Progetto Regione Emilia-Romagna “Studio e modellazione ... · Microbiologia degli Alimenti –...

Progetto Regione Emilia-Romagna

“Studio e modellazione degli aspetti enzimatici legati alla stagionatura del formaggio Parmigiano-Reggiano”

Azione 3: Aspetti enzimatici legati alla stagionatura del Parmigiano-Reggiano

Fase 1: Determinazione delle caratteristiche microbiologiche e chimiche dei campioni scelti

EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE AMMINOACIDICA E EVOLUZIONE DELLA FRAZIONE AMMINOACIDICA E OLIGOPEPTIDICANEL FORMAGGIO PARMIGIANOOLIGOPEPTIDICANEL FORMAGGIO PARMIGIANO--REGGIANO REGGIANO

NEI PRIMI MESI DI STAGIONATURANEI PRIMI MESI DI STAGIONATURA

Dipartimento di Chimica Organica ed IndustrialeFacoltà di Agraria

Università di Parma

Rosangela MarchelliArnaldo Dossena

Stefano SforzaGianni GalavernaValeria Cavatorta

Fausto Stefani

LA PROTEOLISI NEL PARMIGIANOLA PROTEOLISI NEL PARMIGIANO--REGGIANOREGGIANOEnzimi responsabili del processo proteolitico e loro origine

CASEINA

Chimosina

PlasminaAmmino acidi

Di- tripeptidiOligopeptidi

FORMAGGIO

LISI

Proteasi intracellulari

Sistemi di trasporto

Proteasi associate alla parete cellulare

Endoproteasi

Amminoproteasi

Tripeptidasi

Dipeptidasi

Lactobacillus

LatteLatte

CaglioCaglio

Proteasi Proteasi associate associate alla parete alla parete cellularecellulare

SieroinnestoSieroinnesto

Il gruppo di ricerca si propone:A. L’analisi quantitativa del contenuto amminoacidico dei campioni

B. L’analisi della frazione peptidica a basso peso molecolare (<10 kDa) per l’identificazione dei peptidi maggiormente presenti e la loro semi-quantificazione

C. L’utilizzo dei dati per ricavare informazioni sulle attività enzimatiche e la correlazione dei dati ottenuti con le attività enzimatiche determinate dal gruppo di Microbiologia degli Alimenti – Biotecnologie Microbiche

ANALISI DEGLI AMMINOACIDIANALISI DEGLI AMMINOACIDI

omogeneizzazione

derivatizzazione

Filtrazione su carta

Centrifugazione (4°C)

Deproteneizzazione (7,5 ml TFA) 20 min

Estrazione fase lipidica

Filtrazione (0,45 µm)

Neutralizzazione con NaOH 1 N

Purificazione medianteScambio ionico

Essiccazione

Neutralizzazione con NaOH 1 N

Essiccazione e ridissoluzione in

1 ml di H2O bidistillata

5g formaggio +500µl D-L Nor-Leucina+50 ml H2O bidistillata

Analisi HPLC-FLD

Essiccazione

mV

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

140.00

Minutes12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00

15.090

16.640 17

.584

18.402

18.814 19

.580

23.634

24.246

25.721

28.331

33.666

34.980

35.663

37.842

39.008

39.836

40.498

41.242

41.798Asp

Ser Glu His

Thr

Arg

Ala Pro

Tyr

ValGly Met

Lys Ile Leu

N-Leu

Phe

AMMINOACIDI TOTALIAMMINOACIDI TOTALI

Non emergono differenze significative nella quantità totale di amminoacidi tra parte esterna e parte centrale della forma fino al 2° mese.Una certa disomogeneità compare dal 3° mese per poi accentuarsi al 6°, con prevalenza di amminoacidi nella parte esterna.

01000

20003000

400050006000

70008000

900010000

0 50 100 150 200 250 300giorni di stagionatura

a.a.

tota

li (m

g/10

0g s

.s.) esterno forma

centro forma

Distribuzione percentuale degli amminoacidi a 1 mese di stagionaDistribuzione percentuale degli amminoacidi a 1 mese di stagionaturatura

Asp3%

Ser6%

Glu15%

Gly2%

His6%

Arg7%

Thr3%Ala

5%Pro9%

Tyr3%

Val6%

Met2%

Lys16%

Ile4%

Leu9%

Phe4%

Asp3% Ser

6%

Glu18%

Gly2%

His5%

Arg7%

Thr3%Ala

5%Pro10%

Tyr3%

Val6%

Met2%

Lys16%

Ile3%

Leu8%

Phe3%

CENTRO FORMAESTERNO FORMA

Nessuna differenza significativa nella distribuzione percentuale tra le due zone

Distribuzione percentuale degli amminoacidi a 6 mese di stagionaDistribuzione percentuale degli amminoacidi a 6 mese di stagionaturatura

CENTRO FORMA

Asp3% Ser

8%

Glu19%

Gly2%

His5%

Arg3%

Thr5%

Ala2%

Pro10%

Tyr1%

Val7%

Met2%

Lys14%

Ile6%

Leu9%

Phe4%

Asp3% Ser

7%

Glu20%

Gly2%

His5%

Arg3%

Thr4%Ala

2%Pro10%

Tyr1%

Val7%

Met2%

Lys15%

Ile5%

Leu10%

Phe4%

ESTERNO FORMA

Nessuna differenza significativa nella distribuzione percentuale tra le due zone

Distribuzione percentuale degli amminoacidi a diversi tempi di Distribuzione percentuale degli amminoacidi a diversi tempi di stagionaturastagionatura

Asp3%

Ser6%

Glu15%

Gly2%

His6%

Arg7%

Thr3%Ala

5%Pro9%

Tyr3%

Val6%

Met2%

Lys16%

Ile4%

Leu9%

Phe4%

1 mese di stagionatura

Asp3% Ser

8%

Glu19%

Gly2%

His5%

Arg3%

Thr5%

Ala2%

Pro10%

Tyr1%

Val7%

Met2%

Lys14%

Ile6%

Leu9%

Phe4%

6 mesi di stagionatura

Dimnuisce la percentuale di arginina, alanina e tirosinaAumenta la percentuale di acido glutammico, serina, isoleucina

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 50 100 150 200 250 300giorni di stagionatura

mg/

100

g s.

s.

ArgTyrGlu

I dati indicano un cambiamento nella produzione di amminoacidi apartire dal 2°-4° mese di stagionaturaQuesto cambiamento comporta un arresto nella produzione di Arg eTyr (o una loro degradazione) ed un incremento nella produzione diGlu

ANALISI DEI PEPTIDIANALISI DEI PEPTIDI

Ultrafiltrazione

Estrazione10 g di formaggio + 2,5 ml di Phe-Phe 1 mM +

45 ml di HCl 0,1 N (deproteinizzazione)

Filtrazione su carta

Estrazione della frazione lipidica

Filtrazione a 0,45 µm

Prelievo di un'aliquota di 3 ml di estratto

Evaporazione totale del solvente

Recupero del campione con 900 µl di soluzione acquosa di ac. Formico 0,1 %

Filtrazione a 10000 Da

3 lavaggi di recupero

Essiccazione completa del filtrato sotto flusso di azoto

Filtrato

Filtrato

ANALISI HPLC/MS DEI PEPTIDIANALISI HPLC/MS DEI PEPTIDISeparazione analitica Rivelazione

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00

%

0

10015.04

6.34

5.304.42

3.22

6.65

6.89

10.81

15.28

15.68

15.84

27.42

16.40

24.46

22.95

42.99

27.9037.64

32.77

30.77

49.78

47.94

50.9062.00

57.04 65.51

74.3767.75

TICTIC

Phe-Phe

Interfaccia ESI

Zona di collisione in sorgente

� HPLC a fase inversa

� Colonna C18

� Eluente a gradiente H2O-CH3CN acidificati (ac. formico 0,1 %)

Spettrometro di massa a singolo quadrupolo con

interfaccia ESI

IDENTIFICAZIONE DEI PEPTIDIIDENTIFICAZIONE DEI PEPTIDI

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00

%

0

10015.04

6.34

5.304.42

3.22

6.65

6.89

10.81

15.28

15.68

15.84

27.42

16.40

24.46

22.95

42.99

27.9037.64

32.77

30.77

49.78

47.94

50.9062.00

57.04 65.51

74.3767.75

Elaborazione dei dati: semiquantificazione

m/z300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400

%

0

100706.4

642.3

588.9

542.2

697.1

784.7

719.4

882.7

811.1

1008.7

888.8 945.0 1171.61133.5

mass5900 6000 6100 6200 6300 6400 6500 6600 6700 6800 6900 7000 7100

%

0

1007054.0

m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

%

0

100706.4

642.3

588.9

100.1

543.7323.1162.9527.3

784.7

882.7

799.01008.6

898.7

945.01026.9 1176.51030.8 1259.4 1317.7

TICTICSpettro di massaSpettro di massa

Spettro di massa Spettro di massa ricostruitoricostruito

Picchi caratteristiciPicchi caratteristici

SEMIQUANTIFICAZIONE DEI PEPTIDISEMIQUANTIFICAZIONE DEI PEPTIDI

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00

%

0

10054.71

XICXICArea del piccoArea del picco

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00

%

0

10054,55

56471152

Calcolo del rapporto tra l'area generata dal peptide e l'area dello standard interno

Correzione del dato ottenuto in base al contenuto di umidità

Peptide

Frammentazione

IDENTIFICAZIONE DELLA SEQUENZA ESATTA DEI PEPTIDI IDENTIFICAZIONE DELLA SEQUENZA ESATTA DEI PEPTIDI TRAMITE CONFRONTO CON LE SEQUENZE CASEINICHE E TRAMITE CONFRONTO CON LE SEQUENZE CASEINICHE E

FRAMMENTAZIONE IN SORGENTEFRAMMENTAZIONE IN SORGENTE� Individuazione, in base al peso molecolare del peptide, delle possibili sequenze caseiniche

� Calcolo dei frammenti teorici

� Confronto dei frammenti teorici con quelli presenti nello spettro

m/z280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800

%

0

100788.3

657.2

528.2

399.2

354.0329.2286.2 371.2 413.8

529.3

548.1640.3

658.2

684.8

789.3

B (n-1)

B (n-2)

B (n-3)B (n-4)

L LEE

Attribuzione della sequenza caseinica, tra le

diverse possibili.

CARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE PEPTIDICACARATTERIZZAZIONE DELLA FRAZIONE PEPTIDICA

TR PM Sequenza TR PM Sequenza TR PM Sequenza TR PM Sequenza25,3 416 β CN(1-3) 48,2 2042 β CN(103-119) 10,0 874 36,4 1991 αS1 CN(1-17)25,4 545 β CN(1-4) 51,6 1122 β CN(111-119) 24,4 536 αS1 CN(1-4) 37,8 755 αS1 CN(10-16)25,4 1404 β CN(71-83) 55,2 7182 β CN(99-160) 24,4 745 αS1S1 CN(1-6) 38,3 1877 αS1 CN(1-16)26,4 1001 β CN(97-105) 55,5 7054 β CN(99-159) 26,2 707 αS1 CN(30-35) 42,4 601 αS1 CN(16-20)37,1 1510 β CN(82-95) 57,5 1151 β CN(199-209) 26,4 1132 αS1 CN(154-162) 46,1 2836 αS1 CN(174-199)39,3 1703 β CN(16-28) +3P 61,8 1717 β CN(194-209) 27,4 1535 αS1 CN(1-13) 49,9 905 αS1 CN(17-23)39,4 787 β CN(1-6) 62,1 1589 β CN(195-209) 28,8 1664 αS1 CN(1-14) 49,9 791 αS1 CN(18-23)40,4 1999 β CN(14-28) +4P 62,4 1881 β CN(193-209) 30,8 414 αS1 CN(10-13) 50,0 3452 αS1 CN(157-188)40,6 1790 β CN(130-144) 74,3 4696 β CN(51-93) 30,9 734 αS1 CN(186-192) 50,2 805 αS1 CN(24-30)41,3 2098 β CN(13-28) 74,4 4454 β CN(53-93) 32,4 1495 αS1 CN(24-36) 51,4 2764 αS1 CN(1-23)41,6 3132 β CN(98-124) 74,5 4253 β CN(55-93) 32,7 542 αS1 CN(10-14) 55,3 1246 αS1 CN(14-23)42,2 2746 β CN(159-183) 74,8 4024 β CN(57-93) 34,1 1348 αS1 CN(25-36) 56,9 1237 αS1 CN(24-34)43,3 2212 β CN(174-192) TR PM Frammenti 34,9 1138 αS1 CN(113-122) 58,5 3860 αS1 CN(83-114)47,8 754 β CN(47-52) 6,2 1140 αS1 CN(1-9) 36,3 1198 αS1 CN(23-32) 58,6 4238 αS1 CN(80-114)

αS1 CN(1-7)

PM TR Sequenza260 29,7260 29,9294 31,9

γ-glu-ileγ-glu-leuγ-glu-phe

Ore di stagionatura

Som

ma

A/A

si

0 12 48

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICOEVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO

Giorni di stagionatura2 30 60 90 120 180 240

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Andamento complessivo dei peptidi

Ore di stagionatura

Som

ma

A/A

si

0 12 48

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

2 30 60 90 120 180 2400,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

1. con un massimo a tempo zero

Giorni di stagionatura0 12 48

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

Ore di stagionatura

Som

ma

A/A

si

Giorni di stagionatura2 30 60 90 120 180 240

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24



I tre gruppi di peptidi:

0 12 48

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Ore di stagionatura

Som

ma

A/A

si

0 12 48

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

Ore di stagionatura

Som

ma

A/A

si

2 30 60 90 120 180 240

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Giorni di stagionatura




1. con un massimo a tempo zero2. con andamento crescente

2 30 60 90 120 180 240

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0


0 12 48

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Ore di stagionatura

Som

ma

A/A

si

Ore di stagionatura

Som

ma

A/A

si

2 30 60 90 120 180 240

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Giorni di stagionaturaGiorni di stagionatura



1. con un massimo a tempo zero2. con andamento crescente3. con massimo

2 30 60 90 120 180 240

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

Giorni di stagionaturaOre di stagionatura

Som

ma

A/A

si

0 12 48

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0


• αS1 CN f (1-23)

• αS1 CN f (24-34)

• β CN f (193-209)

• β CN f (99-159)

• β CN f (99-160)

2 30 60 90 120 180 2400,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

0 12 480,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

Ore di stagionatura Giorni di stagionatura

Som

ma

A/A

si

EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi con uncon un massimomassimo al tempo zeroal tempo zero

... Leu Arg Phe Phe Val Ala21 22 23 24 25 26

... Phe Leu Leu Tyr Gln Glu190 191 192 193 194 195

... Val Ser Lys Val Lys Glu95 96 97 98 99 100

αS1

β

βCHIMOSINA

• αS1 CN f (1-23)

• αS1 CN f (24-34)

• β CN f (193-209)

• β CN f (99-159)

• β CN f (99-160)

2 30 60 90 120 180 2400,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

0 12 480,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0


Som

ma

A/A

si

EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi con uncon un massimomassimo al tempo zeroal tempo zero

... Leu Arg Phe Phe Val Ala21 22 23 24 25 26

... Phe Leu Leu Tyr Gln Glu190 191 192 193 194 195

... Val Ser Lys Val Lys Glu95 96 97 98 99 100

αS1

β

βCHIMOSINA

ENZIMI ENDOGENI DEL LATTE

2 30 60 90 120 180 2400,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50

Max a 30Max a 60Max a 90Max a 120


Som

ma

A/A

si

0 12 480,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50

EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi con uncon un massimo tra ilmassimo tra il primo edprimo ed il secondo meseil secondo mese

2 30 60 90 120 180 2400,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50



Som

ma

A/A

si

0 12 480,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50


Molti derivano dalla successiva degradazione di peptidi di origine chimosinica

FRLLNENLVEQPLGQHKIPHKPR

2322212019181716151413121110987654321

FRLLNENLVEQPLGQHKIPHKPR

2322212019181716151413121110987654321

1-23

1-16

1-17 18-23

1-14

1-13

10-14

10-16

10-13

1-9

1-7

1-4

1-6

14-23

17-23

16-20

1-16

1-17 18-23

1-14

1-13

10-14

10-16

10-13

1-9

1-7

1-4

1-6

14-23

17-23

16-20

1-16

1-17 18-23

1-14

1-13

10-14

10-16

10-13

1-9

1-7

1-4

1-6

14-23

17-23

16-20

2 30 60 90 120 180 2400,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50



Som

ma

A/A

si

0 12 480,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50


ESO- ed ENDO-PEPTIDASI BATTERICHE

• β CN f (16-28)3P

• β CN f (14-28)4P

• β CN f (174-192)

• αS1 CN f (83-114)

0 12 480,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

2 30 60 90 120 180 2400,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0


Som

ma

A/A

si

EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi concon andamento crescenteandamento crescente

... Ile Ile ...26 27 28 29 30 31

... Val Pro ...167 168 169 170 171 172

... Ile ...77 78 79 80 81 82

Asn Lys Lys Glu

Gln Ser Lys Leu

Glu Gln Lys His GlnαS1

β

β

PLASMINA e AMMINOPEPTIDASI

EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:EVOLUZIONE NEL TEMPO DEL PATTERN PEPTIDICO:PeptidiPeptidi concon andamento crescenteandamento crescente

γ-glu-ileγ-glu-leuγ-glu-phe

NH

H2N

COOH

O COOH

γ-Glu-Phe

Peptidi di neo-formazione (NON di derivazione proteolitica) probabilmente generati da un’attività γ-glutamiltranspeptidasica

Fino a due mesi i peptidi formati dai batteri lattici si formano e si degradano più rapidamente all’esterno


Som

ma

A/A

si


Som

ma

A/A

si


Som

ma

A/A

si

2 30 60 90 120 180 240

0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

CentroEsterno

0 12 48

0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

0 30 60 90 120 180 2400,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

CentroEsterno

2 30 60 90 120 180 240

0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

CentroEsterno

0 12 48

0,000,501,001,502,002,503,003,504,004,505,005,506,006,507,007,508,00

0 12 48

0,000,501,001,502,002,503,00

3,504,004,505,005,506,006,507,007,50

8,00

Nella parte esterna della forma vi è una maggior proliferazione batterica, ma la disomogeneità da essa provocata scompare a partire dal secondo-terzo mese

DISTRIBUZIONE DEL PATTERN PEPTIDICO NELLA FORMADISTRIBUZIONE DEL PATTERN PEPTIDICO NELLA FORMAFino a due mesi l’esterno è piùpovero di peptidi derivati dalla chimosina, ad indicare un’attivitàproteolitica più intensa nella parte esterna della forma

Non si notano sostanziali differenze tre le zone di campionamento

Ore di stagionatura

PRIME CONCLUSIONI:PRIME CONCLUSIONI:LL’’EVOLUZIONE NEL TEMPO DELLA FRAZIONE EVOLUZIONE NEL TEMPO DELLA FRAZIONE

AMMINOACIDICA E PEPTIDICAAMMINOACIDICA E PEPTIDICANel periodo che va dalla produzione al 10°mese di stagionatura i dati su amminoacidi e peptidiindicano due momenti ben distinti:

Da 0 a 2°-4° mese: - tutti gli amminoacidi in crescita costante ed omogenea tra esterno ed interno- i peptidi presenti provengono essenzialmente dalla parte N-terminale dell’αS1 caseina e dalla parte C-terminale della β-caseina- Disomogeneità nel contenuto peptidico tra esterno ed interno- Prevalenza dell’azione enzimatica del caglio e dei batteri lattici

Da 2-4°mese al 10° mese: - alcuni amminoacidi non aumentano più (Arg, Tyr, Ala), altri accelerano la loro crescita (Glu, Ser, Ile), con una certa disomogeneità tra esterno ed interno- I peptidi precedentemente presenti cominciano a scomparire e compaiono nuovi peptidi (parte centrale dell’αS1 caseina,fosfopeptidi dalla β-caseina, γ-glutamilpeptidi)- Omogeneità del contenuto peptidico tra esterno ed interno della forma- Prevalenza di nuove azioni enzimatiche (plasmina,amminopeptidasi, γ-glutamiltranspeptidasi)

Dal 10°mese in poi: ………..

Progetto Regione Emilia-Romagna “Studio e modellazione ... · Microbiologia degli Alimenti –...

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