TRASFORMAZIONI TRASFORMAZIONI BIOTECNOLOGICHEBIOTECNOLOGICHE

Progetto lauree scientifiche

CLASSI 5A & 5B CHIMICA

Anno scolastico 2006/07

Le tecniche biotecnologiche permettono di trasformare substrati organici, generalmente economici, in altre molecole evitando complesse e costose sintesi per via chimica.

Queste tecniche hanno numerosi vantaggi:

1. Utilizzo di substrati economici

2. Minor utilizzo di energia

3. Produzione di sostanze di scarto compatibili con l’ambiente

MICRORGANISMI UTILIZZATI

Nelle trasformazioni biotecnolgiche si utilizzano microrganismi opportunamente scelti e\o geneticamente modificati (inoculo).

I prodotti di biosintesi sono principalmente i metaboliti primari o secondari della fermentazione o della respirazione del microrganismo.

L’inoculo è l’insieme dei microrganismi selezionati necessari alla reazione volti alla riproduzione “su vasta scala” del ceppo microbico.

MetabolitiMetabolitisostanze che prendono parte alle reazioni sostanze che prendono parte alle reazioni chimiche che avvengono nell'organismo oppure chimiche che avvengono nell'organismo oppure che derivano da esse, si dividono in:che derivano da esse, si dividono in: Primari :Primari : sono prodotti e trattenuti sono prodotti e trattenuti

all’interno dell’organismo vivente che li all’interno dell’organismo vivente che li produce,sono espressi in continuo. produce,sono espressi in continuo.

SecondariSecondari: sono prodotti (sostanze : sono prodotti (sostanze chimiche) del metabolismo che non sono chimiche) del metabolismo che non sono essenziali per la semplice crescita, sviluppo o essenziali per la semplice crescita, sviluppo o riproduzione;riproduzione;

FERMENTAZIONEFERMENTAZIONE Il termine fermentazione indica l'ottenimento Il termine fermentazione indica l'ottenimento

di un composto come prodotto di di un composto come prodotto di trasformazione di una sostanza di partenza trasformazione di una sostanza di partenza (substrato) ad opera di un opportuno (substrato) ad opera di un opportuno microrganismo. La microrganismo. La fermentazionefermentazione è un è un processo ossidativo anaerobico svolto da processo ossidativo anaerobico svolto da organismi a carico di molecole organiche per organismi a carico di molecole organiche per la produzione di energia.la produzione di energia.

Nella fermentazione l’accettore finale di Nella fermentazione l’accettore finale di elettroni è una sostanza organica che si elettroni è una sostanza organica che si riduce.riduce.

RESPIRAZIONERESPIRAZIONE

La respirazione cellulare è un processo La respirazione cellulare è un processo ossidativo aerobico che permette di ricavare ossidativo aerobico che permette di ricavare molecole energetiche come ATP a partire da molecole energetiche come ATP a partire da carboidrati, lipidi o altri metaboliti. Quando carboidrati, lipidi o altri metaboliti. Quando l’accettore finale di elettroni è l’ossigeno si l’accettore finale di elettroni è l’ossigeno si ottengono Hottengono H22O e COO e CO22 come prodotti finali. come prodotti finali.

BIOTRASFORMAZIONE

La biotrasformazione è una trasformazione di una sostanza in un’altra tramite microrganismi sfruttando le loro capacità enzimatiche

Vantaggi:

• Alternativa alla tecnologia chimica

• Riduzione dell’inquinamento

Svantaggi:

• Tempi di lavoro lunghi

• Richiede totale sterilità

• Richiede una buona manualità

Obbiettivi:

• Produzione di energia

• Disinquinamento

• Giungere a microrganismi geneticamente modificati

IL TERRENO IL TERRENO DI COLTURADI COLTURA

È una fonte di nutrimento da cui il È una fonte di nutrimento da cui il microrganismo può trarre energia e microrganismo può trarre energia e nutrimento.nutrimento.

Vengono riprodotte le stesse condizioni Vengono riprodotte le stesse condizioni nutrizionali e chimico - fisiche dell’ambiente di nutrizionali e chimico - fisiche dell’ambiente di provenienza del microrganismo preso in provenienza del microrganismo preso in considerazioneconsiderazione

IL TERRENO DI COLTURA

Questa tecnica ci permette di allevare i microrganismi in laboratorio e di realizzare l’isolamento di ceppi puri.

Non esiste un terreno colturale adatto a tutti i microrganismi.

TIPI DI TERRENO

Terreni naturali o empirici: Ricchi di principi nutritivi

Terreni semisintetici: Costituiti in parte da composti chimici e in parte da sostanze naturali

Terreni sintetici: A differenza del terreno sopra elencato la composizione è interamente nota

Terreni liquidi: Si utilizzano per far crescere abbondantemente una colonia.

Terreni solidificati: Per isolare i microrganismi fino ad averli puri

TIPI DI TIPI DI SEMINASEMINA

Premessa: in laboratorio si eseguono studi quantitativi e qualitativi sui microrganismi e occorre che essi siano in coltura pura, cioè che il ceppo da esaminare sia esente da altri microrganismi.

Una coltura pura si può ottenere separando i vari microrganismi presenti in uno stesso terreno iniziale mediante tecniche dette di isolamento.

Le semine si possono eseguire: In massa, in un terreno liquido.

Per strisciamento Sulla superficie di un Su piastra Petri

terreno solidificato. Per spatolamento

Su slant Per strisciamento

In un terreno solidificabile per inclusione In massa

In un terreno solidificato per infissione

• Tutte le tecniche sopra elencate devono essere eseguite in spazio sterile.

TIPI DI SEMINA

COMPOSIZIONE TERRENO COMPOSIZIONE TERRENO PER LA PER LA

BIOTRASFORMAZIONEBIOTRASFORMAZIONE Terreno liquidoTerreno liquido: : n°. 5 beute (per prove di screening) da 100 n°. 5 beute (per prove di screening) da 100

ml con 20 ml di terreno ml con 20 ml di terreno COMPOSIZIONE: 5 g/L di TryptoneCOMPOSIZIONE: 5 g/L di Tryptone 2,5 g/L di Ey2,5 g/L di Ey 1 g/L di Glucosio1 g/L di Glucosio Terreno solidoTerreno solido: : n°.10 slant con 8 ml di terreno liquido n°.10 slant con 8 ml di terreno liquido

ciascunociascuno COMPOSIZIONE: 5 g/L di TryptoneCOMPOSIZIONE: 5 g/L di Tryptone 0,5 g/L di Ey0,5 g/L di Ey 20 g/L di Agar20 g/L di Agar 1 g/L di Glucosio1 g/L di Glucosio

COMPOSIZIONE:

LO SLANTLO SLANT

Chiamati anche tubi a becco di clarino: sono Chiamati anche tubi a becco di clarino: sono provette dove viene solidificato in posizione provette dove viene solidificato in posizione obliqua un terreno liquido(con l’aggiunta di Agar)obliqua un terreno liquido(con l’aggiunta di Agar)

Con questo tipo di preparazione si osserva Con questo tipo di preparazione si osserva meglio il microrganismo e le sue fasi di meglio il microrganismo e le sue fasi di crescita,inoltre si presta meglio alla semina con crescita,inoltre si presta meglio alla semina con ansa e con ago e alla crescita di microrganismi ansa e con ago e alla crescita di microrganismi aerobi.aerobi.

STERILIZZAZIONE STERILIZZAZIONE E DISINFEZIONEE DISINFEZIONE

Mezzi chimici: Disinfezione : Uso di sostanze detergenti che però non garantiscono sempre anche l’eliminazione delle spore

Mezzi fisici: Sterilizzazione Secco (stufa)Umido (autoclave)

In laboratorio sono usati: - Calore

- Radiazione - Impiego del freddo - Essicamento - Filtrazione

Chiusa: quando devo garantire l’eliminazione di organismi che resistono ad alte temperature

Gli enantiomeri sono stereoisomeri che presentano la Gli enantiomeri sono stereoisomeri che presentano la stessa formula bruta, la stessa formula di struttura, ma stessa formula bruta, la stessa formula di struttura, ma diverso orientamento degli atomi nello spazio.diverso orientamento degli atomi nello spazio.

Presentano attività ottica: una sostanza è otticamente Presentano attività ottica: una sostanza è otticamente attiva quando, attraversata da un fascio di luce attiva quando, attraversata da un fascio di luce polarizzata, ruota il piano di polarizzazione stesso. polarizzata, ruota il piano di polarizzazione stesso. Due enantiomeri ruotano il piano della luce polarizzata Due enantiomeri ruotano il piano della luce polarizzata di uno stesso angolo ma di senso opposto.di uno stesso angolo ma di senso opposto.

Due enantiomeri sono l’uno l’immagine speculare Due enantiomeri sono l’uno l’immagine speculare dell’altro ma non sono sovrapponibili (chirali).dell’altro ma non sono sovrapponibili (chirali).

DUE ENANTIOMERI DUE ENANTIOMERI HANNO:HANNO:

I.I. Stesse proprietà fisiche ad eccezione della attività Stesse proprietà fisiche ad eccezione della attività ottica, stesse proprietà chimiche ad eccezione della ottica, stesse proprietà chimiche ad eccezione della reattività nei confronti di substrati chirali.reattività nei confronti di substrati chirali.

II.II. I recettori biologici hanno delle strutture spaziali I recettori biologici hanno delle strutture spaziali specifiche.specifiche.

III.III. Per manifestare attività una molecola chirale deve Per manifestare attività una molecola chirale deve combaciare con un recettore chirale altrimenti non combaciare con un recettore chirale altrimenti non avviene alcuna interazioneavviene alcuna interazione. .

In questa esperienza per separare i due enantiomeri del feniletanolo si è ricorso ad una biotrasformazione con un microrganismo ( bacillus stearothermophilus)

Questo batterio, utilizzando sistemi enzimatici chirali, bioconverte solo uno dei due enantiomeri del feniletanolo in acetofenone (chetone).

Per separare acetofenone e (R)-1-feniletanolo abbiamo utilizzato la gascromatografia su fasi chirali.

COME SI SEPARANO

CH3

OH

CH3

O

+OH

CH3

R/S

Bacillus

stearothermophilus

R

₪ Questa tecnica analitica ha lo scopo di separare i componenti della miscela sfruttando la diversa interazione dei vari componenti con un materiale fermo (fase stazionaria) e un materiale mobile (fase mobile).

₪ La fase mobile è un fluido inerte sia nei confronti della fase stazionaria che dei componenti della miscela che deve solubilizzare i componenti della miscela e trascinarli in una colonna in cui è posta la fase stazionaria.

₪ All’interno della colonna i componenti della miscela interagiscono diversamente con la fase stazionaria e la fase mobile e conseguentemente escono dalla colonna con tempi diversi.

CROMATOGRAFIA

Le sostanze da separare che hanno maggiore affinità per la fase stazionaria vengono maggiormente trattenute e escono dalla colonna più tardi.

Il contrario invece avviene per quelle sostanze che manifestano una maggiore affinità per la fase mobile.

CROMATOGRAFIA

La gascromatografia è una particolare La gascromatografia è una particolare tecnica cromatografica, che ha lo scopo di tecnica cromatografica, che ha lo scopo di separare più componenti di una miscela, separare più componenti di una miscela, sfruttando la loro diversa affinità per una sfruttando la loro diversa affinità per una fase stazionaria ( fS ) contenuta in una fase stazionaria ( fS ) contenuta in una colonna e con cui le sostanze interagiscono colonna e con cui le sostanze interagiscono trasportate da una fase mobile gassosa.trasportate da una fase mobile gassosa.

GASCROMATOGRAFIAGASCROMATOGRAFIA

GASCROMATOGRAFIAGASCROMATOGRAFIA La La fase mobile è un gas fase mobile è un gas che deve avere:che deve avere:

Elevato grado di purezza;Elevato grado di purezza; Inerzia chimica nei confronti della fS e verso Inerzia chimica nei confronti della fS e verso

i componenti della miscela;i componenti della miscela; Possibilmente una elevata densità (o PM) Possibilmente una elevata densità (o PM)

per minimizzare il fenomeno della diffusione per minimizzare il fenomeno della diffusione molecolare longitudinale che provoca molecolare longitudinale che provoca allargamento dei picchi e quindi una allargamento dei picchi e quindi una diminuzione dell’efficienza;diminuzione dell’efficienza;

Compatibilità con il rivelatore;Compatibilità con il rivelatore; Basso costo.Basso costo.

La La fase stazionariafase stazionaria può essere: può essere: Solida ( GSC )Solida ( GSC ) Liquida supportata da materiale solido ( GLC Liquida supportata da materiale solido ( GLC

))

Colonna impaccataColonna impaccata : - diametro interno 0.75 : - diametro interno 0.75 ÷ 4 mm÷ 4 mm

- lunghezza fino a 10 m- lunghezza fino a 10 m

- la fs occupa tutto il volume - la fs occupa tutto il volume interno interno della colonna della colonna

- possono essere di acciaio o - possono essere di acciaio o vetro.vetro.

Colonna capillareColonna capillare: - diametro interno 0.1 ÷0.75 mm: - diametro interno 0.1 ÷0.75 mm

- lunghezza da 15 ÷ 100 m- lunghezza da 15 ÷ 100 m

- in silice rivestite da materiale - in silice rivestite da materiale plastico plastico di protezione di protezione

- la fs riveste solo la parete interna.- la fs riveste solo la parete interna.

LE COLONNE PER GASCROMATOGRAFIA LE COLONNE PER GASCROMATOGRAFIA POSSONO ESSERE DI DUE TIPI:POSSONO ESSERE DI DUE TIPI:

SCHEMA DI UNSCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFOGASCROMATOGRAFO

Nel nostro caso la miscela conteneva sostanze Nel nostro caso la miscela conteneva sostanze otticamente attive e perciò si è utilizzata la otticamente attive e perciò si è utilizzata la cromatografia su fasi chirali, che prevede la cromatografia su fasi chirali, che prevede la formazione di diasteroisomeri mediante l’interazione formazione di diasteroisomeri mediante l’interazione dinamica reversibile delle specie da separare con dinamica reversibile delle specie da separare con uno specifico “mezzo chirale”, rappresentato in uno specifico “mezzo chirale”, rappresentato in genere dalla fS della colonna utilizzata.genere dalla fS della colonna utilizzata.

I diasteroisomeri formatisi hanno tempi di ritenzione I diasteroisomeri formatisi hanno tempi di ritenzione diversi.diversi.

CROMATOGRAFIA SU CROMATOGRAFIA SU FASI CHIRALIFASI CHIRALI

Cromatogramma dei due Cromatogramma dei due enantiomerienantiomeri

Cromatogramma ottenuto Cromatogramma ottenuto dopo l’azione del dopo l’azione del microrganismo:microrganismo:

CONCLUSIONE

Seppure il terreno di coltura sia stato realizzato attenendoci alle metodiche operative, non riproduce le stesse condizioni nutrizionali e chimico - fisiche dell’ambiente di provenienza del nostro microrganismo, perciò si è verificato un piccolo accrescimento nel terreno liquido e quasi assente in quello solido.

In base all’esperienza acquisita nei laboratori universitari l’enantiomero L viene completamente biotrasformato dal bacillo. Nel cromatogramma ottenuto al termine della nostra esperienza, sono visibili 3 picchi di cui il primo corrispondente al chetone e gli altri corrispondenti ai due enantiomeri. Possiamo concludere che la parziale biotrasformazione sia dipesa da una modificazione genetica del microrganismo o da altri fattori accidentali non facilmente identificabili.