quanto i nucleotidi che si aggiungono uno per volta hanno l’estremità

5’ bloccata. Questa estremità viene liberata solamente nel momento in cui si deve effettuare il

legame con il nucleotide successivo.

La reazione inizia con un nt che ha l’estremità 3’ bloccata e il 5’ libero: la reazione di legame

fosfodiestereo del 3’ al chip avviene quando eliminiamo il gruppo che bloccava il 3’. Poi

aggiungiamo il 2 nt, che ha il 5’ bloccato e il 3’ libero, che si lega al gruppo 5’ libero del nt

precedente adeso al chip. Poi liberiamo il 5’ del secondo nt legato dal suo gruppo inibitore, e

aggiungiamo il 3 nt, che sempre avrà il 5’ bloccato e il 3’ libero, che si andrà a legare. E così via

fino alla fine della sonda

NB: i gruppi protettivi possono essere chemiolabili, vanno via con reazioni chimiche, oppure più

semplici ancora quelli fotolabili, basta irradiarli con a luce per eliminarli.

La costruzione delle sonde direttamente sul CHIP è un processo non molto difficile, in quanto

quando si sta costruendo una determinata sonda si sblocca il 5’ di quella e solo quella. Quindi

quando sul CHIP aggiungeremo un nucletotide che deve legarsi, questo non potrà fare altro che

legarsi all’unica estremità che ha il 5’ pronto ad accoglierlo, che è quella che noi abbiamo

volutamente sbloccata grazie a irradiazione con luce.

A

A G

A G T

A G T C

Tra la sonda e la superficie del chip si utilizza un polimero spaziatore non troppo lungo, come non

troppo lunga deve essere neanche la sonda altrimenti si perde specificità di interazione e inoltre si

favoriscono legami intramolecolari.

Il nostro target sarà marcato con fluorescenza o radioattività (p33) o biotina-streptavidina per

consentire la successiva rilevazione del segnale. Inoltre si preferisce usare il target come RNA

perché l’interazione RNA/DNA è più stabile di quella DNA/DNA quindi o sintetizziamo l’RNA

direttamente dal campione del paziente aggiungendo solo il promotore oppure dall’RNA del

paziente facendo prima il cDNA e poi l’RNA (che si può trascrivere anche con UTP-biotina)

IDENTIFICAZIONE DEGLI SNPS

I chip, soprattutto quelli di tipo II ,vengono utilizzati per l’identificazione degli snp’s . Hanno una

specificità del 95% ed i metodi sono tre:

MINISEQUENCING ANALYSIS: usata per analisi di mutazioni puntiformi. Vengono usati

ddNTPs e viene fatta una banale reazione di sequenziamento. Il chip è costitutito da

sequenze di oligont non sintetizzati sul chip ma a parte perché il 3’ OH deve essere libero. Il

target viene fatto ibridizzare con il chip, dopodichè aggiungiamo i ddNTPs e la Pol, la

sonda di oligont adesa sul chip funge da innesco per la reazione della polimerasi: se la

sequenza del target per ex presenta una T questa si appaierà con un ddNTP (A) ed avremo

un determinato segnale.

GUADAGNO DI SEGNALE: si costruiscono delle sonde che al centro della sequenza

presentano il nt che vogliamo interrogare, di cui volgiamo conoscere l’identità. In base al wt

costruiamo la sonda e ne facciamo 4 che differiscono per il nt centrale che sarà su una sonda

la A, su una la T poi la G e la C . posizioniamo le sonde sul chip sapendo perfettamente

dove sta una e dove l’altra e facciamo avvenire la reazione di ibridazione con il target. Se

nel target abbiamo la T come nt centrale avremo che questo si sarà legato alla sonda con al

centro la A e quindi avremo segnale nel punto in cui è posizionata la sonda con la A. questo

se il soggetto è omozigote wt , singolo segnale avremo anche nel caso sia omozigote mutato,

ma ovviamente il segnale sarà acceso in un altro punto del chip , se il soggetto è eterozigote

avremo la contemporanea accensione di due segnali. Interrogato questo nt possiamo

proseguire al nt successivo e così via .Con questa tecnica possiamo diagnosticare anche

micro delelzioni e micro inserzioni.

RIDUZIONE DI SEGNALE: Il chip viene fatto ibridare con 2 target( il controllo e il

campione). Poi si effettua un rapporto tra il segnale emesso dal controllo e quello emesso dal

campione. Fc/Ft =1. se il rapporto è 2 (anche superiore a 1,5 basta) abbiamo una mutazione

in eterozigoti, non sappiamo quale. Se il rapporto tende ad ∞ (2/0 =∞) abbiamo una

mutazione in omozigosi.

I chip possono essere usati anche per studi di trascrittomica. Ad es. per valutare come vengono

espressi i geni in un tessuto tumorale. Gli mRNA (cDNA )dei geni del tessuto malato del tessuto

sano, dello stesso soggetto, vengono mescolati e fatti i bridizzare. In base al segnale possiamo

capire se vengono espressi maggiormente i geni del tessuto tumorale o quelli del tessuto sano e se

un gene è più espresso in un tessuto tumorale o sano.

Si possono , come già detto, anche individuae inserzioni , delezioni, mutaz puntiformi. Si può

vedere che ci sono come mutazioni ma non possiamo identificarle se non tramite il

sequenziamento(glod standard).

SEQUENZIAMENTO:

come detto in precedenza è il gold standard per l’identificazione di mut puntiformi, e viene usato

come prima metodica per geni piccoli e con elevata eterogeneità allelica. Con geni grandi si

preferisce screenare l’intero gene con metodiche diverse alla ricerca dell’esone coinvolto nella

mutazione e poi sequenziarlo. Il sequenziamento seguito da elettroforesi capillare su gel identifica

bene sostituzioni di1nt in omozigosi (sostituzione di un picco con 1 altro) in eterozigosi

(sovrapposizione di due picchi) insezioni o delezioni in omozigosi (dopo la mut, la sequenza

continua identica al wt) mentre per le inserz o delez in eterozigosi la macchina formula un grafico

con una doppia sequenza dal punto della mutazione in poi, e si deve interpretare confrontando con

la sequenza wild type. Per confermare una mut puntiforme si sequenzia anche il complementare del

nostro stampo, e si può fare una ARMS con primers che terminano sul punto della mutazione.

Ora, non appena abbiamo identificato la mutazione dobbiamo capire se questa mutazione è

causativa i una patologia. Queste informazioni le possiamo ottenere da :

DATI INDIRETTI : 1 assenza della mutazione in soggetti normali si devono analizzare

ameno 100 cromosomi per le mutazioni in emizigosi e 50 per le mutazioni autosomiche

dominanti, però si potrebbe trattare anche di un polimorfismo molto raro manifestato da

meno dell’1% della popolazione), 2 il residuo amminoacidico mutato è conservato in

proteine omologhe estratte da altre specie(se è conservato vuol dire che svolge u ruolo molto

importante per la funzione della proteina), 3 valutare se la mutazione segrega con il

fenotipo, 4 natura della sostituzione: aa di classi diverse o uguali

DATI DIRETTI

IPERTERMIA MALIGNA

Si tratta di una malattia a trasmissione autosomica dominante.

La mutazione causativa della malattia è assente nei soggetti sani;

La sequenza della proteina (un recettore) è molto conservata . sono molto conservate , nella

sequenza, tutte tre le isoforme di questo recettore;

Tutti i soggetti malati presentano quella mutazione mentre i soggetti sani non la presentano,

quindi la malattia segrega con quella mutazione,

La sostituzione amminoacidica è molto importante in quanto la valina, aa idrofobico, viene

sostituita dall’ac aspartico, aminoacido acido.

Quando parliamo invece di una malattia a trasmissione recessiva il fatto che 100 pazienti normali

non la presentino non è indicativo a meno che non si tratti di una patologia molto rara, anche andare

a vedere come segrega la malattia nella famiglia non ci aiuta molto perché i soggetti portatori sono

sani , possiamo effettuare dei saggi DIRETTI come il saggio dell’attività della proteina mutata in

vitro.

Ad es. l’intolleranza ereditaria al fruttosio: L’enzima ALDOLSI B (di origine epatica) scinde,

normalmente, il fruttosio 1-6 bisfosfato(1-6BP) in DHA-P e GA-3P(scissione aldolica)oppure può

trasformare il Fruttosio-P in DHA-P e GA.

L’aldolasi B è un omotetramero e conoscere la struttura di una proteina è molto importante per gli

studi di MOLECULAR IMAGING in cui nella struttura normale della proteina andiamo ad inserire

la nostra mutazione e vediamo come si modifica la struttura in funzione di quella sostituzione. Per

esempio l’arginina303 è molto importante per la stabilizzazione del substrato. Se, per esempio,

viene sostituita con GLn non abbiamo una grossa variazione della struttura della proteina, ma

cambierà l’affinità di legame al substrato. Invece se viene sostituita con triptofano abbiamo una

grossa variazione della struttura. In entrambi i casi però non parliamo ancora di analisi dirette.

Possiamo anche clonare il cDNA della proteina, sottoposto a mutagenesi diretta, in un plasmide

dotato di sito per la trascrizione e traduzione. Il plasmide viene trasfettato in E.Coli che

esprimeranno la forma non mutata e la forma mutata della proteina. A questo punto lisiamo le

cellule batteriche e purifichiamo la proteina, per purificarla correttamente possimo ache metterle un

segnale come una coda di His all’N-terminale della proteina. Le His legano ioni metallici come il

Nichel quindi in base a questo separiamo e le proteine con cromatografia per affinità e per attestare

la purezza della proteina effettuiamo una elettroforesi (SDS-PAGE) . A questo punto la proteina

viene saggiata:

Attività specifica in condizioni saturanti di substrato;

Cinetica in condizioni variabili di substrato.

FRUTTOSIO 1-6 BP FRUTTOSIO 1P

V Wt RW V Wt RW

RQ RQ

µg enzima µg enzima

tutte le indagini ci portano a concludere che la mutazione è causa della malattia.

Ci sono situazioni molto più complicate come l‘ipertermia maligna in cui i soggetti sono

suscettibili all’azione di alcuni farmaci. Tale suscettibilità può causare anche la morte se il

farmaco non viene allontanato dal corpo.

La patologia è causata da una inefficiente omeostasi del Ca2+

. Il Ca2+

aumenta equinid

aumenta anche la contrazione muscolare, il metabolismo e tutte quelle reazioni catalizzate

da enzimi calcio-dipendenti. Si tratta di una malattia eterogenea ma in più del 50% dei casi

sono state ritrovate mutazioni di un canale del Ca2+

presente sulla membrana del reticolo

sarcoplasmatico. Quando RYR1(detto anceh recettore della rianodina) viene stimolato

rilascia il Ca2+

. Se ci sono mutazioni il canale può diventare ipersensibile ad alcuni farmaci

(anestetici volatili e biorilassanti) in risposta ai quali si apre lasciando uscire Ca2+

. Altre

patologie possono essere alcune miopatie non progressive come il central core desease

(malattia autosomica dominante). Questa malattia è caratterizzata dalla presenza d aree

amorfe dette cores, queste aree corrispondono a zone disorganizzate del sarcomero in cui

sono assenti mitocondri. Il recettore RYR1 è coinvolto anche in un’altra patologia nota

come Multi-mini core desease(autosomica recessiva congenita), anch’essa caratterizzata

dalla formazione di aree di disorganizzazione del sarcomero più piccole e numerose

(minicores).

Il recettore RYR1 ha circa 500 aa ed è codificato da una gene molto grande. Le mutazioni

causa del CCD sono localizzati al C-terminale della proteina (segmento transmembrana). Ci

sono tre regioni di HOT SPOT mutation ed una volta individuata la mutazione dobbiamo

individuare e capire se questa mutazione può essere causa della patologia e come lo

facciamo?

Clonaggio del cDNA di RYR1 mutato in cellule HEK293, in quanto si ha bisogno di

cellule eucariotiche perché le cellule batteriche non sono in grado di maturare il

trascritto primario da cui deriva il canale RYR;

Miotubi disperdici (RYR1 KO)murini;

Analisi di RYR1 mutati in colture di miotubi prelevati da pazienti e controlli,

linfociti b immortalizzati prelevati da pazienti e controlli(il gene è coinvolto in molti

processi basati sul Ca2+

oltre alla contrazione).

Studi eterologhi in cui andiamo studiare proteine coinvolte nella contrazione in

cellule che non si contraggono in modo da studiare solo la proteina e non tutte le

altre coinvolte in quello stesso meccanismo di contrazione;

Trasfettare le cellule con eguale quantità di di forma mutata e non mutata del gene(in

caso di eterozigoti. Quando utilizziamo le cellule del soggetto malato non possiamo

valutare mutazioni in promotori);

Valutare il rilascio di Ca2+

in risposta ad agenti scatenanti (ex alotano);

Rilascio di Ca2+

in seguito a stimolo elettrico(il recettore fa parte del sistema

eccitamento / contrazione, il canale RYR è associato ad un canale voltaggio

dipendente .Con lo stimolo elettrico andiamo a vedere se nel sistema muscolare si ha

un regolare rilascio di Ca2+

in seguito alla stimolazione del canale V/dipendente) ;

Legame della rianodina anche se non è detto che una variazione dell’affinità con la

rianodina significhi anche variazione nella funzionalità del recettore:

Aumento del rilascio di protoni (aumento dell’attività metabolica) in risp all’agente

scatenante. La contrazione consuma ATP, l’ATP consumato deve essere ricostituito

con l’intensificazione del metabolismo che provoca acidificazione tramite

produzione di ione H+ che devono essere estrusi. Quindi tramite la misurazione dei

protoni misuriamo l’attività metabolica e quindi la risp allo stimolo;

Per i pazienti MSH (mutazioni nella regione centrale della proteina) facciamo studi

di Fluorescenza. Usiamo un indicatore del Ca2+

con cui carichiamo le cellule che

vengono stimolate e tramite la fluorescenza valutiamo come aumenta il Ca2+

, in un

soggetto normale il Ca2+

aumenta e dopo ritorna a valori normali;

- Rilascio di Ca2+

in seguito a stimolo con TAPSIGARGINA , inibitore della SERCA

Ca2+

ATPase-SarcoEndoplasmaticReticulumCalciumATPase (ci sono pompe che

contro gradiente pompano il Ca2+

nel reticolo sarcoplasmatico). Se inibiamo queste

pompe otteniamo che il Ca2+

non viene più pompato nel reticolo e quindi aumenta

nel citoplasma. Facciamo una misurazione indiretta;

- Stimolazione con 4 cloro-cresolo, che media il rilascio di Ca nel citosol

NB:ci sono dei limiti nella trasfezione infatti vado a vedere le mutazioni in

omozigosi , poi nono sappiamo effettivamente quanto sia stato transfettato ed inoltre

la transfezione è transiente.

mutato

[CA2+

] Wt

[4 Cl-Cresolo]

La concentrazione efficace di 4-Cl-cresolo è < nel soggetto mutato rispetto al Wt.

CCD: central core desease: mutazione al C- che costituisce la porzione

transmembrana della proteina (poro). I soggetti malati esaminati hanno di base degli

accumuli di Ca2+

inferiori rispetto al controllo. Abbiamo rilascio di Ca2+anche senza

stimolazione, quando vado a stimolare con tapsigargina abbiamo un rilascio di Ca2+

inferiore rispetto al controllo questo perché i depositi di Ca2+

sono inferiori rispetto al

controllo. Questo ci spiega perché quando abbiamo lo stimolo avremo come risp una

contrazione più debole spiegazione della miopatia associata al CCD.

MUTAZIONI ASSOCIATE A SITI DI SPLICING: Le regioni fiancheggianti i siti

di splicing presentano sequenze consensus che sono molto conservate e per

analizzarle in genere si amplificano le regioni codificanti più una cinquantina di nt al

3’e 5’ per vedere se ci sono eventuali anomalie.

Fino ad ora abbiamo parlato di diagnosi diretta di mutazioni note e non note ora invece

affronteremo tutto quello che riguarda la ricerca di mutazioni in maniera indiretta.

DIAGNOSI INDIRETTA

Nel genoma ci sono un cospicuo numero si polimorfismi con i quali intendiamo degli eventi

mutazionali che si presentano nella popolazione con una frequenza dell’1%. Queste mutazioni nono

vengono corrette e rimangono nel nostro genoma e rappresentano la nostra carta di identità. Ogni

soggetto ha i suoi polimorfismi così come uno stesso soggetto può avere su due alleli dei

polimorfismi diversi. I polimorfismi possono essere:

Di sequenza : in questo caso due soggetti o due alleli dello stesso soggetto

presentano un nt diverso o una sequela di nt diversi;

Di lunghezza: in cui un certo n° di nt vengono ripetuti variabilmente ed è possibile

che la lunghezza di queste ripetizioni, in tandem, differiscano tra due soggetti e tra

due alleli dello stesso soggetto.

Bene conoscendo questi polimorfismi possiamo fare tantissime cose. Per esempio ricorrendo alla

mappatura delle VNTR(variable number tandem repeats) possiamo fare test di paternità in base a

come il neonato ha ereditato le VNTR, può averle ereditate solo dai due genitori(questa metodica

però fa perdere molto tempo e poi sono necessarie grosse quantità di DNA, circa 5 μg). Mappare e

caratterizzare le VNRT non è molto difficile basta tagliare, con opportuni enzimi, la regione che

accosta la VNTR ma non all’interno. Dopo aver isolato la sequenza la caratterizziamo tramite

southern.

Oltre alle VNTR possiamo anche ricorrere alle STR, sono tratti polimorfici intra-intronici di piccole

dimensioni, circa 2-4 bp. Infatti ST sta per short tandem repeats. Si tratta di geni molto polimorfici ,

con una elevata variabilità e ci consentono di seguire la segregazione genica e quindi si possono

utilizzare oltre che per l’attribuzione di paternità e per la valutazione dell’eventuale stato di

contaminazione dei villi coriali, anche per la diagnosi indiretta di mutazioni.

Uno degli utilizzi delle STR è il DNA FINGER PRNTING , è altro che una mappa delle STR del

soggetto e si può effettuare dal DNA prelevato dal sangue , capelli, liquido seminale ecc..

Vengono amplificati i frammenti contenti le STR e poi vengono separati tramite elettroforesi

capillare su gel o elettroforesi su gel di poliacrilammide. Marcando i frammenti amplificati li

possiamo separare contemporaneamente con una sola corsa elettroforetica .Dalla corsa possiamo

ottenere delle bande ombra oltre alle bande di interesse. Le bande ombra sono frammenti di DNA di

piccole dimensioni ed aspecifici dovuti al fatto che la polimerasi amplificando una regione in cui ci

sono delle sequenze uguali ripetute , scivola e quindi può amplificare un po’ in meno o un poco in

più. Le bande ombra possono essere attenuate se utilizziamo marcatori di 4-6bp.

Inoltre è possibile impostare una finestra elettronica in cui indichiamo l’intervello di lunghezza

delle varie STR in modo da identificarle e nominarle. Per esempio indichiamo che il frammento

compreso tra 100-150 è la STR1 , quello che va da 200-235è la STR2 ecc. Inoltre nell’ambito di

una STR possiamo indicare con 1 il nt 100 della STR1 con 2 il nt 101 della STR1 ecc. in base alle

nostre necessità possiamo usare vari marcatori polimorfici. E’ possibile anche stabilire il sesso se

inseriamo un marcatore del sesso come l’AMELOGENINA che ha lunghezza differente sull’x e

sull’y. Per la diagnosi di mutazioni vengono scelte STR altamente polimorfiche e eterozigotiche in

modo da seguire più correttamente la segregazione all’elica (se due genitori hanno la stessa STR e

per giunta in omozigosi noi non possiamo stabilire da chi ha ereditato una e da chi l’altra).

Un esempio dell’utilizzo delle STR nella diagnosi indiretta è la diagnosi prenatale di DMD.

Ipotizziamo che andiamo a valutare l’eventualità che ci siano state delezioni o inserzioni esoniche

ma non troviamo niente e non abbiamo la possibilità di sceenare tutto il gene per trovare possibili

mutazioni puntiformi. Possiamo fare una multiplex PCR che comprende tutti i polimorfismi di

lunghezza presenti sul gene della distrofina e dopo la PCR separiamo tutti i frammenti con una

unica corsa elettroforetica usando fluorocromi differenti(i marcatori polimorfici dovrebbero essere

15). Ovviamente potrebbe tranquillamente capitare che ci siano sovrapposizioni di frammenti che

differiscono per 2 basi o anche una. Possiamo marcare con fluorocromi differenti frammenti che

possono sovrapporsi tra loro. Quando frammenti che differiscono per una base si sovrappongono

abbiamo 3 picchi, uno più grande e 2 più piccoli. Quando mettiamo insieme tutte le STR in ordine

di collocazione cromosomia ca e li dividiamo anche in base a come sono stati ereditati(mettendo a

six l’STR ereditata dal papà e a destra quella ereditata dalla mamma) otteniamo l’aplotipo di quel

soggetto. Le STR si possono seguire anche nella valutazione del rigetto di trapianto.

Abbiamo parlato di VNTR,di STR ma ci sono anche gli SNPs, polimorfismi che interessano il

singolo nt. E proprio per questo dobbiamo utilizzarne più di una se vogliamo fare diagnosi. Quello

che può interferire con la nostra diagnosi è il fatto che molte patologie sono caratterizzate da una

elevate eterogeneità genica, nel senso che molte malattie e la loro manifestazione fenotipica sono

regolate da più geni che possono causare la malattia stessa (una stessa malattia può essere causata

dall’alterazione di geni differenti). Ad es. nel caso dell’ipertermia maligna, patologia di cui abbiamo

già parlato, si sono fatti studi che hanno evidenziato un altro locus genico, oltre a quello di RYR1 ,

che è causativo della malattia se interessato da una mutazione. Questo locus genico codifica per la

subunità α1 di un canale voltaggio dipendente strettamente associata al recettore RYR1 (tale canale

è noto come recettore della diidropiridina).

Se sul gene RYR1 non ci sono mutazioni viene eseguita una analisi di associazione per calcolare il

rischio . il parametro usato è il LOD SCORE.

LOD SCORE= log[Lθ/L(0.5)] probabilità di linkage/probabilità di non linkage

L= probabilità che il locus sia associato

L(0.5)= probabilità che il locus non sia associato

θ = frazione di ricombinazione.

Se il Lod score è uguale a 3 la probabilità è 1 a 1000, cioè 1000 probabilità che il locus sia associato

ed 1 che non sia associato. Si va a valutare il Lod score teorico (che è il massimo possibile) che si

ottiene facendo analizzare al programma il pedigree insieme con un marker che segrega con la

patologia e che sia eterozigote. In base al Lod score teorico facciamo le nostre supposizioni. Se il

Lod score riscontrato si avvicina a quello teorico le probabilità di segregazione sono molte alte se

non si avvicina dobbiamo cambiare qualcosa. La mutazione causativa della patologia non è quella.

Posso anche decidere, qualora sono soddisfatto del risultato ottenuto, di prendere la sequenza

analizzata e cercare se ci sono effettivamente mutazioni, che tipo di mutazioni e se e come sono

associate alla malattia.

Oltre ad usi diagnostici ed altre applicazioni che abbiamo cercato di illustrare, le STR possono

essere usate anche per individuare nuovi loci genici, ma per fare questo abbiamo bisogno di una

famiglia con una elevata statisticità.

Per esempio possiamo decidere di analizzare tutto il genoma ricorrendo a pannelli di STR e che si

distanziano tra loro per 10 centiMorgan e si vede come segregano i marcatori che mappano quel

cromosoma che può essere patologico o meno non ci interessa perché il metodo è lo stesso. Una

volta individuato il locus possiamo passare a marcatori polimorfici più vicini al locus individuato in

modo da restringere il campo. Questo è un esempio di un approccio metodologico all’utilizzo delle

STR ma possiamo molto concretamente fare un esempio di una applicazione delle STR per quanto

riguarda la diagnosi di TUMORE. Si tratta di un’indagine a scopo prognostico, in cui decidiamo di

analizzare LOH cioè la perdita di eterozigosità in corrispondenza di geni oncosoppressori tramite

l’amplificazione delle STR che marcano tali geni.

Il principio è abbastanza banale, basta prelevare tessuto sano e tumorale, dello stesso soggetto, e

valutare, rispetto ad un controllo, quali STR (e quindi geni vicini) si sono perse nel tessuto tumorale

e quale percentuale di sano e tumorale c’è di quel tessuto prelevato. Possiamo, per esempio, trovare

dei picchi oltre a quello canonico e questo indica che ci sono dei meccanismi di riparo inefficienti

oppure possiamo trovare per un allele un picco più piccolo rispetto al controllo, questo vuol dire che

in una percentuale di cellule si è persa l’eterozigosità (delezione). La percentuale si calcola con

questa formula:

Area allele1 normale/ area allele2 normale

LOH =

Area allele1 mutato/ area allele2 mutato.

ALTERAZIONI DELLO SPLICING

Fenomeni che alterano lo splicing possono essere:

1. Mutazioni nei siti di splicing

2. mutazioni in sequenze esoniche che alterano silencers ed enhancers esonici dello splicing.

3. mutazioni in sequenze introniche

4. mutazioni in sequenze introniche localizzate lontano dai siti di splicing.

Lo splicing è un fenomeno finemente regolato e controllato; ES: nella DMB la gravità del fenotipo

dipende dal mantenimento o meno della cornice di lettura dopo la mutazione di splicing: nella >

parte dei casi il frame è conservato per cui il fenotipo è+lieve. Può essere però persa una regione

importante della proteina, generando un fenotipo più grave.

Il fine macchinario dello splicesoma è regolato da una serie di interazioni di proteine che legano

sequenze esoniche ed introniche in grado di attivare o reprimere lo splicing(Le sequenze ESE

vengono riconosciute dalle proteine SR, serin-treonin), mutazioni in queste sequenze potrebbero

seriamente compromettere lo splicing. Studiando le proteine che intervengo in questo processo si

sono dedotte le sequenze che legano sul DNA e quindi è possibile, volendo, analizzarle in caso di

diagnosi in cui non si sono facilmente ritrovare le mutazioni causa.

SMA

Patologia a trasmissione autosomica recessiva. L’incidenza dei malati è di 1:10000, i portatori sono

1:50

Esistono due copie del gene SMN, e sono SMN 1 ed SMN2 che differiscono solo per 5 sostituzioni.

In corrispondenza dell’esone 7 SMN1 e 2 hanno un nt diverso che in SMN2 nn ha conseguenze

sulla traduzione ma provoca uno skipping esonico producendo una proteina tronca nella > parte dei

casi. La copia SMN2 è poco importante , infatti il 10% dei soggetti sani non ha SMN2. Il fenotipo

SMN1 è variabile e correla con il numero di copie di SMN1 presenti. Studi hanno evidenziato che

un soggetto che manca di SMN1 ha più copie della copia SMN2 per compensare. Questo vuol dire

che in assenza del gene SMN1, la presenza di una maggiore quantità di SMN2 attenua leggermente

la manifestazione fenotipica.

La causa della patologia è l’assenza di SMN1.

Un esempio di skipping esonico può essere fatto anche parlando del gene CFTR a livello dell’esone

12.

Al fine delle analisi di mutazioni estremamente importante è effettuare saggi in vitro. Se non

possiamo analizzare l’RNA, possiamo in alternativa costruire dei minigeni che facciamo esprimere

ad estratti nucleari tenendo conto della differente maturazione che avviene in tessuti differenti.

IMPRINTING

L'imprinting genomico è un processo che lascia nel nascituro un'impronta di diverso tipo nei geni

trasmessi dal genitore di sesso maschile ed in quelli trasmessi dal genitore di sesso femminile. Di

conseguenza, la prole che riceve geni marcati dalla madre sarà geneticamente diversa da quella che

riceve geni marcati dal padre.

Così come esistono due copie dei cromosomi, esistono due copie dei geni, una trasmessa dalla

madre (sul cromosoma materno) e una trasmessa dal padre (sul cromosoma paterno). Di solito viene

usata l’informazione contenuta in ambedue le copie geniche(espressione biallelica).

Alcuni geni vengono espressi solo se sono stati trasmessi dal padre, mentre altri vengono espressi

solo se vengono trasmessi dalla madre(espressione monoallelica dei geni o emizigosi funzionale). Il

fenomeno della espressione differenziale dipendente dal sesso del genitore di origine viene

chiamato imprinting. Alcuni cromosomi, sezioni di cromosomi o geni sono contrassegnati dal

marchio del genitore di origine. La marchiatura avviene mediante meccanismi tutt'oggi non del tutto

chiariti(ma molto probabilmente tutto si basa sulla metilazione delle isole CpG), in parte durante la

gametogenesi, per poi continuare durante la fecondazione della cellula uovo da parte dello

spermatozoo per poi rimanere constante per tutta la vita del soggetto.

L’imprinting viene rinnovato ad ogni generazione a seconda del sesso del soggetto, ovvero: durante

la gametogenesi nella fase precoce di maturazione l'imprinting viene cancellato e successivamente

ripristinato durante la fase tardiva nel gamete maturo in base al sesso (negli spermatozoi avviene +

precocemente che nell’oocita); quindi se il soggetto è maschio, ed il gene che prendiamo in

considerazione segue un "imprinting materno" (la copia materna è inattiva), i suoi spermatozoi, sia

se avranno ereditato la copia cromosomica materna che paterna, avranno il gene in questione NON

IMPRINTED (non metilato e quindi funzionante); viceversa se il soggetto è femmina i suoi oociti,

sia se avranno ereditato la copia cromosomica materna che paterna, avranno il gene in questione

IMPRINTED (metilato e quindi non funzionante). Questo evento è stato scoperto grazie allo studio

fatto su due sindromi: sindrome di Angelman e sindrome di Prader-Willi le quali sono causate della

mutazione dello stesso gene, ma gli effetti sono differenti a seconda che questo sia stato ereditato

dal padre o dalla madre.

Prima di parlare delle sindromi nominate , possiamo fare degli accenni ai tipi di imprinting che si

possono avere. L’imprinting avviene mediante il fenomeno della metilazione, una modificazione

post-replicazionale effettuata da metilasi in maniera sequenziale (la metilazione sul filamento

stampo guida la successiva metilazione sul filamento copia). Esiste anche un’attività di

demetilazione ad opera di specifiche demetilasi non ancora ben caratterizzate.

Possiamo avere metilazione del promotore(l’intero gene o geni sotto il controllo di quel promotore

vengono spenti) oppure viene metilato il gene specifico o parte di esso, in questo caso sarà spento

solo quello specifico gene. Si può verificare anche la metilazione differenziale di due isole CpG a

livello del promotore con la sintesi di un mRNA antisenso.

Elementi boundary: Abbiamo due geni H19 ed Igf2. se H19 non è metilato, sulle isole CpG si lega

una proteina che, una volt legata, recluta un repressore della trascrizione per cui il gene Igf2 non

sarà trascritto, mentre sarà regolarmente trascritto il gene H19, viceversa se H19 viene metilato

sulle isole CpG (regioni di metilazione differenziale DMRS), il legame della proteina e del

repressore non avviene per cui sarà trascritto Igf2 ma non sarà però trascritto H19. questo è un altro

esempio di come l’imprinting può avere effetti differenti, infatti ci sono evidenze che mostrano che

la copia inattiva del gene (quella imprinted) può non presentare alcuna metilazione mentre la copia

attiva potrebbe presentarla.

Come ho precedentemente detto che l’imprinting avvenuto alla gametogenesi viene mantenuto per

tutta la vita e durante il ciclo cellulare, nella fase S,le regioni imprinted vengono replicate in

maniera asincrona (la copia paterna è più veloce) e quando il DNA viene replicato ci sono degli

enzimi che riconoscono la presenza del gruppo metilico sullo stampo e lo riproduce esattamente sul

filamento neosintetizzato. Esistono anche delle metilasi de novo che aggiungono gruppi metilici

sulla base di specifici segnali ancora non ben caratterizzati. Quando in certe fasi il DNA deve essere

demetilato questo può avvenire in manieta passiva quando l’enzima che metila la copia non la

metila e può essere attiva se vengono coinvolte delle demetilasi.

Alterazione dell’imprinting:

1) DISOMIA UNIPARENTALE: un individuo eredita due alleli dallo stesso genitore; questo

può verificarsi per eventi di non corretta disgiunzione meiotica: uno zigote eredita 3 copie di

un dato gene, e mediante meccanismi di riparo uno dei tre viene eliminato. C’è una

probabilità su tre che vengano mantenuti due alleli dello stesso genitore, pertanto entrambi

con lo stesso assetto di imprinting. Nel caso in cui entrambe le copie sono imprinted, non si

avrà espressione del gene. Nel caso in cui entrambe le copie non sono imprinted, si avrà

eccesso di dosaggio genico.

2) DELEZIONI O MUTAZIONI di una regione genica IMPRINTED (repressa): in questo caso

non ci sono problemi

3) DELEZIONI O MUTAZIONI di una regione genica NON IMPRINTED (espressa): in

questo caso non si avrà espressione del gene

4) MUTAZIONI nelle ICR (regioni di controllo dell’imprinting): alterazione dell’imprinting di

più geni.

Gli effetti dell' imprinting appaiono in stadi precoci ed esplicano la loro azione sulla crescita e sul

comportamento. Anche gli incroci tra specie diverse suggeriscono che l' imprinting possa avere

effetti sulla crescita di diverse aree del corpo; basti pensare che nell' incrocio tra cavallo ed asino si

osservano chiare differenze a seconda se il cavallo è il padre ( mulo ) o la madre (bardotto).

1. Sindome di Prader- Willi: La sindrome di Prader Willi è una malattia genetica rara

caratterizzata dall'alterazione del cromosoma 15. La Prader-Willi è la più comune tra le

sindromi di microdelezione cromosomica. Avviene per due diverse cause accertate,

entrambe di tipo genetico:

Delezione da imprinting. Nella PWS il gene materno è silenziato perché sotto

imprinting, mentre quello paterno è deleto. Il gene in questione è del cromosoma 15,

nella regione 15q11-q13. In questa patologia viene quindi a mancare il contributo

paterno, e si avranno una serie di disturbi derivati dalla mancanza della/e proteina/e

da esso derivanti.

Disomia uniparentale fenomeno secondo il quale una coppia di cromosomi o parte di

essi derivano da uno solo dei due genitori. Durante la meiosi viene ereditata anche

una copia dell’altro genitore per cui si ha trisomia ,ed il terzo cromosoma viene

perso ed eliminato casualmente(potrebbe anche non essere perso). Nel caso della

sindrome di PW il cromosoma 15 non è più composto dalla parte materna più quella

paterna ma bensì da 2 parti materne, perdendo di conseguenza tutto il patrimonio

genetico di quello paterno mancante e mantenendo i due alleli materni entrambi

imprinted.

2. Sindrome di Angelman. È identica alla sindrome di Prader-Willi, il cromosoma è lo stesso ,

il gene è lo stesso, quello che cambia è la copia imprinted. In questo caso la copia paterna è

imprinted e la copia materna è deleta . I sintomi sono molto diversi rispetto alla sindrome di

Prader-Willi.

Ma come possiamo diagnosticare queste patologie? In entrambi i casi il gene coinvolto è SNRPN

sul cro 15q11-13 e codifica per SNR (small nuclear region). Nella sindrome di Prader-Willi è

presente solo l’allele materno (imprinted), nella sindrome di Angelman è presente solo l’allele

paterno

Analisi della metilazione: tale ricerca può essere effettuata in due differenti modi: il

primo è un sothern con frammenti precedentemente sottopsti ad enzimi di restrizione

sensibili alla metilazione, oppure possiamo fare anche una MLPA in cui avremo

l’amplificazione solo dei frammenti(sempre digeriti) che si appaiano con la sonda. Il

secondo metodo è l’MSPCR, che prevede un ciclo di PCR in cui avviene una

reazione chimica che converte le citosine in uracile (reazione di bisolfite con

bisolfite di sodio). Vengono trasformate solo le citosine che non sono metilate, tutte

quelle metilate,essendo protette dal metile , non saranno modificate. A questo ciclo

segue una PCR con primers appositi che avranno tutte le citosine modificate e che

amplificheranno solo dove è avvenuta la reazione di conversione. La PCR ci serve

appunto per vedere se la reazione di conversione è avvenuta e per la regione di

nostro interesse, di cui vogliamo raccogliere notizie, poi per analizzare dobbiamo

sequenziare. Il sequenziamento ci dirà quali C delle isole CpG , ovviamente, sono

metilate .

Ricerca delle STR in quella regione(per valutare se quel gene deriva da solo uno dei

due genitori);

Analisi dell’espressione di un gene;

FISH per valutare se ci sono delezioni , se ci sono solo due cromosomi oppure se c’è

una trisomia e altre aneuploidie.

MALATTIE DA ESPANSIONI

Si tratta di un cospicuo numero di patologie causate da ripetizioni nucleotidiche . Prima tali

patologie venivano , ma ancora oggi succede, definite patologie da espansioni di triplette, ma

sarebbe più adatto identificarle come patologie da espansione nucleotidiche poiché non sempre si

tratta di espansioni di triplette ma anche espansioni di 2 o 4 nt. Possono verificarsi sia nelle regioni

codificanti, dove sono generalmente in frame, che nelle regioni non codificanti in cui i nt ripetuti

possono essere anche meno o più di 3 Tali patologie sono caratterizzate da:

Instabilità mitotica o somatica: il numero dei nt espansi aumentano con il susseguirsi dei

cicli cellulari, e con l’età può aumentare il numero di ripetizioni e la gravità del fenotipo.

Una conseguenza di ciò è che esiste una popolazione di alleli che ha un numero di

ripetizioni in un intervallo (range) relativo a un certo fenotipo

Instabilità meiotica o germinale: il numero di nt espansi aumenta (anticipazione) o

diminuisce (contrazione) passando da una generazione alla successiva; questo accade perché

la presenza dell’espansione rende la regione genica instabile, cosa che non accade nella

regione genica wild type. L’anticipazione causa un’insorgenza più precoce e un fenotipo più

grave della malattia. Il fenomeno dell’anticipazione si verifica più frequentemente quando

l’espansione è stata trasmessa dal padre rispetto alla trasmissione materna. Fanno eccezioni

la Atassia di Fredrich, X fragile e distrofia miotonia si tipo II che vanno incontro al

fenomeno dell’anticipazione più facilmente se l’espansione in questione viene ereditata dalla

mamma anziché dal babbo;

Anticipazione o contrazione.

Il passaggio dallo stato di soggetto sano a quello di soggetto malato passa attraverso degli stati

intermedi. Infatti anche il soggetto perfettamente sano presenta un determinato numero di nt

espansi, ed il numero di espansioni è altamente polimorfico varia da soggetto a soggetto e da allele

ad allele. Tali espansioni sono però molto stabili e generalmente non si alterano. La cosa cambia

invece se consideriamo la fase di pre-mutazione che precede la condizione di Full Mutation. Nella

fase di pre-mutazione il soggetto non presenta il fenotipo per cui possiamo dire che l’individuo pre-

mutato è stabile mitoticamente ma instabile meioticamente nel senso che la sua progenie erediterà

una espanione instabile che potrebbe essere espansa ulteriormente e quindi manifestare il fenotipo

ereditato, fenotipo che il genitore non presentava, e lo potrà presentare in maniera più o meno grave

ma questo dipende dalla natura della espansione.

Il fenomeno dell’anticipazione si accompagna anche allo stato di Full Mutation, e questo accade

perché questo tipo di patologie possono anche rimanere silenti per gran parte della vita di un

soggetto, che tipo fino a 50-60 anni stava perfettamente bene e viveva tranquillamente nello stato di

pre-mutato o perfettamente sano ma improvvisamente qualcosa accade per cui l’espansione

fisiologica o la pre-mutazione diventano patologiche. Quindi a 60 anni il soggetto considerato sano

manifesta il fenotipo caratteristico di quella patologia da espansione, è chiaro ed intuitivo che in 60

anni questo signore avrà fatto dei figli che avranno ereditato l’espansione e che manifesteranno il

fenotipo più precocemente del genitore poiché ci vorranno meno divisioni mitotiche per accumulare

l’espansione causativa della patologia.

Per spiegare questi fenomeni( instablilità,anticipazione e contrazione) sono stati proposti vari

modelli, bene vediamoli ed analizziamoli insieme.

L’instabilità è dovuta a scivolamenti della polimerasi che mentre replica il DNA,

incontrando sequenze ripetute in tandem può scivolare. Questo si verifica molto più

frequentemente durante la sintesi del filamento ritardato, sul quale la replicazione procede a

passo con l’apertura della forcella di replicazione.

formazione di strutture secondarie che intralciano la Pol;

intervento di un elemento in trans. Si tratta di un enzima detto FEN1 (flap endonuclease1)

che digerisce le strutture a singolo filamento che si formano durante il processo di riparo del

DNA. Se si formano strutture secondarie del singolo filamento l’enzima non potrà agire

quindi non saranno agevolati i processi di riparo da questo consegue l’instabilità. Se

consideriamo esatto questo modello è chiaro che anche l’assenza di questo enzima avrà un

fenotipo patologico abbastanza simile a quello causato dalla espansione di nt;

Esiste una attività enzimatica funzionante durante la meiosi. L’enzima protagonista è DSB

(double strand breack) che rompe un singolo legame fosfodiesterico sui sul DNA a doppia

elica; su questi filamenti agisce una 5’-3’ esonucleasi che dal sito del taglio, procedendo in

direzione 5’-3’ digerisce il DNA. Se ci sono delle ripetizioni, i due estremi si appaiano e la

ligasi lega i frammenti. Risultato è la contrazione;

i due filamenti tagliati invadono, a livello della ripetizione dove c’è complementarietà, una

molecola di DNA intatta. Ne consegue un allungamento sequenza e quindi espansione.

Nel 1991 è stato identificato il gene responsabile della sindrome dell’X Fragile(FRAXA) causata

dall’espansione della tripletta CGG al 5’UTR del gene FMR presente sul cromosomaX. In seguito è

stato identificato anche il gene causa della Atrofia mucolo-spino-bulbare(SMBA) , la tripletta

espansa è CAG(stessa tripletta che viene espansa anche nella chorea di Hunghtinton), il gene è AR

e si trova anch’esso sull’X. L’ereditarietà delle patologie da espansioni di nt può essere autosomica

dominane o recessiva ed X –linked e si tratta di patologie abbastanza rare e caratteristiche di alcune

popolazioni.

SINDOME DELL’X FRAGILE

La ripetizione è CGG al 5’ UTR.

Espansioni che cadono nell’intervallo 6-44 non sono patologiche(è la normale espansione) e

sono stabili

Espansioni che cadono nell’intervallo 45-200 sono definite pre-mutazioni. Non viene

manifestato il fenotipo ma potrebbe essere manifestavo successivamente quando la sequenza

viene ulteriormente espansa. La espansione è abbastanza stabile mitoticamente ma non lo è

meioticamente.

Espansioni che cadono nell’intervallo >200 è la mutazione completa caratterizzata da alta

instabilità sia mitotica che meiotica e ovviamente viene mostrato anche il fenotipo malattia.

Espansioni che cadono nell’intervallo 45-54 vengono definite zona grigia. Una espansione

che presenta un certo grado di instabilità , presentano una bassa probabilità di sfociare in una

pre-mutazione nella progenie.

La proteina in questione è la proteina FMRP. Questa proteina è dotata di un duplice segnale, uno di

migrazione nucleare e uno di esporto nucleare, questo ha fatto ipotizzare che la proteina è coinvolta

nel trasporto tra nucleo e citoplasma, ed essendo anche dotata di una sequenza di legame all’RNA

quindi potrebbe essere coinvolta nel trasporto dell’RNA dal nucleo al citoplasma oltre che

intervenire nella sua maturazione e traduzione(tra i vari messaggeri la proteina lega anche l’RNA

che codifica per FMRP stessa).

Generalmente le regioni CGG espanse possono essere riconosciute da metilasi che metilano il gene

ed anche il promotore del gene. La proteina MeCP lega le regioni metilate e recluta il repressore Sin

3 che a sua volta recluta le HDA che deacetilano gli istoni favorendo l’addensamento della

cromatina che diventa inaccessibile alla trascrizione. Recentemente si è visto che soggetti con età

superiore ai 50 con atassia e tremori presentavano pre-mutazioni nel gene FMR-1. questa sindrome

è stata identificata come FXTAS . il 30% di soggetti con pre-mutazione hanno questa sindrome.

Anche donne con POF(menopausa precoce) presentavano pre-mutazioni . Quando abbiamo la

mutilazione completa, nel 95% dei casi il promotore è metilato, in caso di pre-mutazione il

promotore non è metilato quindi il messaggero viene trascritto, anzi è presente anche in maggiore

quantità in virtù del fatto che viene fatta meno proteina. La ridotta sintesi proteica può essere dovuta

a due cause:

Ridotta maturazione degli mRNA: alle sequenze CGG si possono legare proteine che

maturano l’mRNA e che quindi vengono sequestrate alla maturazione di altri mRNA.

Ridotta traduzione dovuta alla formazione di strutture secondarie dell’mRNA in

corrispondenza di queste sequenze ripetute.

DIAGNOSI di FRAXA

Dato che nel 95% dei casi di full mutation il promotore ed il gene sono metilati noi dobbiamo

andare a vedere lo stato di espansione e quello di mutilazione. Con un elettroforesi su gel possiamo

valutare i soggetti sani e quelli pre-mutati, però si è visto che la condizione per cui soggetti sani

presentavano pre-mutazioni o mutazioni complete non era raro e quind era meglio effettuare un

southern ( in caso di DM il southern si fa sempre perché le espansioni sono molto grandi quindi la

PCR fa solo da supporto)

SOUTHERN

Facciamo una doppia digestione . La prima con un enzima non sensibile alla metilazione che taglia

sempre ed è Hind III e la seconda digestione con un enzima sensibile alla metilazione che taglia

solo se non c’è la metilazione ed è EagI. Dall’azione di Hind III abbiamo un frammento di 5,2Kb,

dalla azione di EagI abbiamo un frammetno di 2,8Kb.

Partendo dall’assunto che la espansione cade in un gene che mappa sull’X abbiamo che i maschi

sono emizigoti e le donne hanno due copie dell’X di cui una inattivata. Detto questo analizziamo i

vari casi.

Maschio normale. Vediamo il frammento di 2,8Kb;

Femmina normale. Vediamo un frammento di 2,8Kb, derivato dall’X attivo, ed un

frammento di 5,2 derivante dall’X metilato a causa dell’inattivazione;

Maschio pre-mutato. Frammento compreso tra 2,8 e 3,4 Kb;

Maschio mutato metilato. Frammento > 5,2Kb

Femmina pre-mutata non metilata. Frammento di 2,8Kb normale, framm 5,2 inattivato

normale, fram compreso tra 2,8 e 3,4 Kb premutato, framm 5,2<x<5,8 premutato inattivato

Femmina mutata metilata. Frammento di 2,8 normale, frammento 5,2 inattivato normale,

frammento > 5,2Kb espanso metilato

Ci sono delle alterazioni allo schema generale.

Mosaicismo di metilazione : cellule con la mutazione metilata e cellule con la mutazione

non-metilata;

Mosaicismo di espansione: certe con espansioni maggiori e cellule con espansioni più

contenute (tutte permutazioni)

Mosaicismo pre-mutazione non metilato + espansione metilata;

Inattivazione casuale dell’X nelle donne. Due sorelle con fenotipo differente sono state

studiate. Una aveva un fenotipo molto grave l’altre meno. Si è visto che una aveva una

espansione di 650 e l’altra di 480, non è una grande differenza o cmq un differenza da

spiegare un fenotipo tanto differente. Approfondendo lo studio si vide che la sorella con il

fenotipo più grave presentava l’allele normale inattivato , mentre l’altra sorella aveva per il

70% inattivato l’allele sano ma per il 30% aveva inattivato l’allele malato quindi per il 30%

riusciva a fare la proteina.

DIAGNOSI PRENATALE.

A 10 settimane lo stato di metilazione dovrebbe essere completo allora si sono valutati i livelli di

proteina di soggetti con espansione completa e normali e si è visto che:

A 10.5 settimane c’è una uguale quantità di proteina in entrambe i soggetti;

A11.5 settimane il livello di proteina è intermedio;

A 12.5.settimane la proteina è assente.

Questo vuol dire che per la diagnosi prenatale non possiamo analizzare i villi coriali; che sono

stati analizzati in questo esperimento, ma direttamente gli amniociti.

DISTROFIA MIOTONICA DI TIPO I (sindrome di Steinert)

Frequenza di 1/8000

Trasmissione autosomica dominate

Insorgenza tardiva

La sintomatologia è associata prevalentemente a contrazione prolungata (miotonia) che

precede debolezza muscolare

Disordine multisistemico(facies caratteristica, cataratta, ipogonadismo, problemi cardiaci,

disturbi al SNC, debolezza uterina, diabete nel 5% dei casi ecc.)

L’espansione è di una tripletta CTG al 3’ UTR

Si tratta di una serin-protein-chinasi sul cro 19 DMPK coinvolta nella miogenesi e nella

regolazione della contrazione; l’aploinsufficienza sembra essere coinvolta nella malattia

Alterato splicing di alcuni mRNA(recettore dell’insulina, troponina T cardiaca e muscolare,

pompa Ca2+

e SARCA2, recettore della rianodina): questi geni normalmente fanno splicing

alternativo solo nel passaggio dall’età neonatale ad adulta. Nei pazienti DM1 fanno sempre

splicing alternativo

Ridotto differenziamento delle cellule muscolari.

Quando si sono studiati i soggetti affetti da questo tipo di patologia , che tra l’altro presentavano

anche aploinsufficienza di geni adiacenti come DMAHP (SIX5: responsabile del dimorfismo

facciale e ritardo mentale) e 5P , si è visto che le cause erano troppo poche per spiegare un fenotipo

del genere allora si ipotizzò che la tripletta CTG avesse un effetto tossico-trans-dominante sul

metabolismo dell’RNA .

Per quanto riguarda la DISTOFIA MIOTONICA DI TIPO II si sa ancora poco; quello che si sa è

che è coinvolto un gene codificante per una proteina con un dominio ZINC finger che in un introne

presenta la sequenza CCTG espansa.

Alterato splicing di alcuni mRNA (canale del Cl, proteina del sarcomero)

L’ inadeguata maturazione degli mRNA è un caratteristica comune alle due patologie e si è visto

che i trascritti contenenti lunghe ripetizioni possono essere accumulati in foci nucleari causa di

tossicità. Inoltre esistono delle proteine che legano la sequenza CUG a livello dell’mRNA. Questo

vuol dire che molti messaggeri con questa sequenza espansa sequestrano, legandole, proteine che

sono coinvolte nella maturazione di altri mRNA quindi ne consegue che questi non possono essere

maturati. Prova a favore di questo modello è l’assenza di foci nucleari quando la sequenza CTG

viene cambiata.

DIAGNOSI

Southern accompagnato alla PCR

Tratti di poliQ

La Q sta per glutamina codificata dal codone CAG, che viene espanso nella corea di huntington e

anche nella atrofia muscolo-spino-bulbare. Quando si sono studiate queste patologie ci si è chiesti

se basta l’espansione di PoliQ per avere la manifestazione fenotipica e per fare questo si sono

proposti alcuno modelli sperimentali.

1. H-desease e SCA1 models: si tratta di topi transgenici in cui sono state introdotte delle

ripetizioni per valutare come, se e quando manifestavano la patologia. Da questi

esperimento si è visto che l’espansione CAG in 146 ripetizioni si aveva un fenotipo simile

all’HD umano ma non si verificava la perdita neuronale.

2. Inserzione delle ripetizioni CAG sotto il controllo del promotore del citomegalovirus, il

fenotipo veniva espresso in vari tessuti e i topini manifestavano anche i disturbi neuronali.

3. Gene HD con ripetizioni sotto il controllo di un promotore specifico, anche in questo caso

c’è la neurodegenerazione.

Alla fine è possibile dire che l’espansione del codone CAG e quindi il tratto di poliQ è causa

della patologia, ma la domanda successiva è PERCHE’?

Per risp a questa seconda domanda sono stati effettuati altri studi si modelli murini e sul cervello

di defunti affetti da HD e SCA1,2,3,6,7 ed SBMA. In questi modelli si sono riscontrati:

Aggregati citoplasmatici,

Aggregati con fattori di trascrizione che legano il poliQ e con la TATA Box,

Se la proteina viene trasportata nel citoplasma si formano gli aggregati ma non si ha lo

stesso danno perché non ci sono le interazioni che causano la patologia. Ex topi

transgenici con Ataxina 1 (SCA1)privi della seuenza NLS, che ne consente l’ingresso

nel nucleo, non manifestano il fenotipo,

Elevata ubiquitinazione ed eliminazione in soggetti con HD.

Riassumendo tutte le informazioni trovate possiamo concludere che viene prodotta una proteina

anomala che quindi verrà eliminata ma ci sono delle proteine che resistono e che possono formare

degli aggregati con fattori trascrizionali che poi legano il DNA. Le proteine che formano aggregati

sono proteine che svolgono funzioni molto importanti ed inoltre la stessa degradazione esagerata di

queste proteine occupa il proteasoma a tal punto da non lasciargli il tempo e lo spazio per degradare

proteine che per svariati motivi non vengono correttamente ripiegate.

Tratti di poliA

Queste espansioni causano patologie con anomalie dello sviluppo e della crescita. Molto spesso le

espansioni si trovano in geni che codificano per F.trascrizionali e le espansioni sono molto più

contenute vanno da 17 a 29, quindi anche in caso di Full Mutation abbiamo una espansione molto

più contenuta. La causa dell’espansione è una ricombinazione ineguale e questo spiega le ridotte

dimensioni dell’espansione e non vengono riportati fenomeni di anticipazione o contrazione. Le

mutazioni possono anche cadere in regioni non codificanti e causare patologie multi- sistemiche la

cui gravità dipende dalla grandezza dell’espansione