Corso di Biotecnologie Corso di Biotecnologie microbiche microbiche

Anno accademico 2005-2006Anno accademico 2005-2006Docenti Docenti (in ordine di apparizione): (in ordine di apparizione):

P. LandiniP. Landini applicazioni biotecnologiche in applicazioni biotecnologiche in batteri batteri

(produzione di proteine eterologhe, (produzione di proteine eterologhe, biosensori)biosensori)

C. Compagno*C. Compagno* applicazioni biotecnologiche in applicazioni biotecnologiche in lievitilieviti

S. DonadioS. Donadio biologia degli Streptomiceti e biologia degli Streptomiceti e produzione di antibioticiproduzione di antibiotici

* Docente responsabile del corso: * Docente responsabile del corso: concetta.compagno@unimi.itconcetta.compagno@unimi.it

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Anno accademico 2005-2006Anno accademico 2005-2006

Corso modulareCorso modulare (argomenti (argomenti diversi trattati nelle diverse parti diversi trattati nelle diverse parti del corso)del corso)

Scopo del corsoScopo del corso: fornire elementi : fornire elementi su strategie e processi su strategie e processi biotecnologici con diretti biotecnologici con diretti riferimenti ad applicazioni riferimenti ad applicazioni pratiche.pratiche.

Requisiti del corsoRequisiti del corso: buone : buone reminescenze di microbiologia, reminescenze di microbiologia, biochimica, biologia molecolare.biochimica, biologia molecolare.

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Anno accademico 2005-2006Anno accademico 2005-2006Materiale DidatticoMateriale Didattico::Testo di Microbiologia generale, parti Testo di Microbiologia generale, parti riguardanti ingegneria genetica, riguardanti ingegneria genetica, regolazione genica, crescita batterica, regolazione genica, crescita batterica, microbiologia industriale (Brock, Cap. 4, microbiologia industriale (Brock, Cap. 4, 7-8).7-8).Materiale didattico a cura dei docenti (es. Materiale didattico a cura dei docenti (es. articoli scientifici, link a siti internet)articoli scientifici, link a siti internet)Le mie presentazioni sono disponibili al Le mie presentazioni sono disponibili al sito:sito:

http://users.unimi.it/biofilms/http://users.unimi.it/biofilms/(( Didattica Didattica Biotecnologie Biotecnologie Microbiche)Microbiche)

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Anno accademico 2005-2006Anno accademico 2005-2006

Modalità d’esameModalità d’esame::

Prova scritta Prova scritta

Tre domande (una per ciascuna parte del Tre domande (una per ciascuna parte del corso)corso)

Due ore di tempoDue ore di tempo

Un esempio di esame verrà distribuito ed Un esempio di esame verrà distribuito ed eventualmente discusso con i docentieventualmente discusso con i docenti

P. Landini (P. Landini (paolo.landini@unimi.itpaolo.landini@unimi.it))Corso di Biotecnologie Corso di Biotecnologie

microbiche microbiche Anno accademico 2005-2006Anno accademico 2005-2006

Biotecnologie microbiche con applicazione Biotecnologie microbiche con applicazione industriale:industriale:

Produzione proteine eterologheProduzione proteine eterologhe

Produzione di molecole ad interesse Produzione di molecole ad interesse biotecnologico/industriale (bioconversione)biotecnologico/industriale (bioconversione)

Biotecnologie microbiche con applicazione Biotecnologie microbiche con applicazione ambientale:ambientale:

Biorisanamento ed Biorisanamento ed utilizzo di biosensoriutilizzo di biosensori

Periodo: 27/9-11/10 (il 5/10 non c’è lezione)Periodo: 27/9-11/10 (il 5/10 non c’è lezione)

Escherichia coliEscherichia coli, , Bacillus subtilisBacillus subtilis con con altri batteri appartenenti ai generi altri batteri appartenenti ai generi Pseudomonas, Rhizobium, Lactobacillus Pseudomonas, Rhizobium, Lactobacillus possono essere usati: possono essere usati:

- piani di risanamento ambientale piani di risanamento ambientale (bioremediation/biosensori)(bioremediation/biosensori)

- produzione di prodotti industriali: es. polidrossialcanoati produzione di prodotti industriali: es. polidrossialcanoati (plastiche biodegradabili), polisaccaridi (gomme ), cellulosa(plastiche biodegradabili), polisaccaridi (gomme ), cellulosa

- In agricoltura: pratiche di biocontrollo e preservazione In agricoltura: pratiche di biocontrollo e preservazione delle colture (Pseudomonas)delle colture (Pseudomonas)

- Biotecnologie alimentari, probiotici, “drug delivery”Biotecnologie alimentari, probiotici, “drug delivery”- produzione di proteine eterologhe (ricombinanti)produzione di proteine eterologhe (ricombinanti)

Applicazioni biotecnologie Applicazioni biotecnologie con microrganismi con microrganismi

procariotiprocarioti

Applicazioni biotecnologie con Applicazioni biotecnologie con batteri Gram-negativi: batteri Gram-negativi:

proteine eterologheproteine eterologhe Una delle speci batteriche Una delle speci batteriche

più “biotecnologica” è senza più “biotecnologica” è senza dubbiodubbio

Escherichia coliEscherichia coliOspite per l’espressione di Ospite per l’espressione di

proteine eterologhe sia proteine eterologhe sia procariotiche che procariotiche che

eucariotiche d’interesse eucariotiche d’interesse biotecnologicobiotecnologico

Qual è lo scopo Qual è lo scopo dell’espressione di proteine dell’espressione di proteine

eterologhe in eterologhe in E. coli?E. coli? Ottenere una certa quantità di un Ottenere una certa quantità di un

prodotto proteico d’interesse purificato: ad prodotto proteico d’interesse purificato: ad es. es. enzimi catalitici per industria e ricerca enzimi catalitici per industria e ricerca (es. lipasi, proteasi), agenti terapeutici (es (es. lipasi, proteasi), agenti terapeutici (es insulina), produzione di vacciniinsulina), produzione di vaccini

Utilizzare le cellule intere di Utilizzare le cellule intere di E. coliE. coli che che esprimono un certo enzima eterologo come esprimono un certo enzima eterologo come biocatalizzatori (biocatalizzatori (biotrasformazionibiotrasformazioni) al fine ) al fine di produrre molecole organiche di alto di produrre molecole organiche di alto valore aggiunto (valore aggiunto (Vitamina C, aspartameVitamina C, aspartame).).

Perché utilizzare Perché utilizzare Escherichia coli?Escherichia coli?

(o comunque (o comunque microrganismi?)microrganismi?) La produzione di proteine eterologhe La produzione di proteine eterologhe

(soprattutto per usi industriali) richiede (soprattutto per usi industriali) richiede processi che diano rese alte sia processi che diano rese alte sia quantitativamentequantitativamente che che qualitativamentequalitativamente (cioè (cioè proteina integra e biologicamente attiva)proteina integra e biologicamente attiva)

I microrganismi garantiscono il I microrganismi garantiscono il soddisfacimento di questi requisiti per: soddisfacimento di questi requisiti per: facilità di crescita, ottenimento di grandi facilità di crescita, ottenimento di grandi quantità di biomassa, facilità di quantità di biomassa, facilità di recupero/purificazione della proteina di recupero/purificazione della proteina di interesse.interesse.

Vantaggi economici ed “etici”.Vantaggi economici ed “etici”.

Come si arriva alla produzione di Come si arriva alla produzione di proteine di interesse (eterologhe) proteine di interesse (eterologhe)

nell’ospite (es. E. coli?)nell’ospite (es. E. coli?) Clonaggio del gene corrispondenteClonaggio del gene corrispondente

In modo che:In modo che:

Il gene venga espresso e la proteina Il gene venga espresso e la proteina prodotta in maniera riproducibile ed prodotta in maniera riproducibile ed affidabileaffidabile

La proteina sia stabile e biologicamente La proteina sia stabile e biologicamente attivaattiva

La proteina sia purificabile e (facilmente) La proteina sia purificabile e (facilmente) riestrabile dal bioreattoreriestrabile dal bioreattore

Escherichia coli:

-proteobacteria

Batterio enterico

Bastoncello Gram negativo

Mobilità flagellare

Escherichia coliEscherichia coli (TEM x 92,750(TEM x 92,750))

Escherichia coliEscherichia coli Batterio Gram-negativoBatterio Gram-negativo EnterobatterioEnterobatterio Bastoncello dimensioni 1 x Bastoncello dimensioni 1 x

3 3 mm Anaerobio facoltativoAnaerobio facoltativo Metabolismo sia Metabolismo sia

respiratorio (resp. aerobica respiratorio (resp. aerobica ed anaerobica) che ed anaerobica) che fermentativofermentativo

3m

Agitazione (O2) 3x109 cells/ml

Statico 3x108 cells/ml

tempo

Log

N

Capacità di crescere in terreni definiti (minimi) Elevata velocità di crescita (tempo di generazione 20-30 minuti in terreno ricco)

Escherichia coliEscherichia coli Molto studiato da un punto Molto studiato da un punto

di vista genetico, di vista genetico, fisiologico e strutturalefisiologico e strutturale

Genoma: cromosoma Genoma: cromosoma circolare interamente circolare interamente

sequenziatosequenziato Presenza di plasmidi stabiliPresenza di plasmidi stabili

3m

http://genolist.pasteur.fr/Colibri/

Plasmidi

MOLECOLE DI DNA CAPACI DI REPLICAZIONE AUTONOMA(DIMENSIONI ca. 103-104 kBp)

DNA CIRCOLARE CHIUSO, SUPERAVVOLTO

PRESENTI IN UN NUMERO DI COPIE DIPENDENTE DALLA LORO ORIGINE DI REPLICAZIONE (plasmidi generalmente usati per applicazioni

biotecnologiche: 50-250 copie/cellula)

GENI PER LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI (MARKER SELETTIVI)

bla= resist. ampicillina

ColE1= origine di replicazione

La regione di importanza “clou” La regione di importanza “clou” del vettore d’espressione: il del vettore d’espressione: il Multiple Cloning Site (MCS)Multiple Cloning Site (MCS)

Il gene codificante la proteina di interesse deve essere clonato (=inserito) nel vettore d’espressione a valle di un promotore specifico.

A questo scopo il vettore di espressione contiene un multiple cloning site, cioè una sequenza ricca in sequenze di riconoscimento di nucleasi di restrizione (siti di restrizione)

L’uso di enzimi di restrizione è alla base L’uso di enzimi di restrizione è alla base di gran parte delle tecnologie del DNA di gran parte delle tecnologie del DNA

ricombinantericombinante

Gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza specifica sul DNA e introducono un taglio a doppia elica in prossimità (Enzimi di classe I, classe III) o in corrispondenza (Enzimi di classe II) del sito di riconoscimento.

Sono disponibili un alto numero di Nucleasi di restrizione di classe II che riconoscono siti di legame diversi e tagliano il DNA con risultati diversi (estremità coesive 5’ o 3’) o taglio “blunt end”.

L’uso dei siti di restrizione nel MCS L’uso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di permette il clonaggio del frammento di

DNA (gene) di interesseDNA (gene) di interesse

Tre criteri fondamentali per la Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologheproduzione di proteine eterologhe

Espressione ad alto livello, affidabile e Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA)DNA/RNA)

La proteina prodotta deve mantenere la La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in propria attività biologica in E. coli E. coli (livello struttura/ conformazione della (livello struttura/ conformazione della proteina)proteina)

La proteina deve essere facilmente re-La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare isolata dal rimanente materiale cellulare

Cosa occorre per l’espressione Cosa occorre per l’espressione ad alto livello di una proteina ad alto livello di una proteina

nella cellula?nella cellula? Trascrizione/traduzione/stabilitàTrascrizione/traduzione/stabilità

Promotore forte (trascrizione)Promotore forte (trascrizione)

Presenza di segnali per il Presenza di segnali per il riconoscimento dell’mRNA da parte riconoscimento dell’mRNA da parte dei ribosomi (traduzione)dei ribosomi (traduzione)

Assenza di proteasi specifiche (stabilità)Assenza di proteasi specifiche (stabilità)

Il “Promotore perfetto” (?)Il “Promotore perfetto” (?)

AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattAAn

Riconosciuto dalla subunità Riconosciuti dalla subunità

4-6nt14nt

17nt4-6nt

+1-10Ext.-35UP element

+1

AAn....nAGGAGGnn..nnATG~ ORF (gene di interesse)-TAAnnnnn Term.

(Ribosome Binding Site/SD box (Shine-Dalgarno)

Terminatore di trascrizione

5-7 nt

Produzione di proteine Produzione di proteine eterologheeterologhe

Domanda:Domanda:

Un sistema “spinto al massimo”, cioè alto Un sistema “spinto al massimo”, cioè alto livello di trascrizione unito ad un alto livello di trascrizione unito ad un alto livello di traduzione è il meglio che si livello di traduzione è il meglio che si possa avere per la produzione di proteine possa avere per la produzione di proteine eterologhe?eterologhe?

Risposta: NORisposta: NO

Problemi di “tossicità” di proteine Problemi di “tossicità” di proteine eterologhe, e della loro conformazione eterologhe, e della loro conformazione correttacorretta

Tossicità di proteine Tossicità di proteine eterologhe nell’ospite eterologhe nell’ospite

Escherichia coliEscherichia coli Peso sul bilancio energetico della cellula Peso sul bilancio energetico della cellula

battericabatterica

Interazione “erronea” con componenti Interazione “erronea” con componenti cellulari:cellulari:

Legame al DNALegame al DNADanno al DNADanno al DNAStress ossidativoStress ossidativoInterazione/sequestro di altre proteine Interazione/sequestro di altre proteine

essenzialiessenziali

Induzione di sistemi di risposta allo stressInduzione di sistemi di risposta allo stress

Induzione di un promotore: Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicitàun modo di superare problemi di tossicità

InduzioneCrescita non inibita

Crescita rallentata

Crescita bloccata e/olisi cellulare

Pro

du

zion

e d

i pro

tein

a(u

nità

arb

itrarie

)

Induzione di un promotore: Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicitàun modo di superare problemi di tossicità

InduzioneCrescita non inibita

Crescita rallentata

Crescita bloccata e/olisi cellulare

Crescita di un ceppo che esprime una proteina tossica da un promotore costitutivo

Plac, il promotore inducibile „per eccellenza“

A B

(LacI)

(LacI)

(naturale: allolattosio; sintetico: IPTG)

Plac

LacI

IPTG

Ptac

Derivati di Plac* più forti

Ptrc

*) sostituzioni nella seq. -10 o promotori ibridi

Phage T7

Promotore dipendente da RNA polimerasi di batteriofago T7 (T7-RNA pol)

T7-RNA pol: singolo polipeptide estremamente efficiente (molto più dell’RNA polimerasi batterica)

Ara C

-Ara represses PBAD +Ara induces PBAD

RNA pol

PBAD

AraC

AraC

PBAD

EK=Sito di proteasi

Xpress epitope= riconoscimento con anticorpi specifici

L’uso dei siti di restrizione nel MCS L’uso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di permette il clonaggio del frammento di

DNA (gene) di interesseDNA (gene) di interesse

Ma troviamo Ma troviamo sempresempre siti di restrizione adatti in prossimità del gene da clonare?siti di restrizione adatti in prossimità del gene da clonare?

Il gene di interesse viene generalmente amplificato per PCR (polymerase chain

reaction)

1

2

3

1

Ibridazione con sonde specifiche per l’amplificazione del gene bersaglio

DNA-sintesi (15-20 nt)

Ai primers può essere aggiunta una “coda” non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR

Aggiunta di siti di restrizione ai Primers:

GGATCCAAGCTT

GGATCC

AAGCTT

GGATCC

AAGCTT

(BamHI)(HindIII)

AAGCTT

GGATCC

Ai primers può essere aggiunta una “coda” non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR

Aggiunta di siti di restrizione ai Primers:

GGATCCAAGCTT

GGATCC

AAGCTT

AAGCTT

GGATCC

GGATCC

AAGCTT

(BamHI)(HindIII)

GGATCC GGATCC

GGATCC

AAGCTT

AAGCTTAAGCTT

Tre criteri fondamentali per la Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologheproduzione di proteine eterologhe

Espressione ad alto livello, affidabile e Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA)DNA/RNA)

La proteina prodotta deve mantenere la La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in propria attività biologica in E. coli E. coli (livello struttura/ conformazione della (livello struttura/ conformazione della proteina)proteina)

La proteina deve essere facilmente re-La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare isolata dal rimanente materiale cellulare