DIAGNOSTICA PATOLOGICA E MOLECOLARE

ISABELLA CASTELLANODipartimento di Scienze Mediche

Università di Torino

Anatomia ed Istopatologica Diagnostica e da ScreeningCittà della Salute e delle Scienza, Torino

DIAGNOSTICA PATOLOGICA E MOLECOLARE

RUOLO DELL’ANATOMIA PATOLOGICA

1) FARE LA DIAGNOSI: DARE NOME E COGNOME AD UNA PATOLOGIA

2) STABILIRE I FATTORI PROGNOSTICI: INDICANO L’EVOLUZIONE DELLA PATOLOGIA INDIPENDENTEMENTE DAL TRATTAMENTO

3) STABILIRE I FATTORI PREDITTIVI: INDICANO COME E SE UNA PATOLOGIA RISPONDERA’ AD UN TRATTAMENTO

CLINICA

LINGUAGGIO COMUNE

FORMULATO CON CHIAREZZA DA CHI ESPONE

COMPRESO DA CHI LO RICEVE

BIOLOGIA CELLULARE

IL RUOLO DELL’ANATOMO-PATOLOGO….

DIAGNOSIPROGNOSI PREDITTIVITA’

REFERTO ANATOMO-PATOLOGICO

POTENZIALE EVOLUTIVO O NO?SE SI’ E’ DA TRATTARE A LIVELLO LOCALE (CHIRURGIA/RT) O SISTEMICO?

IERI/OGGI

LESIONE DA OPERARE?SE Sì COME LA OPERO?

OGGI/DOMANI

DE-ESCALATIONDAL MASSIMO TOLLERABILE AL MINIMO EFFICACE

(Prof Veronesi)

DA…..classificazione delle malattie esclusivamente dal punto di vista morfologico

A,,,,,Definizione di biomarcatori, di alterazioni geniche o di marcatori presenti nei tessuti patologici, che possono essere indispensabili per l’accurata impostazione di terapie mirate a bersaglio molecolare (target therapy).

Il cambiamento in anatomia patologica:

CNS Tumors Workflow (WHO 2016)

Histology & IHC

DNA methylation-based

classificationtNGS

Integrated report

Clinicians (neuro-oncologist,

neurosurgeon,…)

Preliminary report

American Joint Committee on Cancer (AJCC)

Gennaio 2018 MOLTI CAMBIAMENTI

TNM VIII edizione

CARICO TUMORALE

TIPO DI CARICO TUMORALE

TRANSIZIONE VERSO MEDICINA PERSONALIZZATA

La corretta gestione del tessuto diventa prioritaria per garantire :

1)una diagnosi corretta e completa2)la sua custodia nel tempo per assolvere ad eventuali

richieste del paziente che necessita del preparato per ulteriori analisi

Standardizzare le procedure per…. i pazienti

•Dr. Compton, Director of the National Cancer Inst. Office of Biorepositories and Biospecimen Research “billions of dollars have been wasted in the past because researchers developing biomarkers supposed to be predictive of cancer and responses to therapies relied on tissue samples that were utterly useless: tissue had been subjected to careless handling and storage and sampling procedure were missing, so that results were not reproducible”.

Standardizzare le procedure per….la ricerca

STANDARDIZZAZIONE

PRE-ANALITICA(tutte le fasi che precedono l’analisi al microscopio )

ANALITICA(le analisi al microscopio)

temperatura (ischemia calda, ischemia fredda)/fissazione/tempo

CONTROLLI DI QUALITA’

Dedicated Working Group on:

1.Tracking2.Collection3.Transfer 4.Preservation5.Archival

… of tissues and cells for diagnostic analyses Guidelines

Ministry of Health

Pathology Pathology LabLab

SurgicalSurgicalTheaterTheater

GrossingGrossing

Paraffin Paraffin embeddingembedding

SectioningSectioning StainingStaining

FixationFixation

ProcessingProcessing

Anatomia Patologica: procedure pre-analitiche

(tutto ciò che succede prima diagnosi al microscopio)

• VARIABILE «UMANA»• TEMPO• TEMPERATURA• FISSAZIONE

VARIBILI PRE-ANALITICHE CHE INFLUENZANO I DATI ISTOPATOLOGICI E MOLECOLARI

• VARIABILE «UMANA»• TEMPO• TEMPERATURA• FISSAZIONE

VARIBILI PRE-ANALITICHE CHE INFLUENZANO I DATI ISTOPATOLOGICI E MOLECOLARI

Pathology Pathology LabLab

GrossingGrossing

Paraffin Paraffin embeddingembedding

SectioningSectioning StainingStaining

FixationFixation

ProcessingProcessing

SurgicalSurgicalTheaterTheater

Pre-analytical procedures affectedby human activities

• VARIABILE «UMANA»• TEMPO• TEMPERATURA• FISSAZIONE

VARIBILI PRE-ANALITICHE CHE INFLUENZANO I DATI ISTOPATOLOGICI E MOLECOLARI

Warm Ischemic Time:Intervallo tra la legatura dell’arteria e rimozione del tessuto dal paziente. Può variare in base a: Complessità/modalità dell’interventoAbilità del chirurgoIl tessuto è vivo, reattivo e subisce I processi metabolici legati all’ipossia

JNCI, Vol. 103, Issue 24 | December 21, 2011

Intervallo tra la rimozione del tessuto dal paziente e l’incisione per la sua adeguata fissazione

Cold Ischemic Time:

BMC Cancer. 2008 Sep 30;8:277.

J Clin Oncol. 2006 Aug 10;24(23):3763-70.

Esistono geni differenzialmente espressi prima e dopo il trattamento chirurgico

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18826606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18826606http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18826606

It is clear that unless detailed tissue-handling protocols are in place, misleading results may be obtained.

Histopathology 2010

Cold ischemia time and immunohistochemistry

JCO 2010

Preanalytic standardization:

time from tissue acquisition (defined as the time that the tissue is handed from the surgical field) to fixation should be as short as possible and must be recorded. The time from tumor removal to fixation should be kept to1 hour to comply with these recommendations. The pathologist should effectively communicate this priority to all membersof the breast care management team so processes are put in place to make sure these times are routinely recorded.It is the responsibility of the surgeon and operating room staff or the radiologist and his/her staff obtaining the specimen to document the collection time, and it is the responsibility of the pathologist and laboratory staff to documentthe fixation start time.

if tumor comes from remote location, it should be bisected through the tumor on removal and sent to the laboratory immersed in a sufficient volume of NBF

• VARIABILE «UMANA»• TEMPO• TEMPERATURA• FISSAZIONE

VARIBILI PRE-ANALITICHE CHE INFLUENZANO I DATI ISTOPATOLOGICI E MOLECOLARI

JCO 2010

Preanalytic standardization:

Sample slicing at 5-mm intervals after appropriate gross inspection and margins designation

type of fixative. Only 10% NBF should be used as the fixative for breast tissue specimens. Higher or lower concentrations of NBF are not acceptable

duration of tissue fixation. Breast tissue specimens must be fixed in 10% NBF for no less than 6 hours and for not more than 72 hours before processing

STANDARDIZZAZIONE

PRE-ANALITICA(tutte le fasi che precedono l’analisi al microscopio )

ANALITICA(le analisi al microscopio)

temperatura (ischemia calda, ischemia fredda)/fissazione/tempo

CONTROLLI DI QUALITA’

Ematossilina-eosina

TUBULARI, MUCINOSI E PAPILLARI SE

IMMUNOISTOCHIMICA

APPLICAZIONI DELL’IMMUNOISTOCHIMICA

DIAGNOSI-ORIGINE DI UNA NEOPLASIA-TIPO DI NEOPLASIA

PROGNOSI

PREDITTIVITA’

STADIAZIONE

L'immunoistochimica da “ Prodotto artigianale “ a “Prodotto industriale”

Concetto generale di standardizzazione di una proceduraRendere uniforme per garantire la riproducibilità del risultato1) La RIDUZIONE2) La FISSAZIONE

E' importante che lo spessore del campione non superi i 3 mm per favorire la fissazione omogenea ed evitare che processi degenerativi entrino in azione prima del fissativo.

L'immunoistochimica da “ Prodotto artigianale “ a “Prodotto industriale”Concetto generale di standardizzazione di una proceduraRendere uniforme per garantire la riproducibilità del risultato

1) La RIDUZIONE2) La FISSAZIONE3) ANTICORPO PRIMARIO

UTILIZZO DI DETERMINATI CLONI ANTICORPALI (SOLO QUELLI PREVISTI DALLE RACCOMANDAZIONI!)SPECIFICATI NEL REFERTO SE SERVONO PER IL TRATTAMENTO

L'immunoistochimica da “ Prodotto artigianale “ a “Prodotto industriale”Concetto generale di standardizzazione di una proceduraRendere uniforme per garantire la riproducibilità del risultato

PDL1il checkpoint PD-1/PD-L1 inibisce l'attivazione delle cellule del sistema immunitario e viene sfruttato dalle cellule tumorali per sfuggire al sistema immunitario.Farmaci che inibiscono il checkpoint PD-1 inibiscono questi pathway e ripristinano l'attività antitumorale delle cellule T.

PD-1 molecola espressa su T CD8-CD4,B e NK;

Ma : 1) il clone anticorpale utilizzato per il carcinoma del polmone non è lo stesso di quello approvato per il tumore della mammella2) La positività anticorpale riguarda cellule diverse: epiteliali per il polmone e infiammatorie per la mammella

APPLICAZIONI DELLA FISH SU TUMORI SOLIDI

CARCINOMA MAMMARIO :amplificazione di HER2

OLIGODENDROGLIOMA:

TUMORI DEL POLMONE:Riarrangiamenti del gene ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase)Traslocazioni del gene ROS1 e RET

MELANOMA:CCND1, RREB1, MYB

PREDITTIVO: TERAPIA CON FARMACI ANTI-HER2

DIAGNOSIPROGNOSI: AUMENTO DELLA SOPRAVVIVENZAPREDITTIVITA’: MIGLIOR RISPOSTA AL TRATTAMENTO CHEMIOTERAPICO

SARCOMI: DIAGNOSILIPOSARCOMA: MDM2 (amplificazione)SINOVIAL SARCOMA (traslocazione di SYT)SARCOMA DI EWING (traslocazione cromosoma 11:22)LIPOSARCOMA MIXOIDE (traslocazione cromosoma 12:16)

CARCINOMA GASTRICO: amplificazione di HER2

co-delezione di 1p19q

PREDITTIVO: TERAPIA CON FARMACI ANTI-HER2

PREDITTIVITA’: RISPOSTA AL TRATTAMENTO

DIAGNOSI

LA metodica FISH si basano sull’ibridizzazione di sequenze target del DNA con modelli complementari marcati (sonde).

Sonda

Rileva e localizza la presenza o l'assenza di specifiche sequenze di DNA nei cromosomi.

https://it.wikipedia.org/wiki/DNAhttps://it.wikipedia.org/wiki/Cromosomi

CARICO TUMORALE

TIPO DI CARICO TUMORALE

TRANSIZIONE VERSO MEDICINA PERSONALIZZATA

TNM VIII edizione, AJCC

Test genetici: ricerca di alterazioni ereditarie presenti nel DNA che predispongono il soggetto ad ammalarsi (sangue, saliva)BRCA (mammella/ovaio)RET (tiroide) APC (Poliposi famigliare del colon)TP53 (S Li Fraumeni)

Test genomico: analizza la presenza e la funzionalità di gruppi di geni all’interno di una lesione specifica. Ciò può influenzare il modo in cui è probabile che il tumore si sviluppi e/o risponda al trattamento. A differenza del test genetico, non fornisce informazioni sul patrimonio genetico ereditario della persona, ma considera gruppi genici per comprendere come questi interagiscono ed influenzano il comportamento della lesione.

Test genomici

Test genomici…..

ma i test genomici nel breast cancer sono stati inseriti nel nuovo TNM.

Polmone (EGFR, ALK, ROS, p53, P27, MET, BRAF, KRAS, PD-L1)Colon-retto (kRAS, BRAF, MSH-1, P53)Sistema nervoso centrale (IDH1, 1p19q, MGMT, TP53)Sarcomi (cKit, PDGFRA)Tiroidi (RET)Melanomi (BRAF)

MammellaColon retto Prostata

Piattaforme geniche disponibili in commercio per la stratificazione del rischio

TEST MOLECOLARI PROPOSTI: AJCC (2017/18)

TEST NUMERO DI GENI

MATERIALE RICHIESTO

TECNOLOGIA UTILIZZATA

RISULTATO

Oncotype DX (recurrence score)

21 Tessuto in paraffina RT-PCR 3 categorie: low riskintermediate high risk

MammaPrint/ Amsterdam Signature

70 Tessuto in paraffina microarray 2 categorie: low risk e high risk

EndoPredict * 11 Tessuto in paraffina RT-PCR 2 categorie: low risk e high risk

Prosigna (PAM50)* 50 Tessuto in paraffina RT-PCR 3 categorie: low risk, intermediate e high risk

Le pazienti con tumori ER+/HER2- vengono divise in categorie di rischio in base alla presenza/assenza di geni specifici correlati principalmente alla proliferazione

*Possono essere eseguiti in laboratorio: sono test de-centralizzati. Oncotype e Mammaprint sono invece centralizzati negli Stati Unti ed in Olanda rispettivamente

I risultati hanno dimostrato che nelle pazienti a basso rischio si può omettere la chemioterapia

Rimborsabilit

a’ da parte de

l SSN?

…..TECNICHE PIU’ AVANZATE ANALITICHE?

TELEPATOLOGIA (IMMAGINE VIRTUALE DEL VETRINO)

ABOLISCONO LA NECESSITA’ DEL MICROSCOPIOPERMETTONO UNA STANDARDIZZAZIONE ANALITICAPERMETTONO SECOND OPINION RAPIDE

MA PERMANGONO I DUBBI PERVELOCITA’ SCANSIONE DEI PREPARATIMODALITA’ DI ARCHIVIAZIONE E PRIVACY

…..TECNICHE PIU’ AVANZATE DIAGNOSTICHE/PROGNOSTICHE?

BIOPSIA LIQUIDA

NGSScuola di Specializzazione in Anatomia PatologicaRefertazione di 50 esami di biologia molecolare

GRAZIE PER LA VOSTRA ATTENZIONE

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