Proteine: dove, quando e perchè

Milano, CusMiBio 21-23 Settembre 2011 Paolo Plevani

Il  dogma  centrale  della  Biologia  Molecolare  

DNA

RNA

Proteina

Trascrizione

Traduzione

Proteoma  

Proteome  =  Proteins  encoded  by  the  genome  

Il  proteoma  comprende  tu9e  le  proteine  espresse  in  una  data  cellula  in  un  certo  momento,  incluse  tu9e  le  isoforme  della  stessa  proteina  (splicing  alterna=vo)  e  le  loro  modificazioni  post-­‐traduzionali.  

Mentre  il  genoma  è  costante  per  una  data  cellula  ed  iden=co  per  tu9e  le  cellule  di  un  organismo  (~  25.000  geni  nell’uomo),  il  numero  di  proteine  prodo9e  è  molto  piu’  elevato  (un  fa9ore  10-­‐100)  in  virtù  del  meccanismo  ,  di  splicing  alterna=vo  e  delle  modificazioni  post-­‐traduzionali.  Inoltre,  il  proteoma  è  dinamico  nel  tempo  e  in  risposta  a  fa9ori  esterni,  e  differisce  in  maniera  sostanziale  tra  i  diversi  =pi  cellulari.  

Proteine: dove, quando e perchè

Analisi di proteine:

Tanti metodi:

Elettroforesi e Western Blot

Elettroforesi su gel

     Metodo  per  separare  macro-­‐molecole  (Proteine,  DNA,  RNA,  etc.)  sulla  base  delle  loro  proprieta’  chimico-­‐fisiche  quali:    

    (1)  dimensioni       (2)  forma    

    (3)  carica  ele9rica  

Elettroforesi di Proteine

•  Piu’  complessa  dell’ele9roforesi  di  DNA  – Proteine  diverse  hanno  cariche  diverse  – Le  proteine  variano  molto  per  forma  (stru9ura)  

•  Generalmente  il  gel  e’  fa9o  di  poliacrilammide  

Perche’  usare  Gel  di  Poliacrilammide  per  separare  le  proteine?    

•  I  gel  di  poliacrilammide  hanno  una  trama  piu’  compa9a  •  I  pori  hanno  dimensioni  minori  che  nei  gel  di  agarosio  •  Le  proteine  sono  molto  piu’  piccole  del  DNA  

–  Amminoacido  medio  =  110  Da  –  Paio  di  nucleo=di  medio  =  649  Da  

–  1  kilobase  di  DNA  =  650  kDa  –  1  kilobase  di  DNA  codifica  333  amminoacidi  =  36  kDa  

Ele9roforesi  di  proteine  Condizioni  Non  Denaturan=  

•  Non-­‐denaturante  (na=vo):  nessun  pre-­‐tra9amento  delle  proteine  prima  dell’ele9roforesi  –  Le  proteine  conservano  la  loro  stru9ura  2°  e  3°;  pon=  disolfuro  etc.    –  Le  proteine  conservano  la  loro  carica  normale  

–  Le  proteine  sono  separate  sulla  base  di  carica,  dimensioni  e  forma  

Nome Carica Massa Forma

Proteina Q

Proteina R

+3 30kD

-4 42kD

Ele9roforesi  di  proteine    in  condizioni  denaturan=  

•  Le  proteine  sono  tra9ate  con  SDS  (detergente  anionico)  prima  dell’  ele9roforesi  (SDS-­‐PAGE)  –  Le  molecole  di  SDS  si  legano  alle  proteine  –  Le  proteine  perdono  la  loro  normale  forma  –  Le  proteine  hanno  tu9e  lo  stesso  rapporto  carica/massa  –  Le  proteine  vengono  separate  esclusivamente  sulla  base  delle  loro  

dimensioni  

SDS

Carica Massa

+3 30kD

-4 42kD

Carica Massa

-300 30kD

-420 42kD

SDS-­‐Polyacrylamide  Gel  Electrophoresis  (SDS-­‐PAGE)  

"  SDS (Sodio Dodecil Solfato)  Solubilizza e denatura le

proteine  Aggiunge cariche

negative alle proteine

O S O

O

O

-

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

SDS

Proteina Nativa Carica netta: -4

Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

Come  funziona  un  Gel  SDS-­‐PAGE  ?    •  Le  proteine  cariche  

nega=vamente  si  muovono  verso  l’ele9rodo  posi=vo  

•  Proteine  piu’  piccole  si  muovono  piu’  velocemente  

•  Le  proteine  si  separano  per  dimensione  

s-s SDS, calore

Proteine con SDS

+

–

Proteasi

Estrazione delle proteine

Proteasi

Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari  Concentrazione dei sali  Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS)  pH   Inibitori di proteasi  Bassa temperatura (ghiaccio)

Cosa  c’e’  nel  tampone  di  caricamento?  

• Un  tampone  (Tris)  per  fornire  il  giusto  pH  (6,8)  

• SDS  (Sodio  Dodecil  Solfato)  per  solubilizzare  le  proteine  e  fornire  loro  una  carica  nega=va  complessiva  

• Glicerolo  per  rendere  pesan=  i  campioni  e  farli  scendere  nei  pozzee  

• Un  agente  riducente  (DTT  o  β-­‐Mercaptoetanolo)  per  rompere  i  legami  disolfuro  

• Un  colorante  (Blu  di  Bromofenolo)  per  visualizzare  i  campioni  

SDS-PAGE

Colorazione con Blu di Coomassie

SDS-­‐PAGE:  separazione  di  proteine  in  base  al  loro  peso  molecolare  

In presenza di SDS e di un riducente dei legami disolfuro, le diverse proteine vengono separate in elettroforesi su gel esclusivamente sulla base di differenze di peso molecolare delle loro catene polipeptidiche.

Il  Gel  •  Come  funziona:  

– Stacking  gel:  4-­‐5%  gel  superiore,  pH  6.8            8-­‐14%  gel  separatore,  pH  8.8  – Le  molecole  di  acrilammide  sono  tenute  assieme  dalla  bis-­‐acrilammide,  formando  una  stru9ura  a  laece  

– Polimerizzazione  piu’  rapida  aggiungendo  catalizzatori:  TEMED  e  APS  

Il  Gel  Componen=  del  gel  SDS-­‐PAGE    •  Soluzione  di  Acrilammide/Bis-­‐Acrilammide    •  Tris-­‐HCl  pH  6.8  oppure  Tris-­‐HCl  pH  8.8  •  SDS  •  ddH2O  •  TEMED  •  APS  (ammonio  persolfato)  •  Buffer  di  corsa  (Tris,  Glicina,  SDS)  

Il  Gel  •  Come  funziona:  –  Proteine  vengono  caricate,  viene  

applicata  una  corrente  ele9rica  •  Includere  un  marker  di  peso  molecolare  colorato  

•  10-­‐50ug  di  estra9o  proteico  totale  •  0.1-­‐1ug  di  proteina  purificata  

–  Ioni  Cloruro  (-­‐)    /  Proteina  /  Glicina  (+)    

–  Si  muovono  verso  il  gel  separartore  (“resolving)    

•  Differenze  di  pH  causano  la  ionizzazione  della  glicina,  perme9endo  alle  proteine  di  migrare  nel  gel  separatore  

+

– Stacking pH 6,8

Resolving pH 8,8

Il  Gel  

•  %  di  acrilammide  consigliata  

   8%      10%      12%        

•  Dimensioni  delle  proteine  

  40-­‐200  kDa     21-­‐100  kDa     10-­‐40  kDa  

Visualizzazione delle proteine nel gel

I due metodi piu’ usati sono:

Colorazione con il Coomassie Brilliant

Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda)

Coomassie staining Silver staining

SDS-­‐PAGE:  determinazione  del  peso  molecolare  di  una  proteina  

Stima dei pesi

molecolari    

Western  Bloeng  

Southern Blot: Per l’analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA).

Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA. (sonda = DNA o RNA).

Western Blot: Per l’analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

Cosa  e’  un  Western  Blot?  •  Una  tecnica  in  cui  le  proteine  sono  separate  mediante  ele9roforesi  su  gel  e  successivamente  trasferite  su  un  supporto  (membrana  o  filtro).  Successivamente  una  specifica  proteina  viene  iden=ficata  mediante  la  sua  reazione  specifica  con  un  an=corpo.  

Qual  e’  la  proteina  che  mi  interessa?  

– SDS-­‐PAGE  (non  certo)  •  Si  basa  sul  confronto  di  peso  molecolare  

– Western  blot  (certo)  •  Si  basa  su  una  reazione  specifica  an=gene-­‐an=corpo  

A cosa serve il Western Blot?

+

–

?

Fasi  di  un  Western  Blot  •  Prima  fase:  ele,roforesi  su  gel.       (Le  proteine  del  campione  vengono  separate  su  un  gel  

in  base  alle  loro  dimensioni)  

•  Seconda  fase:  trasferimento  su  membrana.     (Le  proteine  nel  gel  sono  poi  trasferite  su  una  

membrana  di  nitrocellulosa  mediante  un  campo  ele9rico)  

•  Terza  fase:  saturazione  o  “blocking”.       (La  saturazione  e’  usata  per  prevenire  le  interazioni  non  

specifiche  tra  l’an=corpo  e  la  membrana)  

Fasi  di  un  Western  Blot  •  Quarta  fase:  legame  dell’an>corpo  primario.       (L’an=corpo  riconosce  la  proteina  specifica  immobilizzata  sulla  

membrana)  

•  Quinta  fase:  legame  dell’an>corpo  secondario.     (L’an=corpo  secondario,  coniugato  a  un  enzima  (AP  o  HRP),  

riconosce  specificamente  l’an=corpo  primario,  gia’  legato  alla  proteina  sulla  membrana)  

•  Sesta  fase:  rivelazione  o  “detec>on”.       (L’enzima  coniugato  all’an=corpo  secondario  scinde  un  substrato  

che,  in  corrispondenza  della  proteina  specifica,  sviluppa  precipitato  colorato  o  chemioluminescenza)  

Le  proteine  nel  gel  sono  ancora  in  soluzione  –  Le  bande  diffondono  e  si  confondono  col  tempo  

E’  necessaria  l’immobilizzazione  per:  –  Preservare  in  maniera  permanente  l’esperimento  di  ele9roforesi  –  Perme9ere  il  riconoscimento  di  proteine  specifiche  

La  strategia  piu’  comune  e’  il  trasferimento  su  membrana  –  Fa9a  di  Nitrocellulosa,  PVDF  (Polivinilidene  fluoride)  o  nylon    –  Si  usa  l’ele9roforesi,  in  un    processo  de9o  ‘bloeng’  

Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento

Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento

•  Ele9robloeng  – Apparato  di  trasferimento  –  Il  gel  e’  messo  tra  stra=  di  carta  da  filtro  con  la  membrana  a  dire9o  conta9o  col  gel  sul  lato  verso  l’ele9rodo  posi=vo  

– Viene  applicato  un  campo  ele9rico  e  le  proteine  migrano  fuori  dal  gel  verso  l’ele9rodo  posi=vo  e  si  legano  alla  membrana  

– Fa9o  a  4°C  per  evitare  surriscaldamento,  decomposizione  del  tampone  e  degradazione  delle  proteine  

Apparato per il trasferimento “Semi-dry”

Western Blotting + -

-

+

SDS-PAGE

Assemble ‘sandwich’

Buffer-soaked filter papers

Gel

Nitrocellulose membrane

Wet blotting

Electrode

Buffer

Direction of transfer

Semi-dry blotting

Graphite Electrode Plates

Nitrocellulose with bound proteins

Stained (Red Ponceau)

Western blot: terza fase saturazione o “blocking”

•  Per  saturare  i  si=  idrofobici  liberi  sulla  membrana  

•  Per  prevenire  il  legame  dell’an=corpo  primario  alla  membrana  stessa  

•  La9e  scremato  o  Albumina  di  Siero  Bovino  (BSA)  

Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

•  L’an=corpo  primario  riconosce  la  proteina  di  interesse  e  non  lega  le  altre  proteine  immobilizzate  sulla  membrana  

•  An=corpi  come  sonde:  – Molto  sensibili  

– Possono  essere  “prodoe”  •  Immunizzando  una  specie  diversa  (an=corpi  policlonali)  

•  Generando  an=corpi  monoclonali  (mAb)  

– Economici  

Anticorpi

Ab + Ag AbAg Kd

Kd = = 10-9 M [Ab] [AbAg]

An=corpi  

An=corpi  (immunoglobuline,  Ig)  

  Una  proteina  a  forma  di  Y  secreta  nel  sangue  in  risposta  ad  uno  specifico  an=gene,  come  un  ba9erio  o  un  virus,  che  neutralizza  l’an=gene  legandosi  specificamente  ed  esso  e  producendo  una  risposta  immunitaria.  

An=corpi  policlonali  Produzione  •  Immunizzazione  ripetuta  dell’animale  con  l’an=gene  (pep=de,  proteina  purificata  o  ricombinante)  

•  Il  sangue  e’  prelevato  nel  momento  di  picco  di  produzione  dell’an=corpo  ed  e’  purificato  il  siero  

•  Il  “pool”  degli  an=corpi  riconosce  mol=  epitopi  dell’an=gene  usato  per  l’immunizzazione  

An=corpi  monoclonali  

Riconoscono  solo  un  epitopo  

Fusioni  tra  linfoci=  B  (milza/linfonodi)  e  cellule  di  mieloma  di  topo  

Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

An=corpi  

•  An=corpo  primario  – Riconosce  la  proteina  

•  An=corpo  secondario  –  Lega  l’an=corpo  primario  

–  Generalmente  prodo9o  in  una  specie  diversa  

–  Coniugato  con  un  enzima  

–  Il  substrato  dell’enzima  sara’  conver=to  in  un  prodo9o  colorato  

–  Puo’  anche  essere  radioaevo  o  fluorescente  

•  Fosfatasi  alcalina  (AP)  o  perossidasi  del  rafano  (HRP:  horseradish  peroxidase)  – Conversione  di  un  substrato  colorimetrico  in  un  precipitato  colorato    

•  Substra=  Chemioluminescen=  – Eme9ono  luce  se  conver==  dall’enzima  – Possono  essere  visualizza=  su  lastre  radiografiche  

•  Marcatura  radioaeva  •  An=corpi  secondarii  bio=nila=  

Western blot: sesta fase rivelazione o “detection”

HRP

Western blot HRP

substrato

luce

Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione

Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce

pg proteina

Le proteine possono essere modificate dopo la loro sintesi: modificazioni post-traduzionali

Fosforilazione Glicosilazione Ubiquitinazione etc…….

Tali modificazioni fanno variare il PM della proteina e, quindi, possono essere evidenziabili dopo elettroforesi e western blot

Danni al DNA

Checkpoints di risposta a danni

Trascrizione

Riparazione e ricombinazione del DNA Replicazione DNA

Ciclo cellulare

Apoptosi

•Molto conservati negli eucarioti: dal lievito all’uomo

•Mutazioni nei geni dei checkpoints causano instabilità genomica e tumori

La risposta cellulare a danni al DNA

Proteine sensori Mec1, Tel1, Ddc2, Rad17, Mec3, Ddc1 Rad24,RFC

ATR, ATM, ATRIP, hRAD1, hHUS1, hRad9, hRAD17, RFC

Trasduttori Rad9, Rad53, Chk1 BRCA1?, CHK2, CHK1

Effettori RPA, Polα-primase, Cdc28, Swi6, Pds1, Cdc14, ...

RPA, p53, CDC25, CDK, ...

Lievito Uomo

Il checkpoint innescato da danni al DNA è una via di trasduzione dei segnali

RPA RPA RPA

Rad24

RFC2-5

2 3

4

5

Mec

3

Ddc2

Mec1

Targets

RPA RPA RPA

Rad9 P

P P

P

Rad9

P

Rad9

P Rad9

P P

Rad53

Rad53

P P

Rad53

P P

Ddc1

P P

Ddc2

DNA damage checkpoint in S. cerevisiae

FOSFORILAZIONI !!!!!!