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BIOLOGIABIOLOGIAMOLECOLARE NELLAMOLECOLARE NELLA

DIAGNOSTICADIAGNOSTICAMOLECOLAREMOLECOLARE

DIAGNOSIDIAGNOSI

PRENATALEPRENATALE

Ivilli coriali e tutte le strutture placentari sono di

origine embrionale: di conseguenza la dotazionecromosomica dei singoli elementi cellulari rifletteesattamente il corredo cromosomico, o cariotipo,dell’embrione.

PRELIEVO DI LIQUIDO AMNIOTICO

PRELIEVO DI VILLI CORIALI

ANALISIDEL DNA

ASSENTE

PRESENTE

99 bp 43 bp

taglio

DIAGNOSIDIAGNOSI

ONCOLOGICAONCOLOGICA

Applicazioni della PCRApplicazioni della PCR

Individuazione di cellule cancerose tramite rivelazione di unriarrangiamento cromosomico (linfoma follicolare)

Questa PCR e’ in grado di rilevare 1 cellula cancerosa su 106 cellule normali

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ALTRI ESEMPI DI TRASLOCAZIONEALTRI ESEMPI DI TRASLOCAZIONE

CML= Leucemia Mieloide Cronica (Cromosoma Philadelphia)

Traslocazione reciproca cromosomi 9 /22

LINFOMA DI BURKITT

Traslocazione reciproca cromosomi 8/14Tali elementi neoplastici, presenti ad un

livello inferiore alla capacità di rilevazionedelle metodiche convenzionali, sono in gradodi espandersi e dare origine alla recidiva

Quota residua minima di celluleneoplastiche (tumori ematologici tipo leleucemie ed i linfomi) non eliminate dallaterapia di induzione della remissione o dallesuccessive misure terapeutiche

MRD (Minimal Residual Disease):

PCR nella diagnosi dellPCR nella diagnosi dell’’anemia anemia falciformefalciformeMstII site

CCTGAG

DETERMINAZIONE DEL SESSOGene amelogenina

6 bp

Y

X

DETERMINAZIONE DEL SESSOGene amelogenina

cromosoma Y frammento di 112 cbcromosoma X frammento di 106 cb(due frammenti distinti)

cromosoma X frammento di 106 cbcromosoma X frammento di 106 cb(due frammenti sovrapposti)

3

Y X

M1 2

DETERMINAZIONE DEL SESSOGene amelogenina

50 bp

100 bp200 bp

STABILIRE RELAZIONI DIPARENTELA:

- TEST DI PATERNITA’- IDENTIFICAZIONE PERSONALE

- ORIGINE ETNICA

1. MICROSATELLITI

2. SEQUENZA DI ZONE IPERVARIABILIDELL’ mtDNA

MICROSATELLITI: (STR: Short Tandem Repeat)

Unità di ripetizione: 2-5 nucleotidi

Numero di unità: ≤ 40

Medicina LEGALE (criminologia, test di paternità)

CARATTERISTICHE DELLE SEQUENZE RIPETUTE

Altamente polimorfiche

Ereditarietà Mendeliana

APPLICAZIONI

Identificazione personale (Fingerprint)

ETEROZIGOSITA’70%

MICROSATELLITI UTILIZZATI

TH01 Tirosina Idrossilasi (int. 1) (CATT)5-12

Locus Ripetizioni

vWF Fattore vonWillebrand (int.40) (TCTA)9-15

DM1 Miotonina (3’ UTR) (CTG)5-40

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AUTORADIOGRAFIA GEL ACRILAMIDE DENATURANTE

vWF

Indagini in medicina forense

Indagini in medicina forenseSTABILIRE RELAZIONI

DI PARENTELA - ORIGINE ETNICA

1. MICROSATELLITI

2. SEQUENZA DI ZONE IPERVARIABILIDELL’ mtDNA

EREDITA’ MATERNA DELL’mtDNA

mtDNA ∼ 16600 bp

CONTROL REGION

MITOCHONDRIAL DNA

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ALLELE E APLOTIPO

ALLELI: forme alternative di un determinato gene

APLOTIPO: Il termine aplotipo si riferisce al DNAmitocondriale essendo questo genoma non sottoposto a eventidi ricombinazione. Tutti i geni e le regioni intergeniche di ungenoma mitocondriale vengono ereditati assieme, pertanto lesequenze varianti sono definite aplotipi.

Gli aplogruppi H, J, U, T, K, X, V e I sono ampiamente diffusiin Europa.

H caucasico specificoI, J, e K presenti anche in Asia e Africa

Aplogruppi in Africa: L, L1, L2, U=L3, MAplogruppi in Asia: A, F, B, D, G, E, C, MAplogruppi in America: A, B, C, D

Tuttavia, non è possibile stabilire con certezza l’origine etnica di unindividuo, perché gli aplogruppi noti sono presenti praticamente intutto il mondo. Si può parlare solo di maggiore o minore probabilità, aseconda della frequenza dell’aplogruppo nella popolazioone in esame.

OGMOGM

CP4 EPSPS : gene della 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasi da Agrobac terium sp. (strain CP4) che conferisce

NOS 3’ : terminatore del gene della nopalina sintasi da Agrobac terium tumefac iens

AZIENDA NOTIFICANTE: Monsanto

Specie: Glycine max (SOIA)

P- 35S : promotore del ”Cauliflower mosaic virus”

la resistenza al glifosato, ingrediente att ivo dell'erbic ida Roundup

del prodotto transgenico nel c loroplasto

CTP: sequenza di un “chloroplast transit peptide” da Petunia hybrida che funge da peptide segnale per il transito

P- 35S CP4 EPSPS NOS 3'

Evento: (GTS40-3-2)

CTP

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BIOLOGIABIOLOGIAMOLECOLARE NELLAMOLECOLARE NELLADIAGNOSTICA DELLEDIAGNOSTICA DELLEMALATTIE INFETTIVEMALATTIE INFETTIVE

- Diagnostica molecolare nell’infezione davirus dell’epatite C (HCV)

- Diagnostica molecolare nell’infezione davirus dell’AIDS (HIV-1)

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CLASSIFICAZIONE DI HIV

HIV-1= DIFFUSO PRINCIPALMENTE INEUROPA

HIV-2= DIFFUSO NELLE ZONE SUB-EQUATORIALI E TROPICALI

CLASSIFICAZIONE DI HIV-1

M= MAJOR GROUP

O= OUTLIER

N= NON-M/NON-O

HIV-1M= MAJOR GROUP

9 sottotipi: A, B, C, D, F, G, H, J and K.

Le metodologie di diagnosi dell’infezione daHCV e HIV:

Per l'identificazione dell'infezione da HIV e HCVsono disponibili varie metodiche, basate sullaidentificazione degli anticorpi prodotti dalsistema immunitario contro il virus (metodichesierologiche) oppure sulla ricerca di antigeni emolecole del virus stesso (metodichevirologiche). Ai fini della diagnosi di infezioneattualmente vengono utilizzati il test ELISA ed iltest Western-Blot.

METODICHE SIEROLOGICHE

1.ELISA

2.WESTERN BLOTTING

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METODO ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)

Test Immunoenzimatico (ELISA): è la metodica utilizzata per il test discreening, in quanto di facile esecuzione e di costo limitato.Questo test ricerca gli anticorpi prodotti contro alcuni antigenivirali, (gp 41 e gp120-HIV), che dopo una prima infezionerestano nell'organismo per tutta la vita. Il test ha unasensibilità di oltre il 95%, ma in alcuni casi si possono averedelle risposte errate:

• falsi positivi: il test risulta positivo in assenza diinfezione. Può succedere in persone con malattie chealterano la funzione del sistema immunitario portandoalla produzione di anticorpi anomali (es: leucemie,linfomi, malattie autoimmuni, gravi epatopatie, ecc.);

• falsi negativi: il test risulta negativo anche sel'infezione è presente. Può succedere in persone che sisono infettate molto recentemente, ma nelle quali nonsi sono ancora formati gli anticorpi che reagiscono conil test; questo avviene solitamente nelle primesettimane (o mesi) dopo il contagio (periodo finestra).

WESTERN BLOTTING

Western Blot (WB): è un test dotato di maggiorespecificità e sensibilità, utilizzato per confermare lapositività di un test ELISA. Questa metodica permettedi evidenziare la presenza di anticorpi diretti contro lemaggiori proteine virali: il test viene definito positivoquando sono presenti almeno 2 degli anticorpiprincipali; se il test risulta dubbio o indeterminato varipetuto dopo alcuni mesi.

METODICHE VIROLOGICHE

1.ANTIGENEMIA

2.RICERCA DELL’RNA VIRALE

ANTIGENEMIA PER HIVAntigenemia p24: La proteina p24 è un antigene delcore virale, e la sua presenza nel sangue indica unostato di attiva replicazione del virus. La positivitàdell'antigenemia p24 è più frequente nel periodosuccessivo al contagio e nelle fasi più avanzate dellamalattia. Questo test attualmente non viene piùeseguito, in quanto superato per sensibilità dallaricerca dell’ RNA virale.

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RICERCA DEL VIRUS NEL SANGUEViremia (HIV-RNA, HCV-RNA)Consente di ricercare molecole di RNA virale, la cui quantità nelsangue è direttamente proporzionale al grado di attivitàreplicativa del virus. La viremia viene espressa in numero di copiedi VIRUS per ml di sangue; ci sono vari tipi di test che possonoessere utilizzati per la determinazione della viremia ma quellopiù accreditato è la Q-PCR.

Q-PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction): è la metodicapiù diffusa, ed ha un range di sensibilità tra 150 e 1.000.000 dicopie;

Standard curveREAL TIME PCR : STANDAR CURVE

I GENOTIPI DI HCVCARATTERIZZAZIONEDEI GENOTIPI DI HCV

Dal punto di vista metodologico esistono vari sistemi che possonoessere utilizzati per definire il genotipo virale di HCV

Le regioni NS5 ed E1 si sono dimostrate adeguate per lacaratterizzazione genotipica e la distinzione dei rispettivi sottotipivirali finora conosciuti

•L’ANALISI DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICACOSTITUISCE IL “GOLD STANDARD”

•DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

•IBRIDAZIONE CON SONDE GENOTIPO SPECIFICHE

CARATTERIZZAZIONEDEI GENOTIPI DI HCV

Dal punto di vista metodologico esistono vari sistemi che possonoessere utilizzati per definire il genotipo virale di HCV

Le regioni NS5 ed E1 si sono dimostrate adeguate per lacaratterizzazione genotipica e la distinzione dei rispettivi sottotipivirali finora conosciuti

L’ANALISI DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICACOSTITUISCE IL “GOLD STANDARD”

AMPLIFICAZIONE CON PRIMERS GENOTIPOSPECIFICI

DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

IBRIDAZIONE CON SONDE GENOTIPO SPECIFICHE