Immunodiagnostica e Diagnostica Molecolare attualità e prospettive

Prof.ssa Anna Onofri

Liceo Scientifico «Iris Versari»

Maggio 2015

DATI INFORMAZIONE CONOSCENZA

La Diagnostica di Laboratorio permette di trasformare i dati di laboratorio in informazioni utile dal punto di vista medico e

quindi in conoscenza dello stato di salute del paziente

Impiego dei test diagnostici

DIAGNOSI

• Preclinica - Screening

• Clinica -

MONITORAGGIO TERAPEUTICO

• Verifica livelli di efficacia farmaco

• Personalizzazione terapia

VERIFICA GUARIGIONE

• Rientro dei valori negli intervalli di riferimento

I test diagnostici in vitro (IVD) sono test non invasivi utilizzati su campioni biologici (ad esempio, su un campione di sangue, di urina o di tessuto) al fine di stabilire lo stato di salute di una persona

I limiti : sensibilità e specificità

La sensibilità di un test è la capacità del test di identificare i soggetti che presentano la malattia e corrisponde alla proporzione di soggetti realmente ammalati identificati come tali dal test.

La specificità di un test è la capacità del test di identificare i soggetti che non presentano la malattia e corrisponde alla proporzione di soggetti realmente sani che sono identificati come tali dal test.

Test molto sensibili sono poco specifici (possono più facilmente produrre falsi positivi). Viceversa, test molto specifici sono in generale poco sensibili (possono più facilmente produrre falsi negativi)

Evoluzione della Diagnostica di laboratorio

• Seconda metà dell’800 «Rivoluzione batteriologica»

• Strumenti: termometro e sfigmomanometro (Riva-Rocci 1896), RX (Rontgen 1895) .

• «identificazione chimica della malattia» Thudicum 1867: analisi qualitative (albumina, glucosio e urea nelle urine: 1815-1848, glicemia 1855

• Fine ‘800: analisi quantitative «Il segno è il risultato di una misura e può essere espresso con un numero»

• Tra il 1883 e il 1895 nascono i primi Laboratori di Analisi Ospedalieri

La microbiologia medica è stata la scienza sperimentale che più ha influenzato la medicina, stimolando la nascita di nuovi ambiti di ricerca con importanti implicazioni pratiche, come l’immunologia e la chimica farmaceutica.

• Inizi 1900 • Evoluzione della batteriologia: lotta alla

sifilide e alla tubercolosi (Pasteur, Koch, Fleming)

• Scoperta gruppi sanguigni (1900) e Rh (1940)

• Terapia antibiotica

• Metà 1900 • Patologie metabolico-degenerative

• Anni ‘80 • Virus HIV

«Rivoluzione Terapeutica»

ASPETTATIVA DI VITA SVILUPPO DIAGNOSTICA

Ricerca in Fluidi Biologici

Di «una molecola»

Connessa ad una patologia

Diagnostica in vitro

Sangue Plasma

Altro (Elementi/ altre Molecole)

Acidi Nucleici Proteine

Urine Liquor

Immunodiagnostica Diagnostica Molecolare Chimica Clinica

Ricerca di antigeni o anticorpi

Ricerca di Acidi Nucleici

Infettivologia, Oncologia,

Endocrinologia, Autoimmunità, Cardiologia, ecc

Infettivologia, Oncologia

Ricerca, con reazioni Chimiche, di elettroliti, glucosio, colesterolo, enzimi, ecc

IMMUNODIAGNOSTICA

Analisi Qualitativa e/o Quantitativa di Proteine (o altre molecole) nei fluidi biologici tramite reazioni antigene-anticorpo Gli analiti possono essere: ANTIGENI ANTICORPI

• Infettivologia: ricerca di anticorpi, IgG o IgM rivolti verso particolari antigeni batterici o virali

• Oncologia: ricerca di Antigeni tumore specifici (Marcatori Tumorali)

• Endocrinologia : ricerca di ormoni • Autoimmunità: ricerca di antigeni

o autoanticorpi • Cardiologia : ricerca di antigeni

cardiaci • Screening Tossicologia • Allergologia

• 1975: G. Köhler e C. Milstein mettono a punto la tecnica per produrre gli ANTICORPI MONOCLONALI (Nobel 1984)

• E’ stato così realizzato l'ideale degli immunologi, quello di poter produrre quantità illimitate di anticorpi identici con specificità predeterminata. specificità di legame

la loro omogeneità

l'illimitata possibilità di produzione.

IMMUNODIAGNOSTICA

ANTICORPI MONOCLONALI

Impiego degli Anticorpi Monoclonali

DIAGNOSI

TERAPIA

Rendono la cellula più visibile al sistema

immunitario

Bloccano i fattori di crescita

Impediscono la formazione di nuovi vasi

Radioimmunoterapia

DIFFERENTE «LABELLING» ANTICORPO

RICERCA ANTICORPI

RICERCA ANTIGENI

125I

Enzima Fluoroforo Luminoforo

ANNI ‘90 : TECNICHE E.L.I.S.A.

ANNI ‘80 : TECNICHE R.I.A.

ANNI 2000 : F.I.A./C.L.I.A.

1° risultato: 3-12h Throughput : 25test/h

1° risultato: 3-4 h Throughput : 90-180 test/h

1° risultato30-40’ Throughput : 200 test/h

…Qualche esempio la diagnostica dell’HIV

Le analisi per la diagnosi di HIV sono principalmente: 1. La ricerca degli anticorpi anti-HIV IgG/IgM (3° Gen) gp120/gp160/gp41 HIV1 gp 36, gp 105 HIV2 Test di 4° generazione «combo» HIV1/2 + ricerca ag p24 2. Il test di conferma o di Western Blot gp120/gp41/gp17/gp31/gp105/gp24/gp36 3. I test di biologia molecolare RNA virale (PCR real time) nel plasma DNA provirale nei linfociti 4. Il conteggio dei linfociti CD4 ("helper") e CD8 ("suppressor").

Anti HIV 3° Gen Anti HIV 2° Gen Western Blot

TEST HIV 4° Gen «COMBO» Ab + Ag

Dicembre 2014

• Test di screening (4° gen) con conferma dei positivi western blot

• Concentrazione di HIV RNA Virale ( anche come monitoraggio terapia), espressa in copie/ml ed effettuata con PCR. Neg < 50 copie/ml

La Diagnostica Molecolare permette una diagnosi durante la fase finestra riducendo il numero di falsi negativi e riducendo il rischio di infezioni

DIAGNOSTICA MOLECOLARE

La Diagnostica Molecolare si basa su una tecnologia che consente di diagnosticare uno stato clinico mediante la rilevazione di sequenze di RNA o DNA specifiche (gli acidi nucleici) nei fluidi biologici dei pazienti o nelle loro cellule patologiche.

I principali settori di applicazione sono attualmente la MICROBIOLOGIA e l’ONCOLOGIA

Il test di Diagnostica Molecolare viene eseguito mediante 3 fasi principali:

1. ESTRAZIONE : il reagente, specificamente creato in laboratorio, è in grado di

estrarre DNA e RNA di virus e cellule tumorali di interesse;

2. AMPLIFICAZIONE: è il processo che permette di “moltiplicare” gli acidi nucleici

precedentemente estratti, e consentire agli strumenti di leggere le molecole di

DNA e RNA;

3. DIAGNOSI: una volta rilevato il virus o l’agente tumorale nel fluido del

paziente, lo strumento rileva le molecole anormali per ottenere la diagnosi.

IMMUNODIAGNOSTICA

ANTICORPI

DIAGNOSTICA MOLECOLARE

DNA/RNA AMPLIFICAZIONE

Le Parole Chiave

Tecniche di Amplificazione L'amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico

necessaria per le successive applicazioni.

P.C.R.

• DNA Template

• dNTP

• Primers

• Taq Pol

• Buffer

• Termociclatore

• Fasi post PCR: elettroforesi

• Qualitativa

REAL TIME P.C.R

• DNA Template • dNTP • Primers • Taq Pol • Buffer • Fluoroforo (Sybr-green) • Termociclatore con lettore

fluorescenza + SW dedicato • Quantitativa

Real Time PCR : La Fluorescenza è proporzionale al prodotto di PCR ottenuto: • Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione • Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio • Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer • Possibilità di analizzare molti campioni: automatizzabile • Risultati molto rapidi : 30 – 40’

……UN ESEMPIO CONCRETO

Il Sistema Genexpert

• GeneXpert è un sistema integrato che automatizza i tre processi

necessari per eseguire una reazione di Real-Time PCR:

• preparazione del campione

• amplificazione

• rilevamento della sequenza target.

• Il modulo contiene i componenti necessari il controllo delle

temperature di e un fluorimetro.

• La cartuccia (monouso) è costituita da camere di reazione dove

sono contenuti i reagenti liofilizzati e i filtri necessari

all’estrazione. Il campione così preparato è spinto in un’area della

cartuccia dove avviene la reazione di amplificazione e il

rilevamento del target.

RISPOSTA RAPIDA (ENTRO 60’) CONTRO I DUE TRE GG DEI METODI COLTURALI.

ANTRACE MRSA MICOBATTERIO TUBERCOLOSI ENTEROVIRUS

…Applicazioni in campo oncologico: ONCOLOGIA MOLECOLARE

diagnosi precoci di alcuni tumori

individuare stati di predisposizione ereditaria

individuare micrometastasi e/o MMR (Malattia Minima Residua)

individuare target prognostici

individuare target predittivi di terapie mirate

Perché in un organismo si sviluppa un tumore? • La proliferazione incontrollata

delle cellule dipende da alterazioni dei geni, dette mutazioni.

• Alcune di queste mutazioni sono ereditarie , ma la maggior parte sono provocate da fattori esterni, indotti dai nostri comportamenti o dall'ambiente in cui viviamo.

• Occorre che gli errori si accumulino su diversi fronti perché il tumore possa cominciare a svilupparsi.

Quali tipi di Geni possono essere alla base del cancro? oncogéni (o geni oncògeni)

geni oncosoppressori

geni coinvolti nel cosiddetto "suicidio cellulare" (o apoptosi)

geni implicati nei meccanismi di riparazione del DNA

altri geni

Studi degli ultimi anni hanno inoltre messo in rilievo l'importanza per la genesi del cancro di piccole molecole regolatorie dette microRNA (miRNA), frammenti di acidi nucleici che modulano l'espressione di diversi geni.

Sommare l’importanza del «microambiente»

TUMORI SOLIDI

ONCOEMATOLOGIA La Leucemia Mieloide Cronica

(CML) è stata la prima neoplasia

ematologica per cui si è riscontrata

la correlazione con una anomalia

citogenetico-molecolare,

rappresentata dal cromosoma

Philadelphia (Ph).

Dalla Diagnosi……..

….alla Terapia

Le malattie nelle quali si applica di routine sono 1) le leucemie acute 2) la leucemia mieloide cronica 3) le malattie linfoproliferative croniche.

Nella diagnostica onco-ematologica le tecniche di biologia molecolare sono divenute di complemento alle tecniche di morfologia, immunologia e citogenetica.

L’identificazione degli eventi molecolari di una patologia ematologica, permettono di: - definire differenti sottotipi di leucemia o linfoma con caratteristiche cliniche ben definite ed una prevedibile risposta alla terapia. - riconoscere il target (bersaglio) della lesione molecolare per indirizzare nuove terapie mirate (ad es. immunoterapia).

Microarray/Macroarray: chip innovativi!

• Gli array si basano sul principio che due filamenti di DNA a singola elica possono rinaturarsi quando riconoscono regioni complementari alla loro, formando molecole ibride.

permette di esaminare in parallelo, in maniera veloce ed economica, l’intero genoma di un organismo o la totalità dei suoi prodotti su una singola lastrina di vetro o di silicio, un chip.

• I microarray sono usati principalmente in due ambiti tecnologici:

(a) per determinare il profilo di espressione genica di un tessuto o un organismo, cioè misurare la quantità dei trascritti dei diversi geni espressi in un certo momento in un campione biologico;

(b) per identificare la presenza di specifiche sequenze geniche e di alterazioni e mutazioni di geni in un campione biologico.

Il Sequenziamento genico: il futuro a portata di mano (Next generation sequencing, Ngs)

Questa metodica consente di analizzare contemporaneamente tanti geni nello

stesso individuo, abbattendo tempi e costi della diagnosi genetica; può

addirittura permettere di analizzare l'intera porzione codificante del nostro

genoma (praticamente tutti i nostri geni, cioè l''esoma') nei pazienti con malattia

genetica che rimangono senza una diagnosi, così da arrivare a identificare il difetto

molecolare alla base della loro patologia".

Il passato e il

futuro del

Sequenziamento

Cosa significa Sequenziare? • DNA: Acido

Desossiribonucleico

• Unità di base sono i Nucleotidi: A,T,C,G

ESEMPIO

• LEGO ------- LEGGO

• LEGO ------- _EGO

• LEGO ------- LAGO

la Next Generation Sequencing si caratterizza per: 1. Preparazione della sequencing library (frammentazione e immobilizzazione del DNA) 2. Amplificazione 3. Sequenziamento (per sintesi)

Il processo di semiconductor sequencing

Le quattro basi vengono aggiunte una alla volta ai micropozzetti. Ogni volta che la TAQ polimerasi forma un legame fosfodiesterico viene rilasciato un protone. Il chip possiede un rilevatore sensibile ai cambiamenti di pH.

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Next Generation Sequencing

Il principale vantaggio è la possibilità tecnica di produrre un volume enorme di dati a costi estremamente più bassi ed in tempi estremamente più rapidi

Tariffario Regione Lombardia

Quale sequenziamento scegliere?

1. WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS) «lettura» dell’intero genoma

2. EXOME SEQUENCING «lettura» limitata alle porzioni trascritte (<2%)

Che cosa permette di scoprire esattamente un test genetico tramite sequenziamento del genoma

la diagnosi di malattie rare, laddove il gene sia già conosciuto;

permette di calcolare il rischio genetico di alcune malattie complesse che una persona potrebbe sviluppare, quali il

diabete o le malattie cardiovascolari.

permette in alcuni casi di personalizzare la terapia di un paziente, somministrando i farmaci giusti nella maniera più

mirata

Ormai è “di moda” parlare di lettura del DNA. Ci sono i limiti o i rischi correlati?

Per alcune malattie genetiche sono note le mutazioni responsabili della patologia e il numero continua ad aumentare.

Nel caso delle malattie complesse sono l’ambiente (dieta, stile di vita, qualità dell’aria, ecc.) e il genoma a contribuire,

entrambi, allo sviluppo di una malattia. Quindi la propensione, rilevata tramite un test genetico, per una malattia

complessa va interpretata come un “avviso” e non come una diagnosi.

Ci sono altri centri in Italia che sequenziano il DNA?

Sì, a Milano, Verona, Udine e Cagliari

Quanto costa sequenziare il genoma?

Intorno agli 8.000 €. Ci sono inoltre test specifici (per esempio il sequenziamento del solo “esoma”, cioè dei geni

contenuti nel genoma) che costano già meno di 1.000 €

Può un privato cittadino chiedere la lettura completa del suo DNA?

Sì, in Italia esistono centri specializzati che permettono l’analisi/sequenziamento del genoma umano per conoscere il

proprio patrimonio genetico, indipendentemente da specifiche patologie, Al momento al San Raffaele è possibile

richiederlo solo per diagnosi, tramite impegnativa del medico curante o medico genetista.

Quanto tempo si impiega?

Circa 90 giorni. La lettura del DNA in sé dura 10 giorni ma ci sono i tempi di estrazione e preparazione del DNA prima

dell’avvio della lettura e successivamente i tempi legati all’analisi e interpretazione dei dati.

Le prospettive: la FARMACOGENOMICA • La farmacogenomica (spesso chiamata

anche farmacogenetica) è una disciplina che studia l'interazione fra genetica e farmaco.

• scopo principale è quello di caratterizzare varianti genetiche (dette anche marcatori farmacogenomici o farmacogenetici) al fine di supportare il medico (1) nella scelta del farmaco e (2) nell’aggiustamento della dose. La farmacogenomica è parte della cosiddetta medicina personalizzata

La personalizzazione della Terapia: Tailored Therapy

Grazie