Universidade Federal de Viçosa – Departamento de Tecnologia de Alimentos – Laboratório Processos Bioquímicos e Fermentativos Revisão 00

PROTOCOLO 1: ISOLAMENTO DE LEVEDURAS Pag. 1 de 3

1. Utensílios

- Placas de petri estéries;- Tubos de ensaio;- Frascos estéries;- Alça de drogausk;- Alça de platina;- Estufa;- Autoclave;- Capela ou bico de Bunsen;- Balança analítica;- Espátulas;- Bastão de vidro

2. Reagentes

- Peptona- Ágar Batata Dextrose – PCA - Ácido tartárico

2.1. Preparo dos reagentes

- Água Peptonada: Pesar 0,1 g de pelptona para cada 100 mL de água destilada (0,1%). Faça a diluição, coloque no frasco ou tubo de ensaio e leve à autoclave a 1 atm de pressão a 121ºC por 15 minutos.

- Ágar PCA acidificado: Dissolver 39 gramas em 1000 mL de água destilada e levar ao aquecimento até que o meio dissolva-se completamente. Esterilizar em autoclave a 1 atm de pressão a 121ºC por 15 minutos. Para acidificação à pH 3,5 pode-se usar ácido tartárico 10% estéril. Preparar a solução de ácido tartárico e aquece-la a mesma temperatura do ágar liquefeito, adicionar aproximadamente 1 mL para cada 100 mL de meio e fazer a homogeneização ( o meio não pode ser aquecido após a mistura com o ácido). Em caso de dúvidas siga as instruções do fabricante.

3. Procedimento

- Em capela esterilizada verta o meio de cultura liquefeito em placa de petri ate que a base esteja completamente preenchida (cerca de 15 a 20 ml por cada placa ). Aguarde a solidificação com as placas entreabertas;

Data de Aprovação:Elaborado por: Mayara Salgado silva Aprovado por:

Universidade Federal de Viçosa – Departamento de Tecnologia de Alimentos – Laboratório Processos Bioquímicos e Fermentativos Revisão 00

PROTOCOLO 1: ISOLAMENTO DE LEVEDURAS Pag. 2 de 3

- Pese a amostra diretamente no frasco com água peptonada (0,1%) seguindo as diluições 10-1, 10-2 e 10-3. Caso haja dificuldade em identificar a colônia, mais diluições deverão ser realizadas. Macere a amostra com a ajuda de um bastão de vidro estéril;

- Adicionar 0,1 mL da diluição da amostra com pipeta estéril no centro da placa e espalha-se com o auxílio de uma alça de Drigalski estéril. Fazer este procedimento em duplicata;

- Incubar as placas invertidas em estufa à 28 ºC por 72 horas;- Passado este tempo, selecionar a diluição mais viável e fazer a contagem das

colônias;- Fazer a identificação das colônias de leveduras observadas (Protocolo 2) e proceder

a uma nova semeadura por estrias em placa de petri com o mesmo meio de cultura, inoculando um tipo de colônia por placa;

- Na semeadura por estrias deve-se flambar a alça de platina (ou então pode-se utilizar alças de plástico descartáveis previamente esterilizadas) e introduzi-la no meio contendo as bactérias. Fazer então o estriamento na superfície do ágar da placa de Petri Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes. A quantidade de material a ser inoculada deve ser mínima, sendo que em muitos casos, é necessário diluir o meio do qual os microrganismos são provenientes; caso contrário, pode haver a justaposição das colônias e por isso não se pode isolá-las.

- Repetir o procedimento até observação de colônias puras.- Fazer nova identificação pelo protocolo 2 e recolher as colônias com mesma

características em Tubo de ensaio ou ependoff e conservar a 8 ˚C.

4. Referências

- Moreira FMS, Huising EJ, Bignell DE (2010). Manual de biologia dos solos tropicais. 1ª ed. Universidade Federal de Lavras, Lavras. Minas Gerais.

Data de Aprovação:Elaborado por: Mayara Salgado silva Aprovado por: